線粒體自噬在糖尿病心肌病中的作用研究進展

徐挺 池菊芳 郭航遠

作者單位：310058 杭州，浙江大學醫(yī)學院（徐挺）；紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科（池菊芳）；紹興文理學院醫(yī)學院（郭航遠）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy, DCM）是Rubler 等[1]于1972 年首先發(fā)現(xiàn)并提出的一種不能用冠心病、高血壓或其他心臟疾病解釋的特異性心肌疾病。線粒體自噬是細胞降解異?；蚨嘤嗟木€粒體以糾正線粒體功能障礙，改善線粒體質(zhì)量并維持心臟穩(wěn)態(tài)的過程[2]。有效清除損傷的線粒體對于遏制活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）引起的惡性循環(huán)至關(guān)重要。生理情況下，線粒體自噬通過清除損傷的線粒體來發(fā)揮保護作用。而在DCM 的病理情況下，線粒體自噬的調(diào)控變得復(fù)雜，在1 型和2 型糖尿病中線粒體自噬可能發(fā)揮不一樣的作用，當線粒體自噬受到抑制時，異常線粒體清除不足導(dǎo)致ROS 積聚過度引發(fā)心肌細胞死亡；而線粒體自噬過度激活時又會因線粒體清除過多無法滿足心肌的能量供給。本文對線粒體自噬的分子機制及其在DCM 中的研究進展作一綜述。

1 線粒體質(zhì)量控制與線粒體自噬

線粒體作為一種雙膜細胞器，是氧化磷酸化生成ATP 的主要來源，也是脂肪酸、激素和氨基酸生物合成關(guān)鍵中間體的提供者[3]。線粒體在凋亡性細胞死亡中充當著關(guān)鍵角色，細胞在受到特定刺激后，Bcl-2 家族蛋白中的BAX、BAK 等會使線粒體外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP），從而引發(fā)致細胞死亡的級聯(lián)反應(yīng)[4]。故維持一個健康的線粒體池對于細胞的生存極為重要。迄今為止，已經(jīng)形成了多種維持線粒體質(zhì)量的機制，包括線粒體ATP 依賴的蛋白酶途徑、囊泡運輸途徑、線粒體的生物發(fā)生以及線粒體自噬[5]。與以上3 種途徑不同，線粒體自噬屬于選擇性清除損傷線粒體的巨自噬，主要負責真核生物線粒體的大量降解，在線粒體質(zhì)量控制中占據(jù)著核心地位。各種模型已經(jīng)證明，線粒體自噬受抑制或處于異常狀態(tài)均會引起受損線粒體的累積[6]。此外，線粒體自噬不單能夠通過去除損傷的線粒體，而且可以通過增加新線粒體的生物合成，來改善線粒體的質(zhì)量控制，即線粒體自噬途徑與線粒體生物合成途徑之間存在信號“串擾”[6]。例如，Shin 等[7]發(fā)現(xiàn)參與線粒體自噬的Parkin 相互作用底物PARIS/ZNF746 充當細胞核中的轉(zhuǎn)錄阻遏物，抑制線粒體生物合成重要調(diào)節(jié)劑過氧化物酶體增殖受體γ 輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha, PGC-1α）的表達?；谶@些結(jié)果，現(xiàn)在形成了一種新的觀念，即通過促進線粒體自噬可以導(dǎo)致選擇性清除受損的線粒體并同時誘導(dǎo)新的線粒體產(chǎn)生，從而改善線粒體的質(zhì)量。

2 線粒體自噬途徑的分子機制

線粒體自噬途徑與普通的自噬有許多類似的地方，大致可分為以下幾步：（1）隔離膜的起始和延伸；（2）形成包裹損傷線粒體的自噬小體；（3）自噬小體-溶酶體的融合；（4）損傷線粒體的降解。在哺乳動物中，最初的步驟包括由UNC-51 樣激酶激活BECLIN1/VPS34/VPS15 復(fù)合物。在ATG5、ATG12 和ATG16L 等自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related genes, ATGs）的輔助下，分離膜延伸，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3, MAP-1LC3）Ⅰ轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)化的MAP1LC3Ⅱ并進入分離膜。然后，MAP1LC3Ⅱ與線粒體外膜（outer mitochondrial me-mbrane,OMM）上的特定介質(zhì)或受體蛋白相互作用，標記線粒體進行降解，同時，MAP1LC3Ⅱ仍與自噬體膜相連。故MAP1LC3Ⅱ作為受損的線粒體和自噬小體之間的橋梁，促進了線粒體被自噬小體吞噬，隨后自噬小體與溶酶體融合并將線粒體運送至溶酶體中發(fā)生水解降解。在心肌細胞中，PINK1/Parkin、FUNDC1、BNIP3/NIX 和NCX 等蛋白均有表達，它們主要位于線粒體外膜上，賦予了心臟線粒體自噬的選擇性，以確保受損線粒體的清除。

