于文強

2023年4月28日，全癌標(biāo)志物在尿路上皮癌檢測中的應(yīng)用獲得美國食品和藥物管理局（FDA）突破性醫(yī)療器械認證。這是我從2013年首次發(fā)現(xiàn)全癌標(biāo)志物以來最開心的一天，這十年間每當(dāng)我在不同場合講解全癌標(biāo)志物時，面對別人疑惑的表情以及各種靈魂拷問，我像一個做錯事的小孩。我清楚地知道發(fā)再多的文章，做再多的宣講，不如用全癌標(biāo)志物解決一個臨床實際問題，用臨床真實鮮活的案例來證明一切！我不再糾結(jié)于別人是否相信全癌標(biāo)志物，我要做的是找到更多的合作者，讓全癌標(biāo)志物得到更多的應(yīng)用?；叵肫鹑?biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和我的探索歷程，不禁感慨萬千：看過去，云卷云舒；看未來，風(fēng)輕云淡；自古尋常事，談笑一揮間！

時光倒回40年

1983年，我還是陜西鄠縣的一個農(nóng)家小伙，背著行囊走向心中神往的第四軍醫(yī)大學(xué)；而在地球的另一邊，腫瘤甲基化研究也緩緩掀開序幕。約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的范伯格（A. Feinberg）教授在《自然》（Nature）雜志發(fā)表文章，在腫瘤樣本中意外發(fā)現(xiàn)了全基因組的DNA低甲基化現(xiàn)象，第一次將DNA甲基化和腫瘤聯(lián)系起來，開創(chuàng)了DNA甲基化在腫瘤研究領(lǐng)域的先河[1]。

1984年，約翰·霍普金斯大學(xué)的拜林（S. Baylin）教授發(fā)現(xiàn)抑癌基因的啟動子區(qū)域存在高甲基化現(xiàn)象，并提示該區(qū)域的高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因在腫瘤中沉默的重要原因。此后，啟動子區(qū)域高甲基化理論在腫瘤甲基化研究領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位，而范伯格發(fā)現(xiàn)的腫瘤存在全基因組DNA低甲基化現(xiàn)象則被束之高閣。全基因組是低甲基化還是局部的高甲基化，到底哪個理論更接近真理？直到1998年，范伯格發(fā)表文章，揭示了全基因組DNA低甲基化導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，進而參與腫瘤的發(fā)生。其實，他們的研究結(jié)果都是對的，腫瘤的發(fā)生中既存在局部區(qū)域的高甲基化，也存在全基因組范圍的低甲基化?？茖W(xué)就是這樣有趣，在百家爭鳴中發(fā)展，在百花齊放中進步。

一邊是火焰，一邊是海水

腫瘤DNA甲基化研究已經(jīng)走過40個年頭，然而DNA甲基化研究和甲基化的應(yīng)用可以說是冰火兩重天?；鹧媸侵冈趯嶒炇一蛘咛囟l件下，DNA甲基化檢測能夠獲得很好的檢測效率和漂亮的研究數(shù)據(jù)，研究者的熱情和信心像火焰一樣；而在臨床應(yīng)用端，甲基化檢測與臨床的符合率卻比較低，就像澆在頭頂上的一盆盆冰冷的海水。好在DNA甲基化研究領(lǐng)域還有一位標(biāo)桿性人物，他就是美國南加州大學(xué)的瓊斯（P. Jones）教授，他將DNA甲基化酶抑制劑作為藥物用于骨髓增生異常綜合征的臨床治療，取得了不錯的效果。同時，瓊斯也是Septin9的發(fā)現(xiàn)者，可以說他的研究成果一定程度緩解了DNA甲基化在腫瘤應(yīng)用研究方面的尷尬。

