37 種中藥及其復(fù)方對雞致病性沙門氏菌的體外抑菌試驗

■ 王冠男 周子凡 趙 雙 寇宇寧 焦夢珍 陳春琴 程曉薇 于 雷

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200）

雞沙門氏菌病是由一種或者多種致病性的沙門氏菌侵染機(jī)體所引發(fā)的一種急性或慢性臨床傳染性疾病，造成病雞水樣腹瀉，嚴(yán)重時可脫水致死[1]。雞沙門氏菌病在世界各地的家禽養(yǎng)殖領(lǐng)域廣泛發(fā)生[2]，發(fā)病率極高、傳染性極強(qiáng)[3]，既可經(jīng)縱向傳播，也可橫向感染傳播。因其傳播方式多樣，使其成為該病的防控難點[4]。雞沙門氏菌病可感染各個階段的雞，尤其是1～3周齡的雛雞，造成發(fā)育不全，雞體內(nèi)可一直攜帶病菌，造成新一輪感染，使其生產(chǎn)性能和產(chǎn)蛋性能下降[5]，給我國養(yǎng)雞行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在雞致病性沙門氏菌病的防治方面，接種疫苗、使用抗生素是對抗沙門氏菌的常見辦法，但抗生素的不合理、不規(guī)范使用甚至濫用，使該菌對抗生素類藥物的耐藥性增加，出現(xiàn)多重耐藥菌株[6]，導(dǎo)致臨床上對雞沙門氏菌病的治療情況愈加復(fù)雜。歐盟嚴(yán)禁在飼料內(nèi)添加抗生素，并對家禽以治療為目的而使用的抗生素進(jìn)行獸醫(yī)監(jiān)督，避免抗生素在體內(nèi)累積。中國在近年來也開始規(guī)范抗生素使用，推行“飼料禁抗、養(yǎng)殖減抗”政策，各地都樹立了非抗生素養(yǎng)殖的理念。目前，益生菌、噬菌體、中藥等因不易產(chǎn)生耐藥性、安全性高、副作用小和抗菌譜廣等優(yōu)勢成為熱門的替抗物[7-8]。已有研究證實益生菌可有效阻止雞沙門氏菌的自然感染[4]；多次在雞的飲用水中投入噬菌體混合物，可有效殺滅雞泄殖腔拭子中的沙門氏菌[9]。但益生菌不能單獨使用，會受到所使用的產(chǎn)品種類（如食品添加劑、產(chǎn)品基質(zhì)等）的影響，導(dǎo)致微生物的轉(zhuǎn)移[10]。而噬菌體對靶細(xì)胞特異性很強(qiáng)，必須確認(rèn)病原菌后使用，限制了在臨床的大規(guī)模應(yīng)用，還要避免使用攜帶抗生素抗性基因、毒性基因的噬菌體，以免導(dǎo)致細(xì)菌宿主的毒力增加[11]。

相比于益生菌、噬菌體等替抗物，中藥具有副作用小、藥效持久、不易產(chǎn)生耐藥性、殘留少等優(yōu)點，成為替抗中的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加中藥可增加細(xì)菌對抗生素的敏感性，而在飼料中添加益生菌則沒有這種作用；并且飼料中添加中藥可以調(diào)節(jié)家禽腸道菌群，促進(jìn)生長；還可以調(diào)整機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高動物機(jī)體免疫力, 減少沙門菌的感染[12-14]。

為篩選具備替抗?jié)摿Φ闹兴帲狙芯客ㄟ^二倍稀釋法測定玫瑰茄、五味子和石榴皮等37 種中藥及其復(fù)方對雞致病性沙門氏菌的體外抑菌效果及其MBC和MIC，旨在為進(jìn)一步研發(fā)防治雞致病性沙門氏菌病的中藥制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株雞沙門氏菌陽性菌株YN-1，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

