王雨 裴行杰 傅釔鈞 霍愷森 梁重鈞 劉麗巖 王佳 鈕俊

摘 要：華石斛是海南島特有的熱帶蘭科植物，具有很高的觀賞和藥用價(jià)值。然而，未確定的內(nèi)參基因限制了該物種基因表達(dá)分析。本研究利用之前華石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出164 個(gè)變異系數(shù)低（CV≤0.2）和表達(dá)量中等（TPM 在10～300之間）的候選內(nèi)參基因。為了避免共表達(dá)現(xiàn)象對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的影響，根據(jù)GO 功能聚類分析結(jié)果，從不同的功能群中共篩選出24 個(gè)候選基因。為避免模板中可能殘留的基因組DNA 在RT-qPCR 擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生假陽(yáng)性，本研究設(shè)計(jì)了跨越內(nèi)含子引物，并通過(guò)電泳篩選出符合要求的15 個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物。為了確保RT-qPCR 擴(kuò)增的特異性，使用LightCycler 96 進(jìn)行熔解曲線分析。依據(jù)15 個(gè)候選基因的RT-qPCR 數(shù)據(jù)，同時(shí)綜合多個(gè)算法分析，在干旱脅迫下，不同軟件分別確定CLP1 & SEC23、SEC23 & CPY71、CLP1 & SEC23 和RNG1L & PECT 為最佳內(nèi)參基因，綜合排序后選取SEC23 和CLP1 為華石斛干旱脅迫下最穩(wěn)定內(nèi)參基因。在華石斛不同組織中，不同軟件分別確定了ADF11& IBR5、PRP19 & CLP1、ADF11 & CLP1、ACBP2 & IBR5 為最佳內(nèi)參基因，綜合分析后確定ADF11 和ACBP2 為不同組織中最穩(wěn)定內(nèi)參基因。結(jié)合上述干旱脅迫和不同組織分析數(shù)據(jù)，最終確定IBR5 和CPY71 為綜合條件下較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。內(nèi)參基因驗(yàn)證表明，與傳統(tǒng)的Actin 內(nèi)參相比，本研究篩選出的內(nèi)參基因可獲得更為精確的RT-qPCR 校準(zhǔn)結(jié)果，表明所篩選的內(nèi)參基因具有極高的穩(wěn)定性。綜上所述，本研究為利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定穩(wěn)定內(nèi)參基因提供思路，首次在華石斛全基因組范圍內(nèi)鑒定穩(wěn)定內(nèi)參基因，為進(jìn)一步研究基因表達(dá)和功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：華石斛；內(nèi)參基因；轉(zhuǎn)錄組；穩(wěn)定性分析

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

華石斛（Dendrobium sinense）是海南島特有的蘭科植物，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

前期的活性成分分析表明，從華石斛中可以分離到菲類、雙芐基類、黃酮類和木脂素類等化合物[1-5]。

聯(lián)芐是石斛屬植物的主要酚類成分之一，具有抗腫瘤、抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)等作用[6]。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，華石斛公布的基因數(shù)量也迅速增加[4]。對(duì)探索華石斛花葉發(fā)育、脅迫響應(yīng)和生物活性物質(zhì)合成途徑有關(guān)的功能基因和轉(zhuǎn)錄因子研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。然而，華石斛穩(wěn)定內(nèi)參基因尚未鑒定，這不可避免地會(huì)限制對(duì)華石斛基因表達(dá)及其功能的探究。

基因表達(dá)分析是生物學(xué)研究中重要且常用的方法，研究基因表達(dá)有助于了解基因的功能[7]。

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）已經(jīng)成為目前主流方法，其具有靈敏度高、重復(fù)性好、高通量、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)[8]。然而，RT-qPCR 產(chǎn)生的相對(duì)表達(dá)量受許多客觀因素的影響，如RNA 的數(shù)量、質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率等[9]。RT-qPCR 相對(duì)定量時(shí)需要穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)閰⒖迹瑥亩拍塬@得更準(zhǔn)確可靠的表達(dá)結(jié)果[10]。

目前，管家基因被廣泛地用作內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR 的定量分析[11]。管家基因在不同組織、細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)處理中的表達(dá)水平理論上應(yīng)該是穩(wěn)定的[11-12]，但是許多研究表明，管家基因在不同的實(shí)驗(yàn)條件下仍會(huì)存在較大的表達(dá)波動(dòng)[13-14]。在不同的物種中，管家基因的穩(wěn)定性必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的驗(yàn)證才能作為內(nèi)參基因進(jìn)行使用[15]。

隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量RNA 測(cè)序（RNA-seq）已成為非模式物種基因挖掘及功能分析的有力工具。目前，第二代測(cè)序（NGS）和單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）是RNA-seq 最常用的測(cè)序技術(shù)。2 種RNA-seq 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及差異表達(dá)基因識(shí)別[4， 16]。通過(guò)高通量數(shù)據(jù)分析，那些在各種組織類型或條件下表現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)水平的基因，可能是潛在的優(yōu)良內(nèi)參基因[9， 17]。

基于前期的華石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[4]，本研究通過(guò)表達(dá)矩陣的歸一化處理的TPM（transcripts perkilobase of exon model per million mapped reads）算法，計(jì)算華石斛文庫(kù)各個(gè)基因的數(shù)字表達(dá)水平，從中篩選基因表達(dá)水平較穩(wěn)定的潛在候選基因。

通過(guò)基因GO 聚類分析，從不同的功能聚類中分別候選內(nèi)參基因。同時(shí)，設(shè)計(jì)所篩選內(nèi)參基因的跨內(nèi)含子引物，利用凝膠成像技術(shù)篩選符合條件的內(nèi)參引物。根據(jù)RT-qPCR 數(shù)據(jù)，利用ΔCt、BestKeeper、NormFinder 和geNorm 四種不同算法軟件，評(píng)估候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性并從中確定最佳內(nèi)參基因。本研究旨在確定華石斛的最佳內(nèi)參基因，為進(jìn)一步研究基因表達(dá)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生華石斛采自海南省昌江霸王嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。華石斛在25 ℃、相對(duì)濕度≥95%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 d。依據(jù)之前的干旱脅迫方法處理植物材料[4]，隨后收集華石斛根，假鱗莖和葉組織，經(jīng)液氮速凍并–80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)和表達(dá)分析 從NCBI Short ReadArchive 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，華石斛葉片轉(zhuǎn)錄組SRR15112264、SRR15112265、SRR15112266，假鱗莖轉(zhuǎn)錄組SRR15112267、SRR15112268、SRR15112269，根轉(zhuǎn)錄組SRR15112270、SRR1511

2271、SRR15112272。另外SRR14306704、SRR14306705 和SRR14306706 是極度干旱脅迫的華石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（DSC，相對(duì)濕度<5%），SRR14306707、SRR14306708 和SRR14306709 為一般干旱脅迫的華石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（DSB，45%≤相對(duì)濕度≤ 50% ） SRR14306710 ， SRR14306711 和SRR14306712 代表未經(jīng)干旱脅迫的華石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（DSA，相對(duì)濕度≥95%）。根據(jù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)[4]，用TBtools 軟件通過(guò)TPM 算法計(jì)算基因表達(dá)量[18]。

1.2.2 基因篩選與基因聚類 根據(jù)RNA-seq 數(shù)據(jù)的TPM 結(jié)果，如果滿足變異系數(shù)（CV）≤0.2，TPM 水平在10～300 之間，那么就被當(dāng)作候選基因。為了避免基因共表達(dá)可能會(huì)影響內(nèi)參穩(wěn)定性分析結(jié)果，使用Blast2GO 軟件對(duì)篩選出的候選內(nèi)參基因進(jìn)行GO 功能聚類分析[19]。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 華石斛基因組DNA（gDNA）的提取采用植物基因組DNA 提取試劑盒（天根，北京，中國(guó)）。總RNA 的提取采用RNA 純化試劑盒（天根，北京，中國(guó)）。Micro-Drop（BIO-DL，上海，中國(guó)）檢測(cè)RNA 純度和濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Monad，蘇州，中國(guó)）進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄，RNA 用量2 μg。根據(jù)與華石斛同源的鐵皮石斛基因組信息（ GenBank 登錄代碼： GCA_001605985.2），利用Primer Quest? Tool 在不同外顯子中設(shè)計(jì)RT- qPCR 引物。gDNA 和cDNA 的PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.4 RT-qPCR 以1∶5 稀釋的cDNA作為模板進(jìn)行RT-qPCR 分析。RT-qPCR 結(jié)果使用Light-Cycler 96（Roche， Penzberg， Germany）進(jìn)行分析。

根據(jù)MonAmpTM SYBR?Green qPCR Mix（Monad，廣州， 中國(guó)）制備20 μL RT-qPCR 反應(yīng)體系。

RT-qPCR 擴(kuò)增從初始步驟95 ℃ 30 s 開始，然后95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次。為了確保擴(kuò)增的特異性，使用Light-Cycler 96 進(jìn)行熔解曲線分析。RCD1（Radicalinducedcell death 1）是一種參與多種非生物脅迫反應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)基因[20]。葉綠素合成酶（CHLG）參與葉綠素a 合成的最后步驟之一[21]。本研究利用這2 個(gè)基因?qū)λx內(nèi)參基因的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 基因表達(dá)穩(wěn)定性分析 根據(jù)E=10slope 公式計(jì)算不同內(nèi)參引物的擴(kuò)增效率[22]。為了評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，使用RefFinder（http：//blooge.cn/RefFinder/）篩選最佳內(nèi)參基因[23]。這個(gè)網(wǎng)站收集了目前主要算法（ geNorm[8] 、Normfinder[24] 、BestKeeper[25]和比較ΔCt 方法[26]）來(lái)對(duì)測(cè)試的候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性比較和排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于華石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選候選內(nèi)參基因