千里之行，始于足下

從1983年進入大學(xué)，我花了6年時間拿到了醫(yī)學(xué)本科學(xué)位，畢業(yè)后留在西京醫(yī)院血液科從事臨床工作，主要是白血病的診斷與治療。從1989年到2001年，我的主業(yè)是一名臨床醫(yī)生，工作期間拿到了碩士和博士學(xué)位?？墒牵呀?jīng)博士畢業(yè)的我常常陷入苦惱，當(dāng)時的診療手段對血液腫瘤患者常常毫無辦法，只能看著患者的生命逐漸枯萎。我不甘心就這樣束手無策，現(xiàn)有的醫(yī)療技術(shù)沒有辦法解決問題，我就去探索新的方法！懷著這樣的心情，我以36歲的“高齡”走上了出國留學(xué)的道路。

2001年11月，我?guī)煆娜鸬錇跗账_拉大學(xué)的奧爾松（R. Ohlsson）教授，就此陰差陽錯地踏入表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域。彼時還沒多少人知道表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）。我在瑞典的實驗室從事ChIP-on-Chip [將染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）及與芯片方法（chip）結(jié)合，是一種研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的高通量技術(shù)。]的應(yīng)用研究，用于尋找CTCF（廣泛存在于真核生物中的多功能轉(zhuǎn)錄因子）的基因結(jié)合靶位點。我們成功地將ChIPon-Chip技術(shù)用于CTCF靶位點的尋找，之后我們嘗試做MeDIP（methylated DNA immunoprecipitation），就是用甲基化的抗體來富集甲基化區(qū)域[2]。

如何更好地將DNA甲基化應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷，成為DNA甲基化研究領(lǐng)域的重要問題。之后，找出其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就成了我的目標(biāo)。

時光倒回20年

論如何做一個出色的 “科學(xué)殺手”

2003年底，我離開烏普薩拉大學(xué)來到約翰·霍普金斯大學(xué)范伯格的實驗室做博士后，繼續(xù)從事表觀遺傳學(xué)研究。作為DNA甲基化研究奠基人的范伯格，招收學(xué)生是極其嚴(yán)苛的，我在瑞典實驗室相關(guān)的研究結(jié)果和掌握的實驗技術(shù)，為我后續(xù)在范伯格的實驗室繼續(xù)從事表觀遺傳學(xué)研究打下了良好的基礎(chǔ)。

還記得進入實驗室后，第一次和范伯格交流時，他問了我一個問題：一個出色的士兵在戰(zhàn)場上該如何殺死對手？他說你可以用刀，也可以用槍，你可以打傷他的胳膊或大腿，讓敵人流血而死；而一個優(yōu)秀的士兵應(yīng)該直擊對手要害，快速致對手于死地。稍后，他又一本正經(jīng)地告訴我，慢悠悠地殺死對手的方式就讓別人去做吧，我們要做的事情，就是一刀斃命！看到我驚訝的表情，他說你慢慢會懂得做事情的正確方式。我驚訝于他的直截了當(dāng)，他用一個非常簡單而又非同尋常的方式告訴我，每一個人的時間都是有限的，我們要做科學(xué)領(lǐng)域最重要的事情，解決最關(guān)鍵的問題。

博觀而約取，厚積而薄發(fā)

我在范伯格的實驗室繼續(xù)從事DNA甲基化相關(guān)的工作。一方面，我想優(yōu)化經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA甲基化檢測方法和方案；另一方面，我希望能夠使用其他化學(xué)試劑代替重亞硫酸鹽處理進行DNA甲基化檢測。焦磷酸測序是DNA甲基化定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)時焦磷酸測序儀開始被投放用于DNA甲基化檢測，范伯格的實驗室就有一臺在試用，許多DNA甲基化檢測的方案和方法的優(yōu)化也在這里完成，我們在DNA甲基化檢測領(lǐng)域做了非常多的方法學(xué)的優(yōu)化工作。同時，我也嘗試解決一些腫瘤DNA甲基化領(lǐng)域重要的科學(xué)問題。我們發(fā)現(xiàn)P15基因區(qū)的反義核酸是誘導(dǎo)DNA甲基化最重要的原因，揭示了P15基因的甲基化是如何發(fā)生的，以及它在白血病發(fā)生過程中是如何被沉默的[3]。我在范伯格實驗室學(xué)到的最重要的東西就是先解決問題，再發(fā)表文章。如果要解決問題，就要解決最關(guān)鍵的科學(xué)問題。