黃連、薄荷、黃芩、連翹、紫蘇、蒲公英、藏紅花、玫瑰茄、五味子、大青葉、丁香、板藍(lán)根、石榴皮、沙參、夏枯草、胖大海、黃柏、玫瑰、桃仁、王不留行、菊花、神曲、蒼柏、金銀花、大黃、獨活、蒼術(shù)、山藥、女貞子、石膏、蘆根、通草、決明子、花椒、薏苡仁、桂枝、干姜，皆購于萊陽市棗行藥店。

LB 肉湯液體培養(yǎng)基（LB Broth）、LB 營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基（LB Nutrient Agar），均購于青島海博生物技術(shù)有限公司；GNP-9160隔水式培養(yǎng)箱，購于上海精宏試驗設(shè)備有限公司；新陶養(yǎng)生煲，購于浙江蘇泊爾股份有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機(jī)，購于湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司；0～300 mm 游標(biāo)卡尺，購于上海靚卡量具有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥藥液的制備

37 種中藥各稱取20 g，加入200 mL 純化水，浸泡30 min，加熱煮沸，開文火煮至100 mL，過濾藥渣后，加熱濃縮至20 mL，使單味中藥藥液濃度在1 g/mL。40 ℃下3 000 r/min離心40 min，取上清液，備用。

1.2.2 細(xì)菌懸液的制備

沙門氏菌YN-1活化于LB營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取平板上部分菌落接種到新的培養(yǎng)基上，重復(fù)此步驟2～3次后，挑取長勢較好的單菌落，接種于LB肉湯液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌液濃度為1.6×108CFU/mL，備用。

1.2.3 抑菌圈的測定

采用平板打孔法[15]測定單方及復(fù)方中藥抑菌圈大小，取濃度為1.6×108CFU/mL 的沙門氏菌菌液涂布于LB 營養(yǎng)瓊脂平板上，用孔徑為4.0 mm 的無菌打孔器在每個培養(yǎng)皿內(nèi)打3 孔，每個試驗孔內(nèi)加入50 μL中藥藥液，保持加滿不溢出的狀態(tài)，每種中藥藥液做三個重復(fù)試驗。將培養(yǎng)皿正放入隔水式培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑大小，取平均值。

抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)[16]：無抑菌圈則不敏感（-）；抑菌圈直徑<10 mm，低度敏感（+）；抑菌圈直徑10～15 mm，中度敏感（++）；抑菌圈直徑>15～20 mm，高度敏感（+++）；抑菌圈直徑>20 mm，極度敏感（++++）。

1.2.4 單方中藥MIC和MBC的測定

采用二倍稀釋法[17]測定中藥的MIC。準(zhǔn)備12 支35 mL 的無菌試管，編號依次為1～12，在每支試管中加入5 mL 的LB 肉湯液體培養(yǎng)基，在第1 支試管中加入5 mL單方中藥的上清液，混勻后吸取1號試管中的液體5 mL 加入2 號試管，重復(fù)上述操作到第10 號試管，吸出5 mL 棄掉。隨后在1～11 號試管中加10 μL菌懸液，第11號試管為陽性對照，第12號試管為空白對照，設(shè)置三組重復(fù)試驗。37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。按照編號排列，最后一個清澈的試管藥物濃度即為該單方中藥的MIC。

根據(jù)上述MIC 的結(jié)果，將澄清試管于LB 營養(yǎng)瓊脂平板中劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，找出沒有菌落生長的中藥最低濃度和有菌落生長的最高濃度，在這個區(qū)間內(nèi)繼續(xù)稀釋：第一個試管中加入900 μL區(qū)間中最低濃度藥液和100 μL 的LB 肉湯液體培養(yǎng)基，第二個試管中加入800 μL 的藥液和200 μL 的LB肉湯液體培養(yǎng)基，依此類推，最后一個試管中加入600 μL 的藥液和400 μL 的LB 肉湯液體培養(yǎng)基，每個試管中加入10 μL 的菌液，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h后，劃線并設(shè)置三組重復(fù)試驗，觀察結(jié)果。最后一個無菌生長的培養(yǎng)基的中藥濃度即為MBC。

