鄧昌良 李泳寧 葉雅沁

摘要 ［目的］比較基于核酸適配體檢測(cè)赭曲霉毒素A（OTA）方法與酶聯(lián)免疫法。［方法］建立核酸適配體檢測(cè)OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)，并與酶聯(lián)免疫法進(jìn)行比較。［結(jié)果］核酸適配體法檢測(cè)OTA在0.05～10.00 ng/mL具有較好的線性，飼料樣品中添加OTA的回收率為92.0%～93.5%，與酶聯(lián)免疫法相比，2種方法之間具有較好的一致性。［結(jié)論］該研究建立的基于核酸適配體檢測(cè)OTA方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，為研究飼料中OTA的快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 核酸適配體；赭曲霉毒素A；檢測(cè)；酶聯(lián)免疫法；飼料

中圖分類號(hào) S816.17? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）14-0189-03

作者簡(jiǎn)介 鄧昌良（1990—），男，福建龍巖人，助理實(shí)驗(yàn)師，從事藥物分析研究。

*通信作者，副教授，博士，從事微生態(tài)制劑研究。

赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA） 最為常見，具有肝腎毒性、致畸、致癌、遺傳毒性和免疫毒性等毒副作用，廣泛存在于大麥、小麥、玉米、啤酒和香料等農(nóng)產(chǎn)品中［1-3］。而飼料中常見的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、OTA、伏馬菌素和T-2毒素等［4-6］，其中OTA是較易污染的霉菌毒素，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物和人體安全。因此，為保證飼料產(chǎn)品的安全使用，建立高效、快速、準(zhǔn)確的霉菌毒素檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前，檢測(cè)OTA的方法主要有液相色譜法［7］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8］、膠體金色譜法［9］、酶聯(lián)免疫吸附法［10］和電化學(xué)傳感器法［11］等。液相色譜法是目前檢測(cè)OTA最常用的定量分析方法，靈敏度較高，但需要進(jìn)行樣品純化后進(jìn)行檢測(cè)；液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度可達(dá)0.1 ng/mL，但其對(duì)設(shè)備要求較高；酶聯(lián)免疫吸附法則多適用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)，但其靈敏度和特異性也有待于提高。近年來(lái)快速發(fā)展的靈敏度高和特異性強(qiáng)的核酸適配體檢測(cè)技術(shù)，成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。該研究前期已建立了基于核酸適配體的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法［12］，在此將該方法用于飼料樣品中OTA的檢測(cè)并與酶聯(lián)免疫法進(jìn)行比較，考察該方法建立的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）為北京Solarbio公司產(chǎn)品，鏈親和素購(gòu)為上海源葉生物公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白（BSA）和OTA為美國(guó)Sigma-aldrich公司產(chǎn)品；OTA核酸適配體5′-biotin-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-Cy3-3′，結(jié)合序列5′- BHQ2-TGTCCGATGC-3′由福州尚亞公司合成。赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒為美國(guó)REAGEN公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M3）為美國(guó)MD公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核酸適配體法檢測(cè)OTA。在96孔微孔板中加入100 μL 鏈親和素 （100 μg/mL），4 ℃包被過(guò)夜?？鄹桑肞BS緩沖液清洗3次，再次扣干；用1%BSA進(jìn)行封閉2 h后，用PBS緩沖液清洗3次，扣干。加入100 μL核酸適配體（200 nmol/L），25 ℃振蕩孵育30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。再加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或提取后的樣液，37 ℃反應(yīng)30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。最后加入100 μL互補(bǔ)序列（400 nmol/L），37 ℃反應(yīng)30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，吸收波長(zhǎng)為570 nm［12］。OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，將OTA標(biāo)準(zhǔn)品采用甲醇進(jìn)行溶解，再用HEPES緩沖液 （pH 7.0，120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L MgCl2、20 mmol/L CaCl2）稀釋成0、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液加至已經(jīng)加入100 μL核酸適配體按上述方法進(jìn)行加樣檢測(cè)，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光強(qiáng)度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)OTA。

