楊樹NRAMP基因家族全基因組鑒定與生物信息學(xué)分析

趙志明 袁夢婷 武江昊 門艷闊 江敏 顧麗姣 王進(jìn)茂

摘要 為研究楊樹自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（NRAMP）家族成員的結(jié)構(gòu)和功能，利用生物信息學(xué)方法，從楊樹全基因組數(shù)據(jù)庫中篩選并鑒定NRAMP家族基因序列，并對該家族成員的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、染色體定位、進(jìn)化樹和組織表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：從楊樹基因組中共鑒定出6個NRAMP基因家族成員，編碼的氨基酸數(shù)量差異較大，為503～1 310，亞細(xì)胞定位表明其均在質(zhì)膜上，各個成員跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量在10～12。PNT31315的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，其他家族成員主要的二級結(jié)構(gòu)為α-螺旋。進(jìn)化樹分析表明，楊樹NRAMP家族基因全部聚類于第3類，且與玉米、高粱、甘蔗和水稻皆有相似基因，不存在物種特異性。染色體定位分析表明，該家族各基因在染色體上分散分布，只有PNT48459和PNT49289兩個基因分布在一個染色體上，且不存在串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制基因。蛋白功能預(yù)測結(jié)果顯示，PNT48459和PNT52668可能與植物金屬耐受蛋白結(jié)合參與金屬離子的吸收與轉(zhuǎn)運，PNT31315可能參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。PNT48459、PNT37313和PNT31315在主根中的表達(dá)量較高，推測其參與重金屬吸收過程。

關(guān)鍵詞 楊樹；NRAMP基因家族；生信分析；重金屬脅迫

中圖分類號 S792.11? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0090-05

作者簡介 趙志明（1995—），男，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向：林木遺傳育種。*通信作者，教授，博士，從事林木遺傳育種研究。

隨著我國城市化建設(shè)的不斷深入，重金屬污染問題日益嚴(yán)重，威脅生態(tài)系統(tǒng)，影響人類健康［ 1］。楊樹適應(yīng)性較強，廣泛分布于世界各地，具有易繁殖、生長快、生物量大等特點，根系發(fā)達(dá)，對毒性物質(zhì)具有較強的耐性，對重金屬具有較強的富集及轉(zhuǎn)運能力［ 2］。天然抗性相關(guān)巨噬蛋白（natural resistanceassociated macrophage protein，NRAMP）是一類參與金屬離子運輸?shù)目缒まD(zhuǎn)運蛋白，主要參與植物對鐵、錳、鎘等金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運［ 3］。NRAMP蛋白屬于一種具有典型膜整合蛋白特征多肽分子的古老膜整合轉(zhuǎn)運蛋白家族，其序列在各物種間高度保守且具有類似的二級結(jié)構(gòu)［ 4］。在擬南芥中，AtNRAMP1可以高效調(diào)控植物體內(nèi)鐵的吸收轉(zhuǎn)運，通過表達(dá)后期取代離子轉(zhuǎn)運過程中的鐵轉(zhuǎn)運蛋白［ 5］。AtNRAMP2與AtNRAMP1功能相似，具有錳轉(zhuǎn)運活性，在酵母中可介導(dǎo)錳進(jìn)入胞質(zhì)［ 6］。AtNRAMP3和AtNRAMP4在鐵缺乏時被誘導(dǎo)表達(dá)，并在種子萌發(fā)和缺錳條件下，在植株光合作用時維持所需錳離子的平衡［ 7］。AtNRAMP6定位于側(cè)根和幼嫩葉片細(xì)胞的高爾基體或反面高爾基網(wǎng)絡(luò)上，是Cd和Fe的轉(zhuǎn)運蛋白［ 8-9］。在水稻8個NRAMP基因家族中，成員OsNRAMP1、OsNRAMP3、OsNRAMP5、OsNRAMP6和OsNRAMP7對鋅、錳、鎘和鐵等有吸收和轉(zhuǎn)運功能［ 4，10-12］。