時光倒回15年

看似尋常最奇崛，成如容易卻艱辛

2008年初，我回到復(fù)旦大學(xué)任教，繼續(xù)從事表觀遺傳學(xué)研究。我以首席科學(xué)家的身份領(lǐng)銜了表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的第三個973項目“染色質(zhì)解碼的基礎(chǔ)及醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究”，著手解決一些DNA甲基化領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。但是，我發(fā)現(xiàn)了一個不容忽視的問題，國外表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究進展非?？?，而國內(nèi)大多數(shù)從本科進入研究生階段的學(xué)生，表觀遺傳學(xué)的相關(guān)理論和實驗技能都非常欠缺。如果我們對表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的一個熱點感興趣，等我們深入探究、得出成果起碼得5年以后，到那時這些研究成果可能早就被其他人發(fā)表了。所以，我定下規(guī)矩，我們實驗室的研究絕不跟著熱點走。我們要么做別人不做的問題，要么將別人做不到的方法、技術(shù)進行優(yōu)化。只有這樣，我們才能超越別人。同時，作為一名臨床醫(yī)生出身的科研工作者，我們必須從解決問題入手，解決臨床的問題，解決醫(yī)生的問題。

千淘萬漉雖辛苦，吹盡狂沙始到金

2010年，二代測序剛剛興起，我想找一些線粒體DNA甲基化方面的資料，發(fā)現(xiàn)居然沒有線粒體DNA甲基化的圖譜。后來我才明白，當(dāng)時的甲基化檢測技術(shù)對于全基因組甲基化位點的覆蓋遠遠不足。人體大約有2800萬個CG位點，常用的450K芯片僅能覆蓋約1%的CG位點。之后出現(xiàn)的全基因組甲基化測序（WGBS），其測序數(shù)據(jù)的有效利用率也僅在50%左右。為什么WGBS技術(shù)會造成如此高比例的數(shù)據(jù)浪費？因為WGBS技術(shù)使用重亞硫酸鹽處理DNA片段，造成基因組的復(fù)雜度大幅下降，導(dǎo)致檢測信息丟失。針對重亞硫酸鹽處理導(dǎo)致的比對率降低的技術(shù)瓶頸，我們研發(fā)了不降低基因組復(fù)雜度的全新的全基因組 DNA 甲基化測序技術(shù)GPS （guide positioning sequencing），即“導(dǎo)航定位測序”[4]。GPS技術(shù)可以覆蓋全基因組96%的胞嘧啶（C），基于該DNA甲基化檢測方案，我們繪制出迄今為止覆蓋率最高的全基因組DNA甲基化圖譜。尤其是在比較正常細胞和腫瘤細胞的甲基化差異位點時，我們可以獲得別人無法捕獲的信息，進而看到別人看不到的東西，破解別人發(fā)現(xiàn)不了的規(guī)律。

1983年，范伯格在腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)了全基因組的DNA低甲基化現(xiàn)象，而GPS測序在30年后以更加精確的技術(shù)揭示了腫瘤細胞與正常細胞在全基因組DNA甲基化中的差異。學(xué)生開發(fā)的測序技術(shù)驗證老師30年前的甲基化理論，這是學(xué)生對老師的致敬，也是后輩科研工作者站在巨人的肩膀上觸摸星辰?？蒲锌偸菄?yán)謹(jǐn)?shù)?，有邏輯的，但是這一切好像冥冥之中自有安排，緣分妙不可言。

時光倒回10年

千磨萬擊還堅勁，任爾東西南北風(fēng)