根據(jù)赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品于所設(shè)定的孔中；每孔加入50 μL一抗，振蕩混勻 1 min；37 ℃下避光溫育30 min；倒掉板孔內(nèi)液體，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后將酶標(biāo)板倒置用力甩干；每孔加入100 μL二抗，振蕩混勻1 min；37 ℃下避光溫育30 min；倒掉板孔內(nèi)液體，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后將酶標(biāo)板倒置用力甩干。加入100 μL 四甲基聯(lián)苯胺，混勻1 min，室溫（22.5±2.5）℃溫育15～20 min，加入50 μL終止液；酶標(biāo)儀450 nm下讀OD值。OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，用檢測(cè)試劑盒中已配好OTA標(biāo)準(zhǔn)液（0、1、3、9、27、81 ng/mL），按上述方法進(jìn)行加樣檢測(cè)，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相對(duì)吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 飼料樣品處理及加標(biāo)回收率測(cè)試。從市場(chǎng)收飼料樣品數(shù)個(gè)，粉碎后備用。根據(jù)赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，準(zhǔn)確稱取2.0 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加10 mL 70%甲醇，振蕩5 min，室溫下4 000 r/min離心10 min；取1 mL上清，加入1 mL碳酸氫鈉溶液（0.1 mol/L），振蕩，取50 μL進(jìn)行分析。選擇未檢出OTA的飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分別向2.00 g飼料粉碎樣品中添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品（通過(guò)液體稀釋后加入），使其樣品中含有1.0和10.0 ng/g OTA，提取后采用酶聯(lián)免疫法和核酸適配體法進(jìn)行檢測(cè)樣品中OTA含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液，分別加至已包被好的96孔微孔板中，按“1.2.1”和“1.2.2”方法反應(yīng)后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光強(qiáng)度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶聯(lián)免疫法則按說(shuō)明書進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相對(duì)吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，核酸適配體法在OTA濃度0.05～10.00 ng/mL建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為Y = 4 543X+11 739（R2=0.986 1），最低檢測(cè)限為0.05 ng/mL；而根據(jù)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書在1～81 ng/mL建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-30.31X+74.86（R2=0.995 8），最低檢測(cè)限為1.00 ng/mL。

2.2 飼料樣品中OTA的檢測(cè)

從市場(chǎng)收集飼料樣品數(shù)個(gè)，根據(jù)OTA酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取，選擇未檢出OTA的飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分別采用核酸適配體法和酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算飼料樣品的OTA回收率，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，在飼料樣品中添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品，采用2種方法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)值具有較好的一致性。在飼料樣品中OTA標(biāo)準(zhǔn)品添加量1.0 ng/g，核酸適配體法檢測(cè)的回收率為92.0%，略高于酶聯(lián)免疫法（89.0%）；在飼料樣品中添加10.0 ng/g OTA標(biāo)準(zhǔn)品，則酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的平均回收率（95.8%）略高于核酸適配體法（93.5%）?？梢姡撗芯拷⒌暮怂徇m配體法具有較好的準(zhǔn)確度。

2.3 2種方法的比較

從表2可以看出，核酸適配體法檢測(cè)靈敏度較高，檢測(cè)限達(dá)到0.05 ng/mL，且反應(yīng)時(shí)間較短（反應(yīng)時(shí)間從加入待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)開始計(jì)算），工作中OTA標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為92.0%～93.5%，表明該研究建立的檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度。而與酶聯(lián)免疫法相比，由于酶聯(lián)免疫法采用的是顯色法，其檢測(cè)限較低，僅有1.00 ng/mL，但在較高濃度樣品的檢測(cè)中具有較高的回收率。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，食品、農(nóng)產(chǎn)品和飼料中的霉菌毒素污染時(shí)有報(bào)道，特別是農(nóng)產(chǎn)品和飼料產(chǎn)品，不僅影響動(dòng)物生長(zhǎng)和繁殖，并且可能隨著食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而對(duì)人體健康造成一系列嚴(yán)重的安全問(wèn)題，其安全性越來(lái)越受到人們重視。因此，為保障食品、農(nóng)產(chǎn)品和飼料的安全使用，建立新型的高靈敏霉菌毒素檢測(cè)方法是保障其安全的重要手段。

目前，已有大量的新型檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于霉菌毒素的檢測(cè)方法，特別是近年來(lái)報(bào)道了大量能特異性結(jié)合霉菌毒素的核酸適配體［13］，也開發(fā)了基于核酸適配體檢測(cè)黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等的檢測(cè)方法［14-16］。核酸適配體是一段能與目標(biāo)物進(jìn)行特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，由于其核酸特性，具有容易合成、反復(fù)使用和保存等的優(yōu)點(diǎn)。因此，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道了多種基于核酸適配體檢測(cè)OTA的技術(shù)方法［17］，如Wei 等［18］開發(fā)了一種新的基于核酸適配體檢測(cè)OTA的電化學(xué)生物傳感器，采用碳?xì)饽z和亞甲基藍(lán)（MB）作為信號(hào)放大策略，其檢測(cè)線性范圍為0.10～10.00 ng/mL，實(shí)際檢測(cè)限可達(dá)到1.0×10-4 ng/mL。Li等［19］建立了一種基于核酸適配體檢測(cè)谷物樣品中的多重真菌毒素的新型高通量光子晶體微球懸浮陣列，該檢測(cè)系統(tǒng)OTA的檢測(cè)范圍可達(dá)到0.1 pg/mL～0.1 ng/mL。曲瑤等［20］開發(fā)了基于核酸適配體檢測(cè)OTA的傳感器，其檢出限達(dá)到0.67 nmol/L。以上方法的檢測(cè)靈敏度均較高，可以對(duì)飼料和農(nóng)產(chǎn)品中的痕量霉菌毒素進(jìn)行分析檢測(cè)，但由于檢測(cè)操作和設(shè)備要求上都較高，難以在大量樣品的分析檢測(cè)中進(jìn)行應(yīng)用。

