長鏈非編碼RNA SNHG1對人口腔鱗狀細胞癌細胞N-cadherin、MMP-9表達的影響

徐 清,張姝迪,強詩雨,邢運鑫,馬一凡,阮曉旭,周靜萍,鄧 超,2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.口腔醫(yī)學(xué)院;2.重大疾病非編碼RNA轉(zhuǎn)化研究安徽普通高校重點實驗室,安徽 蕪湖 241002)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)簡稱OSCC,是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一。在過去20年里OSCC的5年病死率高達35%[1],深入研究OSCC發(fā)生和發(fā)展相關(guān)基因,對于檢測OSCC侵襲轉(zhuǎn)移以及評估臨床預(yù)后非常重要。最近研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在基因轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性、表觀遺傳改變、蛋白質(zhì)性能及關(guān)系等方面均起著關(guān)鍵作用[2-3],與腫瘤的發(fā)生發(fā)展亦密切相關(guān)[4-5]。lncRNA SNHG1又名linc00057,研究發(fā)現(xiàn)其可通過不同的信號通路和分子機制促進或抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6],但尚未發(fā)現(xiàn)其在OSCC中的作用。本研究采用實時定量PCR檢測OSCC組織以及細胞系中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達情況,通過慢病毒轉(zhuǎn)染改變其表達,觀察lncRNA SNHG1對OSCC細胞N-cadherin、MMP-9表達的影響,探究其在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 2020年10月～2021年7月在弋磯山醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除且術(shù)后病理確診的20例OSCC患者,術(shù)前均未接受放化療,男13例,女7例,年齡43～81(62.4±10.3)歲。均于術(shù)中留取距原發(fā)灶邊緣5 cm處的癌旁組織為對照組。納入標準:①所有OSCC患者均未接受術(shù)前放療、化療等治療;②所有患者均經(jīng)術(shù)前病理檢查診斷為OSCC;③臨床資料完整。

1.1.2 實驗試劑 胎牛血清(上海雙洳生物科技有限公司);Western及IP細胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Defined K-SFM、DMEM、胰蛋白酶(美國賽默飛世爾科技公司);熒光定量檢測試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司];CCK-8(合肥睿捷生物科技有限公司);兔抗人N-cadherin、Vimentin、MMP-9多克隆抗體、山羊抗鼠IgG(H+L)(武漢愛博泰克生物科技有限公司);lncRNA SNHG1慢病毒載體、polybrene[和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測OSCC細胞中SNHG1、N-cadherin、MMP-9、vimentin基因表達情況 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CAL27、HN6、SCC25OSCC細胞,HOK細胞則接種于含生長因子的Defined K-SFM培養(yǎng)基,細胞均置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當培養(yǎng)瓶底部融合率達到90%時,qRT-PCR檢測各細胞系中長鏈非編碼RNA SNHG1的相對表達量。PCR擴增條件:95℃ 15 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,95℃ 15 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計算lncRNA SNHG1的相對表達量,引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組 收集對數(shù)增殖階段的CAL27細胞,接種到24孔板(1×105/孔,500 μL/孔),當?shù)?天細胞融合率達到30%時,分別加入polybrene為5 μg/mL,感染復(fù)數(shù)(MOI)為20的lncRNA SNHG1慢病毒空轉(zhuǎn)載體(LV-CN組)和lncRNA SNHG1慢病毒過表達載體(LV-SNHG1組),病毒感染12 h后更換為正常的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在病毒感染細胞后96 h,更換為含有相應(yīng)最佳濃度(1 μg/mL)的嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基10 d后,在嘌呤霉素濃度減半(0.5 μg/mL)的完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細胞。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖 收集嘌呤霉素篩選10 d后各組對數(shù)生長期CAL27,0.25%胰蛋白酶消化,制備單細胞懸液,接種至96孔板(2 000個/孔,100 μL/孔),設(shè)置3個時間梯度,每組設(shè)置6個復(fù)孔,在細胞貼壁后(約4 h)的0、24、48、96 h時,分別在避光條件下每孔加入10 μL CCK-8溶液,盡量避免打出氣泡,然后放入細胞培養(yǎng)箱中孵育,3 h后檢測各孔吸光度(OD450 nm),繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移 收集轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素已篩選10 d且各組處于對數(shù)生長期CAL27細胞,接種至6孔板(1×106/孔,2 mL/孔),當?shù)?天細胞在孔中融合率達90%后,用1 mL的無菌藍槍頭沿著直尺垂直于6孔板豎向劃線,用PBS輕輕沖洗6孔板,重復(fù)沖洗2次后換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基,此時在顯微鏡下觀察并拍照,作為0 h的圖片,此后分別于劃痕后6、12、24 h鏡下觀察并拍照,lmage J軟件分析細胞劃痕面積。

1.2.5 Western blot檢測N-cadherin、MMP-9蛋白的表達 收集轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素已篩選10 d的CAL27細胞,加入細胞裂解液于冰上裂解30 min,12 000 g離心5 min取上清,此即為細胞總蛋白,隨后根據(jù)BCA試劑盒的使用方法檢測各組細胞蛋白質(zhì)濃度并進行定量,加入2×的loading buffer后,于100℃高溫煮沸使蛋白變性。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、TBST清洗、封閉、孵育,顯影后采用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照及應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值,最后分析出各蛋白的相對含量進行比較。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達 OSCC組織lncRNA SNHG1的表達水平(0.621±0.255)低于癌旁組織(1.053±0.196),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t配對=8.027,P<0.001)。