2.1 線粒體自噬的PINK1-Parkin 通路 線粒體生理的多個方面包括生物發(fā)生，自噬元件的運輸和募集，都集中在PINK1-Parkin 途徑上。PINK1 是一種主要存在于線粒體外膜的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在線粒體受損或功能障礙等情況下，線粒體膜電位減弱，蛋白水解酶活性下降、降解PINK1 減少而使PINK1 在線粒體外膜上累積，形成高分子量復(fù)合物，該復(fù)合物包括了外膜轉(zhuǎn)位酶（translocase of outer membrane, TOM）復(fù)合物的成分，從而促進了Parkin 的招募[8-10]。值得注意的是，依賴PINK1 的磷酸化可改變Parkin 構(gòu)象，促進其與線粒體表面的連結(jié)并觸發(fā)其E3 連接酶活性[11]。除Parkin 外，其他幾種泛素E3 連接酶（例如Gp78、SMURF1、SIAH1、ARIH1）也在線粒體調(diào)控中起作用[12-15]，它們一旦定位于線粒體表面，就會生成泛素鏈，從而觸發(fā)自噬銜接蛋白的募集，其中包括了視神經(jīng)蛋白（optineurin, OPTN）、核點蛋白52（nuclear dot protein 52, NDP52）和p62 等。它們可以與線粒體外膜上的泛素基團和分離膜上的MAP1LC3 結(jié)合，使線粒體錨定至自噬體。此外，PINK1-Parkin 通路可通過蛋白酶體降解線粒體融合蛋白（mitofusins,MFNs）和線粒體Rho-GTP 酶來調(diào)節(jié)線粒體動力學和運動性。具體來說，PINK1-Parkin 介導(dǎo)的MFN2 降解會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位，中止線粒體的融合，使受損的細胞器與健康的線粒體網(wǎng)絡(luò)隔離，從而促進其清除[16]。這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位可能代表了線粒體自噬的關(guān)鍵位點，在關(guān)鍵位點發(fā)生PINK1-Parkin 激活和去泛素化事件。而PINK1 同樣能磷酸化線粒體Rho-GTP酶，后者能將線粒體錨定在細胞骨架上，隨后Parkin 泛素化線粒體Rho-GTP 酶，從而促進其降解并抑制線粒體運輸[17]。因此，阻斷線粒體的運輸并增強裂變可以促進線粒體自噬。

2.2 受體介導(dǎo)的線粒體自噬 到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Bnip3/Nix、FUNDC1、心磷脂（cardiolipin, CL）、禁止素2（prohibitin 2, PHB2）等與線粒體自噬相關(guān)的受體蛋白，不同的受體確保了在不同組織中以及在不同刺激之后該過程的特異性。

2.2.1 Bnip3/Nix 介導(dǎo)的線粒體自噬 Bnip3/Nix 屬于Bcl-2 家族蛋白，主要定位于細胞內(nèi)膜如線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是一種非典型的BH3-only 蛋白。Bnip3/Nix 在正常生理條件下表達量很低，而在缺氧等應(yīng)激情況下表達上升[18]。Bnip3 蛋白能夠通過抑制PINK1水解等機制來促進線粒體自噬[19]，這表明線粒體受體與PINK1-Parkin 通路之間存在著信號“串擾”。Marinkovi? 等[20]發(fā)現(xiàn)Bnip3/Nix 的二聚體化和LIR 基序磷酸化有利于線粒體自噬的起始和進展，從而保護線粒體質(zhì)量。

2.2.2 FUNDCl 介導(dǎo)的線粒體自噬 FUNDC1 是Liu等[21]于2012 年發(fā)現(xiàn)的一種由155 個氨基酸組成的哺乳動物細胞線粒體外膜受體蛋白，主要介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬。在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)UNDC1 的Tyr18 和Ser13 分別被Src 激酶和CK2 磷酸化，磷酸化的FUNDC1 與MAP1LC3 的親和力較低；而在低氧應(yīng)激或線粒體膜電位下降時，PGAM5 磷酸酶使FUNDC1 的Ser13 發(fā)生去磷酸化并增強與MAP1LC3 的相互作用，引起線粒體自噬[22]。此外，Chen 等[23]觀察到FUNDC1的去磷酸化促進了FUNDC1 與視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1（optic atrophy 1, OPA1）的解離以及與動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1, DRP1）的結(jié)合，以調(diào)節(jié)線粒體融合、裂變與線粒體自噬。

