陳歡+巨少華+魏江平+付文君+鄭航+徐世軍

[摘要]考察濕熱環(huán)境下熱痹模型大鼠特征性甲基化基因及白虎加桂枝湯對(duì)熱痹特征性甲基化基因的調(diào)控作用。采用大鼠足底注射CFA并復(fù)合濕熱環(huán)境制備熱痹大鼠模型。造模后第15天給予白虎加桂枝湯干預(yù)治療30 d。造模后每隔4 d檢測(cè)足容積，第45天采用HE染色法檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)，MeDIPSeq測(cè)序法檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜甲基化水平并以取差集的方法篩選熱痹模型特征性甲基化基因，懸浮芯片檢測(cè)血清中IL1β，IL17，TNFα，EGF，IL12p70，IL4，IL6及IFNγ含量水平，qRTPCR檢測(cè)大鼠滑膜特征性甲基化基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與完全弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）模型組比較，熱痹模型組足腫脹度和病理嚴(yán)重程度僅輕微增加；與空白組比較，2個(gè)模型組全基因CpG島均呈低甲基化狀態(tài)，熱痹模型組甲基化水平最低，且AA模型組共705個(gè)差異性甲基化基因，熱痹模型組共2 418個(gè)差異性甲基化基因；與AA模型組比較，熱痹模型組存在1 287個(gè)差異性甲基化基因，其中共974個(gè)差異性基因甲基化下調(diào)，這些差異性基因顯著分布于32個(gè)KEGG Pathway中（P<005），此外啟動(dòng)子區(qū)上熱痹特征性甲基化基因共52個(gè)，其中36個(gè)甲基化下調(diào)基因，16個(gè)甲基化上調(diào)基因；藥物干預(yù)后，白虎加桂枝湯顯著改善熱痹模型組足腫脹度和病理?yè)p傷，且明顯降低IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17，IL12p70的含量水平（P<005），還能抑制熱痹特征性甲基化下調(diào)基因Ahcy及Rpl3 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)熱痹特征性甲基化上調(diào)基因Agxt mRNA的表達(dá)水平?？梢?jiàn)，熱痹模型滑膜基因存在獨(dú)特的甲基化水平變化，而白虎加桂枝湯可能針對(duì)性回調(diào)熱痹特征性基因的甲基化水平，達(dá)到治療熱痹的作用。

[關(guān)鍵詞]熱痹； DNA甲基化； 濕熱環(huán)境； 白虎加桂枝湯

Effect of Baihu Guizhi decoction on characteristic methylation genes

expression of pyretic arthralgia rat model

CHEN Huan1，2， JU Shaohua1，2， WEI Jiangping1，2， FU Wenjun1，2， ZHENG Hang1，2， XU Shijun1，2*

（1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；

2 Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine Resources in Sichuan Province，

Chengdu 611137， China）

[Abstract]To investigate the characteristic methylation genes of pyretic arthralgia model in hot and dampness environment and the regulation effect of Baihu Guizhi decoction on this characteristic methylation genes Plantar injection of CFA was used in hot and dampness environment to induce the pyretic arthralgia rat models From 15th day after modeling， Baihu Guizhi decoction was given for 30 days Foot volume was detected every 4 days after modeling， and HE staining was used to detect the histopathology of all rats′ ankle joint at day 45MeDIPSeq sequencing method was used to detect the methylation level of knee joint synovial， and the method of difference sets was used to screen the characteristic methylation genesinpyretic arthralgia modelsThe contents of IL1β， IL17， TNFα， EGF， IL12p70， IL4， IL6 and IFNγ in serum were measured by using suspension chips The mRNA expression level of characteristic methylation genes was measured by qRTPCR The results suggested that as compared with adjuvant arthritis rat models（AA）， the foot swelling and histopathology inpyretic arthralgia models （PA） were only slightly increased As compared with normal group （NG）， the wholegenome CpG island in both AA and PA groups was kept in a lower methylation state， furthermore， the methylation level was lowest in PA group； with 705 difference methylation genes in AA group and 2 418 difference methylation genes in PA group As compared with AA， there were 1 287 difference methylation genes， including 974 downregulated methylation genesand 313 upregulated methylation genes This difference methylation genes were mostly enriched in 32 KEGG pathways Moreover， there were 52 characteristic methylation genes of PA models in promoter region， including 36 downregulatedmethylation genes and 16 upregulatedmethylation genes After drug intervention， Baihu Guizhi decoction improved the foot swelling and pathological injury in PA models， significantly decreased the levels of IL1β， TNFα， EGF， VEGF， IL17， IL12p70， inhibited the mRNA expression levels of downregulated methylation genes AHCY and RPL3， and promoted the mRNA expression levels of upregulated methylation gene Agxt In conclusion， unique methylation changes of synovial genes were present in PA models， and Baihu Guizhi decoction may adjust the methylation level of PA′s characteristic methylation genes to achieve the therapeutic effect of pyretic arthralgia