2013年初，我們突發(fā)奇想，想要探索在肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)的DNA甲基化位點是否可以在其他8種腫瘤細胞中得到驗證。令人驚喜的是，我們發(fā)現(xiàn)了一個DNA甲基化位點竟然在8種腫瘤細胞中都呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài)。這時，我作為一名臨床醫(yī)生的經(jīng)驗派上了用場，如果這個甲基化標(biāo)志物在臨床樣本中檢測結(jié)果為陰性，至少可以排除這8種腫瘤的可能性。迄今為止，這個甲基化位點已經(jīng)在25種腫瘤中得到了驗證。至于其他幾種腫瘤，因非常罕見，我們無法找到樣本，并且國際腫瘤數(shù)據(jù)庫中也沒有相關(guān)信息。因此，我們將這些腫瘤共有的甲基化位點命名為“全癌標(biāo)志物（universal cancer only marker， UCOM）”，意味著它是存在于所有腫瘤中的標(biāo)志物[5]。

在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，只要存在共同的特征，就會有共同的表觀遺傳學(xué)規(guī)律。如果我們將腫瘤視為人體的一種另類器官，那么不同類型的腫瘤共享一些甲基化特征就不難理解。我們知道任何事物都有共性和個性，腫瘤也不例外，只是近年來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展讓我們對腫瘤的異質(zhì)性有了更深刻的認識。但不能因為目前研究異質(zhì)性的更多，就否認腫瘤共性的存在。我清楚地記得，2019年我們發(fā)表第一個全癌標(biāo)志物時，《癌癥研究》（Cancer Research）雜志的審稿人問了一個尖銳的問題：許多甲基化領(lǐng)域的專家都在尋找腫瘤共有的標(biāo)志物，為什么其他人都沒找到全癌標(biāo)志物，而你們找到了呢？我只能回答說，因為我們擁有GPS技術(shù)，可以覆蓋全基因組96%的CG位點，能夠看到別人看不到的東西。

蘋果砸在牛頓頭上，牛頓發(fā)現(xiàn)了萬有引力定律。然而，萬有引力定律的存在與牛頓的發(fā)現(xiàn)無關(guān)，萬有引力在牛頓發(fā)現(xiàn)之前就存在，在他發(fā)現(xiàn)之后仍然存在。全癌標(biāo)志物也是如此，它的存在是客觀的。實際上，驗證全癌標(biāo)志物只需要對腫瘤樣本進行雙盲測試。事實勝于雄辯，實踐出真知。

時光倒回5年

路漫漫其修遠兮，吾將上下而求索

作為一名擁有十幾年臨床經(jīng)驗的醫(yī)生，我明白實驗室檢測和臨床應(yīng)用之間存在巨大的差別。為了全癌標(biāo)志物能夠在臨床上應(yīng)用，我們需要建立一種非常穩(wěn)定的可重復(fù)的DNA甲基化檢測方法。然而，正如之前所述，現(xiàn)有的使用重亞硫酸鹽處理來檢測DNA甲基化的方法存在諸多問題。因此，我們必須對該方法進行優(yōu)化，尤其是去除重亞硫酸鹽處理這一步驟。qPCR通常用于基因表達的定量檢測，該方法簡單、方便、成本低廉，是進行DNA甲基化檢測的最佳選擇。但是，在國際上還沒有人嘗試使用qPCR進行不經(jīng)過重亞硫酸鹽處理的甲基化定量檢測。從2018年開始，我們用了4年的時間來優(yōu)化甲基化檢測方法，并將其稱為Me-qPCR（methylation quantitative PCR）技術(shù)。該技術(shù)能夠定量檢測DNA甲基化，實現(xiàn)DNA甲基化檢測的標(biāo)準(zhǔn)化、流程化和自動化。