根據(jù)之前的華石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用TPM 計(jì)算基因表達(dá)。最終，共鑒定出164 個(gè)符合變異系數(shù)（CV≤0.2）和中等表達(dá)（TPM 在10～300 之間）的候選基因。GO 聚類分析顯示，這些候選基因歸屬于36 個(gè)GO 類別（圖1）。為了避免基因共表達(dá)對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的影響，因此從不同GO 聚類分支中分別挑選候選基因，共篩選出24個(gè)候選內(nèi)參基因（表1）。例如，RHN1 參與囊泡運(yùn)輸，ADF11 參與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合，MGE2 參與ATP 依賴的蛋白易位，SGS3 參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，RNG1L 參與蛋白泛素化。

2.2 內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)

根據(jù)鐵皮石斛的基因組數(shù)據(jù)，對(duì)24 個(gè)候選基因進(jìn)行同源性鑒定，提取基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)的RT-qPCR 引物至少跨越一個(gè)內(nèi)含子（表1）。為驗(yàn)證RT-qPCR 引物是否跨內(nèi)含子，分別以cDNA 和gDNA 為模板進(jìn)行PCR。cDNA 模板中RNG1、MGE2、RPS7A、IPUT1、TFIIA1、TF2H2、OOPDA、ANM1、SLX1 基因的擴(kuò)增片段與gDNA模板相似（圖2A），說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物之間不存在內(nèi)含子，這些候選基因可能會(huì)在RT-qPCR 擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生假陽(yáng)性。ADF11 和PECT 的擴(kuò)增產(chǎn)物在cDNA 模板中達(dá)到了預(yù)期的大小，而在gDNA 模板中未觀察到擴(kuò)增條帶（圖2A）。這說(shuō)明在gDNA模板中，ADF11 和PECT 的內(nèi)含子過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法完成PCR 擴(kuò)增，因此可以當(dāng)作候選基因。此外，SGS3、RNG1L、ACBP2、RPAC1、IBR5、CLP1、VDAC1、SR542、UBP25、MED17、PRP19、CPY71、SEC23 以gDNA 為模板的擴(kuò)增條帶較cDNA 模板中擴(kuò)增條帶長(zhǎng)（圖2A）。這說(shuō)明在正向引物和反向引物的擴(kuò)增區(qū)域中至少包含一個(gè)內(nèi)含子。綜上所述一共鑒定出15 個(gè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增引物具有跨內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。RT-qPCR 擴(kuò)增后，這15 個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行了熔解曲線分析，均呈現(xiàn)單峰（圖2B），表明引物特異擴(kuò)增。因此，選擇這15 個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步的穩(wěn)定性分析。

2.3 表達(dá)穩(wěn)定性分析

根據(jù)15 個(gè)候選基因的RT-qPCR 數(shù)據(jù)，采用4種工具對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。基因穩(wěn)定性分析結(jié)果用熱圖呈現(xiàn)（圖3），穩(wěn)定值越低，顏色越紅，說(shuō)明該基因表達(dá)越穩(wěn)定。在干旱脅迫下，通過(guò)比較ΔCt 法、BestKeeper、Normfinder 和geNorm 分析分別確定CLP1 & SEC23、SEC23 &CPY71、CLP1 & SEC23 和RNG1L & PECT 為最佳內(nèi)參基因，綜合排序后選取SEC23 和CLP1 作為干旱脅迫下最穩(wěn)定內(nèi)參基因。在華石斛不同組織中，4 種算法分別確定了ADF11 & IBR5、PRP19& CLP1、ADF11 & CLP1、ACBP2 & IBR5 為最佳內(nèi)參基因，綜合分析后確定ADF11 和ACBP2 為不同組織中最穩(wěn)定內(nèi)參基因。結(jié)合上述干旱脅迫和不同組織分析數(shù)據(jù)，最終確定IBR5 和CPY71為綜合條件下較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2.4 內(nèi)參基因驗(yàn)證

為驗(yàn)證本研究篩選出內(nèi)參基因的準(zhǔn)確性，以最常見(jiàn)的管家基因Actin 作為內(nèi)參基因。分別驗(yàn)證了CHLG 在不同組織和RCD1 在干旱脅迫下的表達(dá)水平（圖4）。與預(yù)期的一樣，不同內(nèi)參基因歸一化后CHLG 和RCD1 的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果呈現(xiàn)出相似的模式，但存在一些細(xì)微的差異。