該研究建立的基于核酸適配體檢測(cè)OTA的方法，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，檢測(cè)濃度為0.05～10.00 ng/mL，最低檢測(cè)限可達(dá)到0.05 ng/mL，在飼料樣品中加標(biāo)回收率高，與酶聯(lián)免疫法相比具有較好的一致性，不僅可以作為大規(guī)模樣品分析檢測(cè)的方法，同時(shí)也為建立檢測(cè)多元霉菌毒素的新型分析方法奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］BUIKLIMKE T R，WU F.Ochratoxin A and human health risk：A review of the evidence［J］.Crit Rev Food Sci Nutr，2015，55（13）：1860-1869.

［2］ 張?zhí)?，毛丹，王少敏，?赭曲霉毒素A的研究進(jìn)展［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2021，37（5）：699-705.

［3］ JECFA（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives）.Safety evaluation of certain mycotoxins in food［R］.WHO Food Additives Series 47; FAO Food and Nutrition Paper，2001：74.

［4］ 黃瑋瑋，洪軍，常娟，等.飼料中常見霉菌毒素的毒性作用及其脫毒方法的研究進(jìn)展［J］.飼料研究，2021，44（21）：145-149.

［5］ 王曉佳.飼料中常見霉菌毒素的種類及危害［J］.糧油與飼料科技，2021（3）：33-38.

［6］ 田穎.畜禽飼料霉菌毒素的危害及控制措施［J］.新農(nóng)業(yè)，2020（24）：12-13.

［7］ TESSINI C，MARDONES C，VON BAER D，et al.Alternatives for sample pretreatment and HPLC determination of Ochratoxin A in red wine using fluorescence detection［J］.Anal Chim Acta，2010，660（1/2）：119-126.

［8］ 劉娜，焦京琳，饒正華.利用色譜和質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)飼料原料及產(chǎn)品中常見霉菌毒素的研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2021，33（12）：6612-6622.

［9］ 周偉璐，王宇婷，孔維軍，等.膠體金色譜技術(shù)在赭曲霉毒素A快檢中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2015，40（15）：2945-2951.

［10］ 張景，潘姝歷，馬良，等.新型高靈敏赭曲霉毒素A間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（3）：223-230.

［11］ 高棟，陳秀金，李兆周，等.電化學(xué)傳感器在赭曲霉毒素A檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2021，47（22）：295-300.

［12］ 彭臻菲，魏碧娜，葉麗穎，等.基于核酸適配體檢測(cè)玉米中的赭曲霉毒素A［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（19）：7617-7621.

［13］ GUO X D，WEN F，ZHENG N，et al.Aptamerbased biosensor for detection of mycotoxins［J］.Front Chem，2020，8：1-19.

［14］ CHEN L，WEN F，LI M，et al.A simple aptamerbased fluorescent assay for the detection of Aflatoxin B1 in infant rice cereal［J］.Food Chem，2017，215：377-382.

［15］ YUGENDER GOUD K，HAYAT A，SATYANARAYANA M，et al.Aptamerbased zearalenone assay based on the use of a fluorescein label and a functional graphene oxide as a quencher［J］.Microchim Acta，2017，184（11）：4401-4408.

［16］ CHEN X J，BAI X J，LI H Y，et al.Aptamerbased microcantilever array biosensor for detection of fumonisin B1［J］.Rsc Advances，2015，5（45）：35448-35452.

［17］ 田風(fēng)玉，周靜，何悅，等.光學(xué)適配體傳感器在赭曲霉毒素A檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（4）：242-249，262.

［18］ WEI M，ZHANG W Y.The determination of Ochratoxin A based on the electrochemical aptasensor by carbon aerogels and methylene blue assisted signal amplification［J］.Chem Cent J，2018，12（1）：1-8.

［19］ LI Y，CHEN Q，XU X F，et al.Microarray surface enhanced Raman scattering based immunosensor for multiplexing detection of mycotoxin in foodstuff［J］.Sens Actuat B：Chem，2018，266：115-123.

［20］ 曲瑤，張亞旗，肖光，等.基于核酸堿基猝滅熒光團(tuán)的核酸適配體傳感器檢測(cè)赭曲霉毒素A［J］.分析化學(xué)，2020，48（10）：1409-1415.