植物在生長過程中，如遇重金屬污染，過量的重金屬會對植物細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害，影響植物的生長發(fā)育。如鎘脅迫時會破壞植物葉片的葉綠素結(jié)構(gòu)；鉛的積累會減少植物根細(xì)胞的有絲分裂速度，使植物生長緩慢；錳雖然是植物必需的微量元素，過量則會使植物產(chǎn)生毒害作用，使植物生理代謝失調(diào)、生長發(fā)育受阻等。目前，NRAMP基因家族在擬南芥、水稻、甘蔗［ 13］、大麥［ 14］、馬鈴薯［ 15］、辣椒［ 16］等多種植物中均有相關(guān)研究。但很少有關(guān)于楊樹NRAMP基因家族的研究，因此，筆者利用生物信息學(xué)工具對楊樹NRAMP家族成員進(jìn)行鑒定與分析，旨在后續(xù)楊樹NRAMP家族基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

楊樹全基因組和基因注釋文件下載于Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：∥plants.ensembl.org/index.html）。水稻、擬南芥、高粱、玉米和甘蔗基因組文件均下載于Ensembl數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 楊樹NRAMP基因家族的鑒定。

利用隱馬爾可夫模型保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫文件（PF01566），利用Perl程序篩選含有NRAMP結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，刪除重復(fù)序列，并通過CDD（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）、Pfam（http：∥pfam.xfam.org/）和SMART數(shù)據(jù)庫（http：∥smart.embl.de/）對候選基因進(jìn)行確證，剔除無OVATE保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，保留下的即為楊樹PtNRAMP基因家族成員。

1.2.2 楊樹NRAMP家族蛋白理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)分析。

利用在線網(wǎng)站Ex PASy（https：∥web.expasy.org/protparam/）對楊樹NRAMP家族蛋白、氨基酸數(shù)、分子量、等電點進(jìn)行分析。利用在線網(wǎng)站wolfpsort對該家族成員蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞預(yù)測（https：∥wolfpsort.hgc.jp/）和信號肽（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）分析。通過在線網(wǎng)站SOPMA（"https：∥npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測該家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 楊樹NRAMP基因保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析。

利用MEME（http：∥memesuite.org/）在線網(wǎng)站對NRAMP蛋白進(jìn)行保守基序分析，設(shè)置Motif數(shù)量最大匹配數(shù)為10個，長度從6～50個氨基酸殘基。通過GSDS（http：∥gsds.gaolab.org/）在線網(wǎng)站繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.2.4 楊樹NRAMP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和染色體定位分析。

采用MEGA 7.0軟件對楊樹NRAMP基因家族蛋白進(jìn)行多序列比對，運用Neighbor-joining（NJ）算法，bootstrap值取1 000，其余參數(shù)默認(rèn)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。用Evolview在線網(wǎng)址（http：∥www.omicsclass.com/article/671）繪制進(jìn)化樹。

利用Perl程序解析楊樹基因組注釋文件，得到染色體位置和基因結(jié)構(gòu)信息，并運用Map chart工具繪制染色體定位圖?；谝韵?個標(biāo)準(zhǔn)：①較短序列的長度占較長序列的70%;②2個對齊序列的相似性大于70%［ 17-18］，為片段復(fù)制基因。將位于同一染色體上且由少于5個基因間隔的同一家族基因認(rèn)定為串聯(lián)重復(fù)基因［ 19］。

1.2.5 楊樹NRAMP家族基因功能預(yù)測。

通過在線網(wǎng)站STRING（https：∥cn.stringdb.org/）對楊樹NRAMP家族基因進(jìn)行互作蛋白預(yù)測。

1.2.6 楊樹NRAMP家族基因在不同組織下的表達(dá)。

楊樹組織表達(dá)數(shù)據(jù)參考（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/？term=RNAseq%20of%20major%20tissues%20and%20xylem%20cell%20types%20of%20Populus%20trichocarpa）［ 17-18］，分析NRAMP家族基因在楊樹不同組織（莖、主根、葉、韌皮部、木質(zhì)部和導(dǎo)管）中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtNRAMP家族蛋白理化特性