2.2 lncRNA SNHG1在OSCC細胞系中的表達 各OSCC細胞系相對于HOK細胞的表達量如圖1所示,CAL27、HN6相對于HOK細胞lncRNA SNHG1的表達含量降低(P<0.001),SCC25相對于HOK細胞lncRNA SNHG1的表達含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因lncRNA SNHG1在CAL27細胞中的表達水平相對較低,故選用CAL27細胞進行后續(xù)研究。

n=3,F=85.95,P<0.001;***P<0.001。圖1 lncRNA SNHG1 mRNA在OSCC細胞系中的表達

2.3 過表達lncRNA SNHG1對OSCC細胞增殖的影響 CAL27細胞過表達SNHG1后lncRNA SNHG1的相對表達含量如圖2A所示,與LV-CN相比,LV-SNHG1組lncRNA SNHG1相對含量升高(t=58.850,P<0.001)。CCK-8實驗結(jié)果如圖2B所示,轉(zhuǎn)染24、48、96 h后,LV-SNHG1組細胞的吸光度值低于LV-CN組(t24 h=15.530,t48 h=12.760,t96 h=13.830,均P<0.001),表明lncRNA SNHG1的過表達能明顯抑制OSCC細胞的增殖能力。

A.過表達SNHG1后CAL27細胞中l(wèi)ncRNA SNHG1 mRNA表達水平,n=3,***P<0.001;B.過表達SNHG1后CAL27細胞增殖水平變化,n=4,***P<0.001。圖2 過表達IncRNA SNHG1對OSCC細胞增殖的影響

2.4 過表達lncRNA SNHG1對OSCC細胞遷移的影響 細胞劃痕后6、12、24 h實驗結(jié)果如圖3、4所示,劃痕后6、12 h的LV-SNHG1組細胞愈合率較同時期的LV-CN組略低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t6 h=1.142,t12 h=1.315,P>0.05),劃痕后24 h LV-SNHG1組的細胞愈合率低于同時期的LV-CN組(t24 h=19.520,P24 h<0.001),表明過表達SNHG1能抑制OSCC細胞的遷移能力。

n=3,***P<0.001。圖3 過表達SNHG1后不同時間細胞劃痕的愈合情況分析

圖4 過表達SNHG1后兩組不同時間劃痕面積的對比

2.5 過表達lncRNA SNHG1對OSCC細胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白與基因表達的影響 相比于LV-CN組,LV-SNHG1組的N-cadherin、MMP-9的表達降低(t=2.682、4.399,P<0.05)。且N-cadherin、Vimentin、MMP-9的表達降低(t=16.730、6.656、4.939,P<0.01),見圖5、6,表明過表達SNHG1能抑制OSCC細胞的遷移、侵襲。

n=3,*P<0.05;**P<0.01。圖5 過表達SNHG1后N-cadherin、MMP-9的蛋白表達水平

n=3,**P<0.01。圖6 過表達SNHG1后N-cadherin、Vimentin、MMP-9的基因表達水平

3 討論

lncRNA是RNA的成員之一,被證明參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、細胞增殖和遷移[7-8]。與正常組織相比,lncRNA在很多不同的癌癥組織中呈差異性表達[9],并可調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達[10]。在OSCC研究中發(fā)現(xiàn)了lncRNA的異常表達。lncRNA PCBP1-AS和lncRNA MEG3在OSCC細胞系中低表達[11-12];通過上調(diào)lncRNA PCBP1-AS、lncRNA MEG3分別激活JAK2/STAT3信號通路、p53通路可抑制OSCC細胞增殖和侵襲,促進細胞凋亡[13]。因此從lncRNA角度分析OSCC的發(fā)病機制對早期診斷OSCC及評估病人的預(yù)后均具有重要意義。

為探究lncRNA SNHG1在OSCC中的具體作用機制與影響,本實驗通過qRT-PCR實驗分別檢測了lncRNA SNHG1在OSCC組織和在OSCC細胞系的表達。結(jié)果顯示lncRNA SNHG1在OSCC組織和細胞系的表達均明顯低于正常對照組,提示上調(diào)lncRNA SNHG1的表達水平可能會影響OSCC細胞的生物學(xué)性狀。本實驗通過上調(diào)lncRNA SNHG1探究其對OSCC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控和遷移侵襲相關(guān)蛋白及基因的表達變化。實驗結(jié)果表明,上調(diào)lncRNA SNHG1明顯抑制了OSCC細胞CAL27的增殖、遷移、侵襲能力。Western blot實驗結(jié)果顯示,上調(diào)lncRNA SNHG1后N-cadherin、MMP-9蛋白含量的表達明顯降低;qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,過表達lncRNA SNHG1后N-cadherin、Vimentin、MMP-9基因的表達明顯降低,表明過表達SNHG1能明顯抑制OSCC細胞的遷移、侵襲。

綜上所述,本研究認為上調(diào)lncRNA SNHG1能明顯抑制OSCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在接下來的工作中,課題組還需要分析其在體內(nèi)模型中對腫瘤生長的抑制作用。lncRNA SNHG1的潛在靶基因和信號通路亦有待進一步探索,為lncRNA SNHG1早期作為臨床腫瘤治療的分子靶點應(yīng)用提供額外的實驗依據(jù)。同時我們前期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1在順鉑耐藥的OSCC細胞中高表達,未來,我們將進一步研究患者血清中SNHG1的表達以及l(fā)ncRNA SNHG1對順鉑耐藥的OSCC細胞的細胞功能影響,確保OSCC患者的治療過程能夠得到更快、更有效的治療選擇。SNHG1可作為OSCC的診斷性生物標志物,并有望成為治療選擇的生物標志物。