2.2.3 CL 介導(dǎo)的線粒體自噬 在健康的線粒體中，CL位于線粒體內(nèi)膜，當受到促線粒體自噬刺激時會從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，并與MAP1LC3 的CL 結(jié)合位點結(jié)合，促進自噬系統(tǒng)吞噬線粒體[24]。對于CL 的轉(zhuǎn)位機制，Kagan 等[25]發(fā)現(xiàn)了六聚體膜間隙蛋白核苷二磷酸激酶D（nucleoside diphosphate kinase,NDPK-D）能結(jié)合CL 并促使其向線粒體外膜的重新分布。CL 還可以通過OPA1 的分解和釋放以促進DRP1 在線粒體表面的募集來改善線粒體動力學[26]。

2.2.4 PHB2 介導(dǎo)的線粒體自噬 PHB2 是一種高度保守的膜支架蛋白，最近被視為能夠介導(dǎo)線粒體自噬的新型線粒體內(nèi)膜受體[27]，當線粒體外膜在蛋白酶體作用下斷裂時，PHB2 能外移并與MAP1LC3 相互作用。Yan 等[28]的最新研究表明，PHB2-PARL-PGAM5-PINK1 軸是PHB2 介導(dǎo)的線粒體自噬的新通路。PHB2消耗會使線粒體內(nèi)膜蛋白酶PARL 激活以裂解絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PGAM5，使線粒體中的PINK1不穩(wěn)定，從而阻礙Parkin、泛素和OPTN 的募集，導(dǎo)致線粒體自噬被抑制。

2.3 線粒體自噬與異噬的協(xié)調(diào)途徑 心臟駐留巨噬細胞（cardiac resident microphages, cMacs）分布在整個心臟中，發(fā)揮著超越免疫和感染控制的多方面作用，近年來表明它能夠調(diào)節(jié)異噬與自噬的活動來維持心肌細胞線粒體的穩(wěn)定性。Nicolás-ávila 等[29]發(fā)現(xiàn)每個心肌細胞周圍平均有5 個cMacs，且每個cMac 可以與多達5 個心肌細胞相互作用。他們利用CD169DTR小鼠清除了心臟中的cMacs，觀察到一種被稱為exopher 的轉(zhuǎn)移囊泡在細胞外積累導(dǎo)致了NLRP3 炎性小體的激活，進而抑制線粒體自噬，最終又會使exopher 外移逐漸減少。而通過敲除Atg7 及應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素分別減少和增加了exopher 的產(chǎn)生及線粒體的轉(zhuǎn)移以供cMacs 吞噬。值得注意的是，Nicolás-ávila 等[29]進一步發(fā)現(xiàn)了酪氨酸激酶受體Mertk 介導(dǎo)了該吞噬作用。

3 線粒體自噬與DCM

糖尿病的心血管并發(fā)癥是糖尿病患者病情加重和死亡的主要原因之一，這些并發(fā)癥包括DCM（其特征是左心室重構(gòu)）和無冠心病的心力衰竭[30]。有證據(jù)表明，糖尿病的心血管并發(fā)癥集中在線粒體是因為它是心臟心肌損傷的“震中”[31]。由于目前糖尿病患者與非糖尿病患者的心肌病治療方法幾乎沒有區(qū)別[32]，因此重要的是找到針對這種病因或發(fā)病機制的特定治療方法。

3.1 1 型和2 型糖尿病心臟中的線粒體自噬 如前所述，心臟使用的大部分能量都來自線粒體中的脂肪酸氧化。在糖尿病心臟中，葡萄糖利用減少，脂肪酸成為主要的能量來源，從而產(chǎn)生更高水平的氧化應(yīng)激并可能引起線粒體損傷或功能障礙。受損的線粒體釋放的ROS 和死亡誘導(dǎo)因子也會增加心肌細胞的損傷[33-34]。在單次大劑量鏈脲佐菌素（streptozocin, STZ）誘導(dǎo)的1 型糖尿病背景下，心臟組織中自噬的幾個核心成分如MAP1LC3、ATG5 和ATG12 的水平降低[35]。同時，PINK1 和Parkin 蛋白水平均降低，但BNIP3 水平保持不變，表明了1 型糖尿病模型中特定的線粒體自噬信號改變[35-37]。這一發(fā)現(xiàn)提示盡管有廣泛的線粒體功能障礙，但DCM 中的特定線粒體自噬信號會減少，導(dǎo)致功能障礙線粒體在心臟水平的積聚，并加劇了對心臟的損害。然而，在2 型糖尿病的背景下，已經(jīng)報道了相反的觀察結(jié)果：在接受了高脂飲食的小鼠中，心肌細胞自噬流最初會增加，但在2 個月后會降低；同時，Mito-Keima 信號和定位到線粒體的MAP1LC3Ⅱ增加，這表明高脂飲食后線粒體自噬增加[38]。此外，刪除ATG7 或Parkin 會導(dǎo)致應(yīng)對高脂飲食的線粒體自噬受損以及心臟舒張功能障礙加重，而Beclin1 過表達則有相反的效應(yīng)[38]。該證據(jù)指出了在肥胖相關(guān)的DCM 中自噬和線粒體自噬的保護性作用。綜合以上結(jié)果，可推斷線粒體自噬在DCM 的1 型糖尿病模型中被抑制而在2 型糖尿病模型中被激活。