例如，在不同組織分析中，以Actin 作為內(nèi)參基因時(shí)，CHLG 在根和假鱗莖中的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，而以ADF11 和ACBP2 作為內(nèi)參基因時(shí)，CHLG在假鱗莖中的表達(dá)量顯著上調(diào)。后者與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果更為一致，這說(shuō)明本研究篩選出的內(nèi)參基因可以提供更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

3 討論

華石斛是海南島特有的熱帶蘭科植物，具有很高的觀賞和藥用價(jià)值[1]。該植物附生于海拔1000 m 的山地疏林中樹干上，干旱脅迫是其生存中的最主要危害。研究表明華石斛具有豐富的活性藥物成分，其生物合成機(jī)理已成為研究熱點(diǎn)[1-2， 5-6]。

然而，華石斛的穩(wěn)定內(nèi)參基因尚未鑒定出來(lái)，這限制了相關(guān)基因的表達(dá)和功能研究。因此，為了推進(jìn)華石斛基因功能、調(diào)控機(jī)制、遺傳機(jī)理等研究，穩(wěn)定的內(nèi)參基因鑒定至關(guān)重要。

高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展使得非模式物種的基因資源挖掘和表達(dá)研究成為可能[4， 9]。此前的華石斛轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)楸狙芯刻峁┝舜罅康幕驍?shù)據(jù)[4]。將clean reads 映射到基因文庫(kù)，通過(guò)TPM對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行初步篩選。研究表明內(nèi)參基因的表達(dá)水平過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響表達(dá)校準(zhǔn)結(jié)果[13]，

本研究共鑒定出164 個(gè)低變異系數(shù)（CV≤0.2）和中等表達(dá)（TPM 在10～300 之間）的候選內(nèi)參基因。此外，如果不同內(nèi)參基因同屬一個(gè)功能類群，那么很可能這些基因存在共表達(dá)現(xiàn)象[27]。為避免共表達(dá)對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的潛在影響，候選基因從不同功能簇中挑選，包括一些常規(guī)內(nèi)參基因（如ADF11、PRS7A、CPY71 和UBP25）和不常見(jiàn)基因（如SGS3、IPUT1、VDAC1 和MED17）。

雖然在提取RNA 的過(guò)程中，樣品經(jīng)過(guò)DNAase處理，去除gDNA 污染，但并不清楚樣品中是否存在殘留的gDNA。為避免殘留gDNA對(duì)RT-qPCR分析的影響，本研究按照前人的方法設(shè)計(jì)了跨越內(nèi)含子的RT-qPCR 引物[27]。根據(jù)凝膠電泳結(jié)果顯示，9 個(gè)候選基因（RNG1、MGE2、RPS7A、IPUT1、TFIIA1、TF2H2、OOPDA、ANM1、SLX1）的擴(kuò)增引物不符合要求，在后續(xù)分析中被剔除。熔解曲線分析表明，剩余的15 個(gè)候選基因引物進(jìn)行特異擴(kuò)增，可用于穩(wěn)定性分析。

為了評(píng)估這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，本研究使用了4 種主流算法，包括geNorm[8]、Normfinder[24]、BestKeeper[25]和比較ΔCt 方法[26]。

穩(wěn)定值最低的候選基因被認(rèn)為具有最高的穩(wěn)定性。在geNorm 分析中，所有內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值均低于閾值1.5[8]，說(shuō)明本研究產(chǎn)生的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性極高。這一結(jié)果可能是由于本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行了初步篩選，已將不穩(wěn)定的基因剔除，與前人對(duì)蘋果內(nèi)參基因研究一致[9]。內(nèi)參基因驗(yàn)證表明，與傳統(tǒng)的Actin 內(nèi)參相比，本研究篩選出的內(nèi)參基因可獲得更為精確的RT-qPCR 校準(zhǔn)結(jié)果，表明所產(chǎn)生的內(nèi)參基因具有極高的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

基于華石斛前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)廣泛的篩選獲得理想的RT-qPCR 內(nèi)參基因。本研究將164 個(gè)低變異系數(shù)及中等表達(dá)的候選基因劃分為36 個(gè)GO 分類，從中篩選了24 個(gè)候選基因。以cDNA 和gDNA 為模板，篩選出了15 個(gè)跨越內(nèi)含子的候選基因引物。綜合多種算法分別選取了SEC23 與CLP1、ADF11 與ACBP2、IBR5 與CPY71分別為干旱脅迫、不同組織和綜合情況下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。本研究首次在華石斛全基因組范圍內(nèi)鑒定了穩(wěn)定內(nèi)參基因，為進(jìn)一步研究基因表達(dá)和功能奠定了基礎(chǔ)。

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