通過搜索楊樹全基因組數(shù)據(jù)庫，得到6個可能是NRAMP家族的成員，提交到CDD、Pfam和SMART確定NRAMP結(jié)構(gòu)域，最終確定6個序列（表1）。由表1可知，該家族成員編碼的氨基酸在503～1 310，分子量在54 630.21～142 293.19 Da，家族成員的不穩(wěn)定系數(shù)在34.21～46.27，氨基酸序列的平均親水系數(shù)在-0.008～0.647，僅有PNT31315為親水蛋白，其余為疏水蛋白，亞細(xì)胞定位表明其成員均在質(zhì)膜上。

2.2 PtNRAMP家族蛋白二級結(jié)構(gòu)分析和跨膜結(jié)構(gòu)

PtNRAMP家族蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成（表2）。其中，α-螺旋所占比例最高，在33.82%～57.00%；β-轉(zhuǎn)角比例最小，占比僅為2.91%～4.29%。僅PNT31315的二級結(jié)構(gòu)比例表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-轉(zhuǎn)角，表明其結(jié)構(gòu)多變，可能是蛋白質(zhì)具有特異功能的部位。6個PtNRAMP家族成員的跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)在10～12個。這表明PtNRAMP家族蛋白為跨膜蛋白，可能與其跨膜轉(zhuǎn)運重金屬離子的功能相適應(yīng)。

2.3 楊樹NRAMP基因保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

通過MEME和GSDS在線網(wǎng)站對楊樹NRAMP基因家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，在楊樹NRAMP家族6個基因中，都含有Motif1、Motif2、Motif3和Motif6，只有PNT31315基因含有4個Motif，其余基因含有8個或10個Motif。保守基序在數(shù)量上的差異可能表明其基因與其他基因在功能上有一定差別。

基因結(jié)構(gòu)分析表明，每個基因均含有內(nèi)含子，且數(shù)量差別較大，最多含有12個內(nèi)含子，最少的含有3個；PNT37313基因在5′末端和3′末端均不含有非翻譯區(qū)（UTR），PNT48459基因僅在5′末端不含有非翻譯區(qū)，其余4個基因有完整的基因結(jié)構(gòu)。

2.4 楊樹NRAMP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了解NRAMP基因家族在楊樹和其他物種的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了楊樹、水稻、擬南芥、高粱、玉米和甘蔗NRAMP家族成員的進(jìn)化樹。將6個物種分為三大類（圖2），3類中都含有單子葉和雙子葉植物，表明NRAMP家族基因出現(xiàn)于單、雙子葉植物分離前。第1類分支中，僅有1個擬南芥和5個玉米NRAMP家族成員，第2類分支中，除了楊樹NRAMP家族成員外，其他物種均有該家族基因分布，楊樹NRAMP家族基因全部聚類于第3類，且與玉米、高粱、甘蔗和水稻皆有相似基因，不存在物種特異性，說明這些基因可能具有相似的功能。

2.5 楊樹NRAMP基因家族染色體定位分析

楊樹NRAMP家族的6個基因在染色體上的分布分散（圖3），分布在1號、2號、5號、6號和7號染色體上，其余14條染色體上沒有分布，在2號染色體上分布2個該家族基因，其余4條染色體上各分布1個NRAMP家族基因。該家族基因在染色體上的分布位置不同，既有靠近染色體末端，又有近著絲粒區(qū)分布。該家族基因不存在串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制。

2.6 互作蛋白預(yù)測楊樹NRAMP家族基因功能

互作蛋白預(yù)測結(jié)果顯示（圖4），有3個楊樹NRAMP家族基因蛋白存在于互作網(wǎng)絡(luò)上，PNT31315與ERT1、ERT3和FBL9互作，PNT48459與PtrMTP9互作，PNT52668與PtrMTP3.2、PtrMTP1、PtrMTP2和PtrMTP12互作。楊樹金屬耐受蛋白（MTPs）在植物重金屬吸收和體內(nèi)平衡中起關(guān)鍵作用，PtrMTP9在酵母細(xì)胞中顯示出特定的Mn轉(zhuǎn)運能力，推測PNT48459和PNT52668可能與植物金屬耐受蛋白結(jié)合參與金屬離子的吸收與轉(zhuǎn)運。ETR1與ETR3為乙烯受體蛋白家族成員，PNT31315可能參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.7 楊樹NRAMP家族基因組織表達(dá)