目前，全癌標(biāo)志物研究聯(lián)盟已經(jīng)完成了8萬多例臨床樣本的甲基化雙盲檢測，驗證了基于全癌標(biāo)志物的Me-qPCR技術(shù)在DNA甲基化檢測方面的巨大優(yōu)勢。在大量臨床樣本的檢測和驗證中，我們逐漸發(fā)現(xiàn)全癌標(biāo)志物的一些特點。第一，全癌標(biāo)志物具有“全”或“無”的特點，即正常組織中無全癌標(biāo)志物甲基化異常，而在腫瘤組織中存在該標(biāo)志物的高甲基化。切莫小看這個特點，正常組織不會出現(xiàn)全癌標(biāo)志物甲基化異常，所以當(dāng)患者樣本中檢測到全癌標(biāo)志物異常，就認為該樣本中存在惡性細胞。第二，全癌標(biāo)志物是一個惡性腫瘤標(biāo)志物。這一點非常重要，許多傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物并非專屬于惡性腫瘤細胞，它們的檢出率易受機體其他因素影響。第三，全癌標(biāo)志物異常早于病理細胞形態(tài)學(xué)變化，這代表著全癌標(biāo)志物能在“前癌”階段檢測腫瘤。盡管目前國際上還沒有公認的腫瘤超早期標(biāo)志物，但我認為全癌標(biāo)志物具備這樣的潛力，可以實現(xiàn)腫瘤的超早期診斷。如果將全癌標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤的早期檢測，并制定有效的篩查方案，我們可以在腫瘤發(fā)展初期將其扼殺在萌芽階段，最終實現(xiàn)讓每個人遠離癌癥的目標(biāo)。

時光倒回1年

莫愁前路無知己，天下誰人不識君

2022年，我們公布了第三個全癌標(biāo)志物——SIX6基因[6]。從表觀遺傳學(xué)的角度出發(fā)，我們賦予全癌標(biāo)志物更多的特點。例如，全癌標(biāo)志物所在的基因通常在正常和腫瘤組織中都不表達。而且，這些基因大部分在文獻中很少與腫瘤相關(guān)聯(lián)，這表明全癌標(biāo)志物在腫瘤發(fā)病機制方面與現(xiàn)有理論存在差異。我敢大膽推測，全癌標(biāo)志物背后隱藏著一種全新的腫瘤發(fā)病機制，超越了我們目前腫瘤發(fā)病機制研究的范疇。

此外，全癌標(biāo)志物的相關(guān)概念、特征和理念已經(jīng)獲得越來越多人的認可，并且我們已經(jīng)與更多醫(yī)院和醫(yī)生展開了合作。第三個全癌標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)讓更多人認識到在婦科腫瘤以外的其他腫瘤中，全癌標(biāo)志物也具有優(yōu)異的檢測效能。全癌標(biāo)志物已經(jīng)成功應(yīng)用于宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和尿路上皮癌等腫瘤的臨床檢測，并且我們已經(jīng)與超過50家醫(yī)院以及100多位知名臨床專家展開了合作。相信不久的將來，全癌標(biāo)志物會成為研究領(lǐng)域的熱門話題。

時光倒回半年

獨立千秋萬古存，創(chuàng)造傳世顯英雄

2022年11月到12月期間，全癌標(biāo)志物研究聯(lián)盟參加了由科技部舉辦的全國顛覆性創(chuàng)新大賽，大賽共有2800個項目參與，涵蓋了各個高新技術(shù)領(lǐng)域，包括半導(dǎo)體芯片、智能制造和生物醫(yī)藥等。該比賽要求創(chuàng)新項目必須具備改變游戲規(guī)則的特質(zhì)。2022年11月23日，在蘇州高新區(qū)進行的第一輪答辯中，全癌標(biāo)志物以五票全通過的成績順利晉級復(fù)賽。2023年2月24日，在杭州舉行的總決賽中，全癌標(biāo)志物獲得了最高獎項——優(yōu)勝獎，在所有參賽項目中，獲得優(yōu)勝獎的概率不到2%，全癌標(biāo)志物也是整個大賽中體外診斷（IVD）領(lǐng)域唯一的優(yōu)勝獎。在顛覆性創(chuàng)新大賽的總結(jié)發(fā)言中，我說：“有人說，這世界上本沒有路，走的人多了，就成了路?！笔聦嵣?，走一條別人未曾走過的道路是相當(dāng)艱辛的，我們需要克服各種困難，付出超出常人的努力。但不論別人相信與否，我們的目標(biāo)是將解決問題置于首位。我們要與更多的人合作，將全癌標(biāo)志物推廣至全國乃至全世界，為大眾和社會提供服務(wù)。