1.2.5 復(fù)方中藥的MIC和MBC測定

根據(jù)單方中藥藥液對沙門氏菌的藥敏試驗結(jié)果，選取其中對沙門氏菌有抑菌效果的中藥進(jìn)行雙聯(lián)復(fù)方試驗，通過參考文獻(xiàn)[16]，按照1∶1的比例進(jìn)行組合，并測定復(fù)方中藥對沙門氏菌的聯(lián)合抑菌指數(shù)（FICI），每組設(shè)置三組重復(fù)試驗取平均值。復(fù)方中藥FICI 參考文獻(xiàn)[18]：當(dāng)FICI≥2.0 時為頡頏作用；當(dāng)1.0

2 結(jié)果與分析

2.1 37種單方中藥對沙門氏菌的體外抑菌效果

37 種單方中藥中有12 種對沙門氏菌有抑制效果，其中對石榴皮、玫瑰茄、五味子高度敏感；對黃芩、夏枯草、板藍(lán)根、黃連中度敏感；對丁香、連翹、菊花、桂枝、大青葉低度敏感（見表1）。對蒼術(shù)、女貞子、桃仁、蘆根、通草等25種中藥不敏感。

表1 37種中藥對沙門氏菌的體外抑菌效果

2.2 中藥復(fù)方對沙門氏菌的體外抑菌效果

在復(fù)方中藥藥液中，沙門氏菌對玫瑰茄+石榴皮表現(xiàn)為高度敏感，抑菌圈直徑為（15.90±0.50）mm；對玫瑰茄+五味子表現(xiàn)為高度敏感，抑菌圈直徑為（18.40±0.53）mm；對石榴皮+五味子表現(xiàn)為中度敏感，抑菌圈直徑為（13.90±1.17）mm（見表2）。由于單方中藥中有抑菌效果的其他中藥雙聯(lián)抑菌圈直徑均小于10 mm，均為低度敏感，在表2中不再列舉。

表2 中藥復(fù)方對沙門氏菌的體外抑菌效果

2.3 單方中藥對沙門氏菌的MIC和MBC

玫瑰茄、五味子的MIC 均為31.25 mg/mL，MBC 均為43.75 mg/mL，抑菌和殺菌效果均比其他中藥強(qiáng)。其次是板藍(lán)根、連翹、夏枯草，MIC均為62.5 mg/mL，MBC為62.5～125 mg/mL不等；再次是黃芩、黃連、丁香；石榴皮、菊花、桂枝、大青葉抑菌和殺菌效果最弱。見表3。

表3 單方中藥對沙門氏菌的MIC和MBC（mg/mL）

2.4 3種中藥復(fù)方對沙門氏菌的MIC和MBC

由表4 可知，不同組合的復(fù)方中藥對沙門氏菌的體外抑菌效果差異較大。玫瑰茄+石榴皮和石榴皮+五味子的MIC 為62.5 mg/mL，聯(lián)合抑菌指數(shù)為1.875，為無關(guān)效應(yīng)，其中玫瑰茄+石榴皮的MBC 為112.5 mg/mL，石榴皮+五味子的MBC為100.00 mg/mL；玫瑰茄+五味子的MIC 為31.25 mg/mL，聯(lián)合抑菌指數(shù)為1.667，為無關(guān)效應(yīng)，其MBC為50.00 mg/mL。

表4 復(fù)方中藥對沙門氏菌的MIC、MBC和聯(lián)合抑菌指數(shù)

3 討論

雞致病性沙門氏菌病是家禽養(yǎng)殖業(yè)一直以來關(guān)注的問題，不僅會引發(fā)禽類生產(chǎn)性能及繁殖性能的下降，還會導(dǎo)致禽類死亡帶來經(jīng)濟(jì)損失以及造成人類疾病的風(fēng)險。使用抗生素是控制雞致病性沙門氏菌的常用方法，Nair 等[19]研究顯示，氟喹諾酮類抗生素通過抑制核酸的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，抑制雞沙門氏菌的活性；四環(huán)素類通過干擾蛋白質(zhì)的合成。使雞沙門氏菌存活所必需的酶不能被合成。但長期使用抗生素，雞沙門氏菌會產(chǎn)生耐藥性，主要通過外排泵把抗菌藥物泵出胞外或一些基因編碼酶對抗生素進(jìn)行滅活，使菌體內(nèi)抗生素濃度降低而產(chǎn)生耐藥性[19]。所以使用傳統(tǒng)的抗生素治療雞沙門氏菌感染，不僅會產(chǎn)生耐藥性，使治療效果降低[20]，還會在動物體內(nèi)大量殘留，影響動物生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境，并會通過食物鏈的傳遞直接造成人體抗生素耐藥，威脅人類健康[8]。