3.2 影響線粒體自噬的DCM 的治療 糖尿病和DCM有多種治療方案可供選擇，其中一些療法可影響線粒體自噬狀態(tài)，下面重點總結(jié)近幾年研究較熱門的幾種藥物。

3.2.1 鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運體2 抑制劑（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors, SGLT2i）恩格列凈是一種SGLT2i，其除了降血糖作用之外，還具有心臟保護作用。Zhou 等[39]的研究表明，恩格列凈可能通過激活MAPK，限制Drp1 的活化，抑制糖尿病誘導(dǎo)的線粒體裂變，進而使線粒體自噬受到抑制。一方面，恩格列凈誘導(dǎo)的裂變減少可能通過抑制線粒體ROS 的氧化應(yīng)激使心臟微血管內(nèi)皮細胞（cardiac microvascular endothelial cells,CMECs）的活性和屏障功能得到改善；另一方面，由于F-肌動蛋白的穩(wěn)態(tài)作用，恩格列凈誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移可能促進血管生成。

3.2.2 尿石素（Urolithin, U）A 和B UA 是存在于石榴等水果和堅果中的鞣花單寧經(jīng)腸道菌群產(chǎn)生的一種天然代謝產(chǎn)物，已在線蟲和小鼠等多個模型中證明了其線粒體自噬作用。周友等[40]的研究發(fā)現(xiàn)，UA 治療可明顯提高糖尿病小鼠心臟中與線粒體結(jié)合的p62 及MAP1LC3Ⅱ含量，促進線粒體與溶酶體融合，使細胞內(nèi)極性受損線粒體含量降低，改善了心臟舒張功能障礙、減少了間質(zhì)膠原蛋白沉積。而在使用線粒體自噬抑制劑Mdivi-1 后，上述效果被逆轉(zhuǎn)，表明線粒體自噬介導(dǎo)了UA 的保護作用。另外，Savi 等[41]的研究表明，體內(nèi)UA 和UB 治療可以降低心肌中約30%促炎癥細胞因子Fractalkine 的表達，并且可以預(yù)防糖尿病大鼠高血糖3 周后器官和細胞分子水平上出現(xiàn)心功能障礙的早期體征。

3.2.3 褪黑素 褪黑素是一種主要在腦松果體分泌的吲哚類激素，因調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、改善睡眠而被人熟知，近年來有望成為治療糖尿病的藥物。Wang 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠促進線粒體自噬改善DCM 的損傷。實驗中，褪黑素增強了高糖處理組心肌細胞MAP1LC3Ⅱ的表達以及線粒體與溶酶體的共定位，并且能抑制Mst1 的磷酸化，而敲除Parkin 基因則抵消了褪黑素對糖尿病心肌線粒體形態(tài)和能量代謝的有益作用。這些結(jié)果表明，褪黑素通過抑制Mst1 增強Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬來改善DCM。Yu 等[42]則證明長期的褪黑素治療通過改善線粒體質(zhì)量控制，延緩DCM 的進展，降低了心肌對缺血再灌注損傷的敏感性。褪黑素膜受體介導(dǎo)的SIRT6-AMPK-PGC-1α-AKT 軸在這一過程中起到了關(guān)鍵作用。

4 小結(jié)

DCM 的機制目前仍未明確闡明，而線粒體自噬能通過清除異常的線粒體、減少ROS 惡性循環(huán)等參與DCM 的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。未來相關(guān)機制如受體介導(dǎo)的線粒體自噬、cMacs 協(xié)調(diào)清除受損線粒體的進一步闡明和影響線粒體自噬狀態(tài)藥物的揭示將有望為糖尿病及其DCM 的防治帶來新的靶點和針對性治療方案。