為了解楊樹NRAMP家族基因的組織表達(dá)特性，該家族基因采用公開的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在莖、主根、葉、韌皮部、木質(zhì)部和導(dǎo)管中的表達(dá)情況，繪制熱圖（圖5）。PNT52668在莖中表達(dá)含量高，PNT49289和PNT27203在木質(zhì)部中表達(dá)含量高，PNT48459、PNT37313和PNT31315在主根中的表達(dá)量高。

3 討論與結(jié)論

楊樹是木本植物的模式物種，易于雜交和無性繁殖，具有生長迅速、生物量大等特點。楊樹可富集大量重金屬尤其是鎘，鎘濃度的增加和時間的延長使得楊樹各器官中鎘的積累量顯著增加［ 20］，在重金屬污染土壤的修復(fù)領(lǐng)域備受關(guān)注。因此，對楊樹NRAMP基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析具有重要意義。

該研究從楊樹全基因組中鑒定得到6個NRAMP基因家族成員，與擬南芥NRAMP家族6個成員，水稻NRAMP家族8個成員數(shù)量相對沒有變化，原因可能是該家族比較保守。理化性質(zhì)結(jié)果表明，該家族成員中PNT31315編碼的氨基酸數(shù)為1 310，其余編碼的氨基酸數(shù)在500左右，且PNT31315為親水蛋白，其余為疏水蛋白，6個PtNRAMP家族成員的跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)在10～12個，亞細(xì)胞定位預(yù)測其成員均位于質(zhì)膜上，可能與其跨膜轉(zhuǎn)運重金屬離子的功能相關(guān)。與其他植物煙草［ 21］、甘蔗NRAMP蛋白結(jié)構(gòu)一致?；蚪Y(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，該NRAMP家族所有成員均含有內(nèi)含子，在基因結(jié)構(gòu)中，內(nèi)含子

和外顯子在一個開放閱讀框中間隔排列，發(fā)揮著不同作用，內(nèi)含子不受自然選擇壓，相比于外顯子其積累了更多突變，外顯子序列通常較保守。楊樹NRAMP家族的6個基因在染色體上的分布分散，且該家族基因不存在串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制，基因重復(fù)事件是基因家族成員在數(shù)量上擴張的重要原因，該家族在楊樹中可能處于保守進(jìn)化。與其他物種不同，甘草NRAMP基因家族進(jìn)化過程中，片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制參與基因的擴增［ 22］。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示，楊樹、水稻、擬南芥、高粱、玉米和甘蔗6個物種被分為三大類，楊樹NRAMP家族基因全部聚類于第3類，且與玉米、高粱、甘蔗和水稻皆有相似基因，不存在物種特異性，說明這些基因可能具有相似的功能?；プ鞯鞍坠δ茴A(yù)測結(jié)果顯示，PNT48459和PNT52668可能與植物金屬耐受蛋白結(jié)合參與金屬離子的吸收與轉(zhuǎn)運，PNT31315可能參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，楊樹NRAMP家族成員在不同組織中有不同程度的表達(dá)，在主根中，PNT48459、PNT37313和PNT31315的表達(dá)量高。

筆者通過對楊樹中6個NRAMP基因家族成員的生物信息學(xué)分析，利于闡明楊樹NRAMP基因家族的功能，為楊樹應(yīng)對重金屬脅迫的研究提供重要的候選基因。

參考文獻(xiàn)

［1］YANG S C，LIU J L，BI X Y，et al.Risks related to heavy metal pollution in urban construction dust fall of fastdeveloping Chinese cities［J/OL］.Ecotoxicology and environmental safety，2020，197［2022-02-17］.https：∥doi.org/10.1016/j.ecoenv.2020.110628.

［2］ 李曉宇.楊樹修復(fù)土壤重金屬污染研究進(jìn)展［J］.遼寧林業(yè)科技，2021（4）：59-61.

［3］? VATANSEVER R，F(xiàn)ILIZ E，OZYIGIT I I.In silico analysis of Mn transporters （NRAMP1） in various plant species［J］.Molecular biology reports，2016，43（3）：151-163.

［4］ 陳可欣，蔣賢達(dá)，朱祝軍，等.植物Nramp家族參與金屬離子吸收和分配的研究進(jìn)展［J］.植物生理學(xué)報，2020，56（3）：345-355.