中藥具有不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點，因此在臨床治療多重耐藥菌所致感染方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景[21]。杜學(xué)林[22]的研究表明，使用中藥治療雞致病性沙門氏菌比抗生素治療效果更佳。中西藥抑菌機(jī)理相近，一類抗生素只有一種抑菌機(jī)制，但由于中藥具有復(fù)雜的成分，同一種中藥具有不同的抑菌機(jī)制。王芝超等[23]發(fā)現(xiàn)，黃連不僅能抑制細(xì)菌生物膜的形成，還可以降低主動外排泵基因的表達(dá)量。本研究顯示，雞致病性沙門氏菌對玫瑰茄、五味子、石榴皮表現(xiàn)為高度敏感，夏枯草、黃芩、黃連、板藍(lán)根表現(xiàn)為中度敏感，其中玫瑰茄和五味子的抑菌和殺菌效果最強(qiáng)。玫瑰茄的有效抑菌成分為黃酮類化合物，主要是通過與DNA 發(fā)生嵌入結(jié)合和氫鍵結(jié)合，使DNA 不能進(jìn)行正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[24]，達(dá)到抑菌效果。除此之外，玫瑰茄中還含有酚類、花青素，揮發(fā)油、生物堿等功能性成分，玫瑰茄具有抑菌作用可能是這些物質(zhì)綜合作用的結(jié)果。但目前關(guān)于玫瑰茄作為中藥抑菌的研究還較少，本試驗為玫瑰茄在抑菌作用方面提供參考，但對其抑菌機(jī)理的研究還需進(jìn)一步探索。五味子中有效抑菌的主要成分為木脂素類物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性，主要通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)揮抑菌作用[25]；黃連的抑菌效果是由于多種抑菌物質(zhì)協(xié)同的結(jié)果，其抑菌成分與黃連自身極性極大的堿性或酸性化學(xué)基團(tuán)有關(guān)[26]；石榴皮具有廣譜抑菌特性，其提取物中的多酚類化合物通過抑制沙門氏菌生物膜的形成發(fā)揮抑菌作用[27]。在本試驗中，中藥雙聯(lián)復(fù)方的體外抑菌效果與單方中藥的抑菌效果基本一致，因雙聯(lián)復(fù)方組合的作用效應(yīng)為無關(guān)作用，所以對中藥制劑的配伍比例、提取方法、藥物的最適用藥時間等問題，還需要進(jìn)一步地研究和探索。由于各種中藥自身特性不同、抑菌成分不同，可能會產(chǎn)生不同的抑菌效果。中藥有效成分的提取方法、分離的菌株不同也會影響作用效果。

此外，以往的試驗都是以抑菌圈效果較好的中藥作為主要的鑒別標(biāo)準(zhǔn)組成復(fù)方，而忽略了其他效果不明顯的中藥的抑菌作用，這些中藥之間相互配伍可能會有更好的抑菌效果，這為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究37種中藥中僅有12種對雞致病性沙門氏菌有抑菌效果，其中玫瑰茄、石榴皮、五味子的抑菌效果較好；復(fù)方中藥中玫瑰茄+五味子效果最好，玫瑰茄+石榴皮、石榴皮+五味子的抑菌效果與單方中藥抑菌效果相差不大，F(xiàn)ICI分析顯示為無關(guān)作用。本試驗結(jié)果可為后續(xù)制作抑制雞致病性沙門氏菌的中藥制劑提供參考依據(jù)。