當(dāng)前，卡脖子技術(shù)成了熱議的話題，而我們現(xiàn)在解決“卡脖子”問題的方法是破解他人的卡脖子技術(shù)。然而，當(dāng)我們破解他人的技術(shù)時，別人并沒有停下腳步，反而研發(fā)出更多的卡脖子技術(shù)。那我們何時才能超越呢？我認為，最好的破解卡脖子技術(shù)的方法是我們也擁有“卡住別人脖子”的技術(shù)。只有做到技術(shù)反制，我們才能真正挺直腰桿，不再被他人卡脖子。

時光倒回3個月前

風(fēng)正海闊千帆競，百尺竿頭再攀登

2023年4月28日，一個重要的時刻?；谌?biāo)志物的尿路上皮癌檢測試劑盒獲得了美國FDA突破性醫(yī)療器械認證。對于全癌標(biāo)志物來說，這是獲得國際認可的第一步。我們堅信，憑借全癌標(biāo)志物獨有的卓越性能以及我們自主研發(fā)的檢測方案和方法，必將實現(xiàn)全癌標(biāo)志物的廣泛應(yīng)用。真正的黃金總會閃耀光芒，而真金從不懼火煉。我們將以更新的技術(shù)和方案，實現(xiàn)腫瘤的早期診斷、療效評估和預(yù)后判斷的全流程監(jiān)測。我們有信心，將腫瘤診療推向新的階段，讓我們的人民不再為癌癥而心生恐懼！

陜西有一句俗語，叫做“豬沒了，樓上找”，本意是形容一些不會做事的傻瓜。我們做研究的，應(yīng)該勇于干一些“傻事”。換句話說，如果你按照別人的思路行事，你是無法解決顛覆性問題的。解決問題的關(guān)鍵是采用超常規(guī)思維、非常規(guī)技術(shù)，只有這樣，我們才能真正超越自己。

展望未來

我們已經(jīng)成立了全癌標(biāo)志物研究聯(lián)盟，希望更多的臨床醫(yī)生和基礎(chǔ)研究者加入研究聯(lián)盟，將全癌標(biāo)志物應(yīng)用于不同腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷。此外，全癌標(biāo)志物參與腫瘤發(fā)生的分子機制也是重要的科學(xué)問題，當(dāng)我們弄清楚所有腫瘤的發(fā)病機制時，也許能夠為腫瘤找到全新的治療方法和策略。而在未來十年，我們的目標(biāo)是讓更多國家和人民因全癌標(biāo)志物的應(yīng)用而獲益，并為他們的生活帶來新的機遇。全癌標(biāo)志物，大有可為，未來可期！

[1]Feinberg AP， Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature， 1983， 301： 89-92.

[2]Yu W， Ginjala V， Pant V， et al. Poly（ADP-ribosyl）ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation. Nature Genetics， 2004， 36（10）： 1105-1110.

[3]Yu W， Gius D， Onyango P， et al. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene P15 by its antisense RNA. Nature， 2008， 451： 202-206.

[4]Li J， Li Y， Li W， et al. Guide positioning sequencing identifies aberrant DNA methylation patterns that alter cell identity and tumor-immune surveillance networks. Genome Res， 2019， 29： 270-280.

[5]Dong S， Li W， Wang L， et al. Histone-related genes are hypermethylated in lung cancer and hypermethylated HIST1H4F could serve as a pan-cancer biomarker. Cancer Res， 2019， 79： 6101-6112.

[6]Dong S， Yang Z， Xu P， et al. Mutually exclusive epigenetic modification on SIX6 with hypermethylation for precancerous stage and metastasis emergence tracing. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2022， 7： 208.

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