［5］? CASTAINGS L，CAQUOT A，LOUBET S，et al.The highaffinity metal transporters NRAMP1 and IRT1 team up to take up iron under sufficient metal provision［J］.Scientific reports，2016，6：1-11.

［6］ ALEJANDRO S，CAILLIATTE R，ALCON C，et al.Intracellular distribution of manganese by the Transgolgi network transporter NRAMP2 is critical for photosynthesis and cellular redox homeostasis［J］.The plant cell，2017，29（12）：3068-3084.

［7］ MARY V，RAMOS M S，GILLET C，et al.Bypassing iron storage in endodermal vacuoles rescues the iron mobilization defect in the natural resistance associatedmacrophage protein3natural resistance associatedmacrophage protein4 double mutant［J］.Plant physiology，2015，169（1）：748-759.

［8］ CAILLIATTE R，LAPEYRE B，BRIAT J F，et al.The NRAMP6 metal transporter contributes to cadmium toxicity［J］.Biochemical journal，2009，422（2）：217-228.

［9］? LI J Y，WANG Y R，ZHENG L，et al.The intracellular transporter AtNRAMP6 is involved in Fe homeostasis in Arabidopsis［J］.Frontiers in plant science，2019，10：1-11.

［10］CURIE C，LE ALONSO J M，JEAN M，et al.Involvement of NRAMP1 from Arabidopsis thaliana in iron transport［J］.Biochemical journal，2000，347：749-755.

［11］? CHANG J D，HUANG S，YAMAJI N，et al.OsNRAMP1 transporter contributes to cadmium and manganese uptake in rice［J］.Plant，cell & environment，2020，43（10）：2476-2491.

［12］? YANG C H，ZHANG Y，HUANG C F.Reduction in cadmium accumulation in japonica rice grains by CRISPR/Cas9mediated editing of OsNRAMP5［J］.Journal of integrative agriculture，2019，18（3）：688-697.

［13］ 劉營，尹澤，江姚蘭，等.甘蔗ScNRAMP基因家族的鑒定與生物信息學(xué)分析［J］.廣西植物，2022，42（11）：1865-1874.

［14］ 李一涵，于浪柳，李春燕，等.大麥NRAMP全基因組鑒定及重金屬脅迫下基因表達(dá)分析［J］.生物技術(shù)通報，2022，38（6）：103-111.

［15］ TIAN W J，HE G D，QIN L J，et al.Genomewide analysis of the NRAMP gene family in potato （Solanum tuberosum）：Identification，expression analysis and response to five heavy metals stress［J/OL］.Ecotoxicology and environmental safety，2021，208［2021-11-25］.https：∥doi.org/10.1016/j.ecoenv.2020.111661.

［16］ 胡燦，劉峰，王運生.辣椒CaNRAMP基因家族的鑒定與表達(dá)分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（10）：69-74.

［17］ GU Z L，CAVALCANTI A，CHEN F C，et al.Extent of gene duplication in the genomes of drosophila，nematode，and yeast［J］.Molecular biology & evolution，2002，19（3）：256-262.

［18］ GAO Y F，YANG F M，LIU J K，et al.Genomewide identification of metal tolerance protein genes in Populus trichocarpa and their roles in response to various heavy metal stresses［J］.International journal of molecular sciences，2020，21（5）：1-25.

［19］ WANG Y，DIEHL A，WU F N，et al.Sequencing and comparative analysis of a conserved syntenic segment in the Solanaceae［J］.Genetics，2008，180（1）：391-408.

［20］ GU J G，QI L，JIANG W S，et al.Cadmium accumulation and its effects on growth and gas exchange in four populus cultivars［J］.Acta biologica cracoviensia series botanica，2007，49（2）：7-14.

［21］ 余沁，何林燊，霍春松，等.煙草NRAMP家族全基因組鑒定及響應(yīng)重金屬脅迫的表達(dá)分析［J］.分子植物育種，2022，20（5）：1496-1504.

［22］ 盧婷婷，李艷玲，李存法，等.甘草NRAMP基因家族的鑒定和生物信息學(xué)分析［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，48（2）：40-47.