[Key words]pyretic arthralgia； DNA methylation； hot and dampness environment； Baihu Guizhi decoction

痹證是中醫(yī)臨床常見(jiàn)的病癥，其多因正氣不足，感受風(fēng)、寒、濕、熱等外邪引起，由此可見(jiàn)，外界風(fēng)寒濕熱等環(huán)境因素與痹證的發(fā)生密切相關(guān)，而濕與熱又常作為熱痹發(fā)病的誘因之一。表觀遺傳學(xué)作為環(huán)境因素影響基因表型的中間橋梁，常用于研究疾病的發(fā)病機(jī)制，其中DNA甲基化研究最為廣泛[1]。與疾病發(fā)生相關(guān)的基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低，導(dǎo)致致病基因表達(dá)增加，誘發(fā)或促使疾病發(fā)生，可見(jiàn)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[23]。白虎加桂枝湯是治療熱痹的經(jīng)典方劑，其藥理學(xué)機(jī)制主要集中于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和緩解炎癥反應(yīng)[45]，是否還存在其他的治療機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。完全弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠（AA）模型其病理表現(xiàn)與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）十分相似，常作為研究RA發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型[6]，而RA在中醫(yī)認(rèn)知中，將其歸屬與“痹證”范疇，根據(jù) “病因模擬”原理，本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)典AA模型的基礎(chǔ)上復(fù)合濕熱環(huán)境，制備符合中醫(yī)熱痹證候的動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上采用甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIPSeq）測(cè)序方法考察了熱痹特征性甲基化基因，并初步探討了白虎加桂枝湯治療熱痹的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1材料

11動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，體重180～220 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（川）201324。

12藥物與試劑

白虎加桂枝湯，其藥物組成及用量參考上海中醫(yī)學(xué)院1982年版《中醫(yī)方劑與臨床手冊(cè)》，為石膏60 g、知母15 g、甘草5 g、粳米30 g、桂枝10 g。藥材均購(gòu)于成都市荷花池藥材市場(chǎng)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)馬云桐教授鑒定。藥物配制方法如下：知母、甘草、粳米、桂枝溫水浸泡1 h，石膏單獨(dú)先煎30 min后加入其他藥物，加水至1 000 mL，保持微沸，煎煮30 min，紗布過(guò)濾；取藥渣加水500 mL二次煎煮20 min，紗布過(guò)濾并與第一次濾液合并，濃縮至2 g·mL-1，各給藥組均以2 g·mL-1溶液稀釋至給藥濃度。

醋酸地塞米松（浙江仙琚制藥股份有限公司，20140609）；完全弗氏佐劑（CFA）（Sigma，F(xiàn)588110 mL）；MILLIPLEX xMAP Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Immunology Multiplex Assay Kit （Millipore，USA，RECYTMAG65K11）；Magnetic Methylated DNA Immunoprecipitation kit（Millipore，ME10025）；QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，155231102）；PairedEnd DNA Sample Prep kit（Illumina，PE1021002）；iScript cDNA Synthesis Kit（BIORAD，100 reaction）；FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）（Roche，5 mL）；TriPure Isolation Reagent（Roche，200 mL）。

13儀器

Luminex 200（Millipore，Magpix）；Nanodrop（Thermo Scientific Co Ltd，2000）；Illumina Hiseq（Illumina，2000）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems Inc，7900 HT）；紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，NANODROP2000）；凝膠成像儀（GE，ImageQuant300）。

2方法

21分組與造模

60只SD大鼠剔除體重不合格者4只，其余54只大鼠隨機(jī)分為7組，每組8只，分組為：空白組（NG）、完全弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組（AA）、熱痹模型組（RB）、地塞米松組（DXM）、白虎加桂枝湯高劑量組（BHG）、白虎加桂枝湯中劑量組（BMG）、白虎加桂枝湯低劑量組（BLG）。各組大鼠于常規(guī)實(shí)驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。造模方法如下：除NG組大鼠右后足底皮下注射01 mL生理鹽水外，其余各組均注射01 mL CFA。RB，BHG，BMG，BLG 4組大鼠自注射01 mL CFA第1天起，均置于溫度為375 ℃，相對(duì)濕度為70%～80%的環(huán)境中，每天2 h，直至45 d，其余時(shí)間常規(guī)飼養(yǎng)。

22給藥

造模15 d后，DXM（5 mg·kg-1），BHG（28 g·kg-1），BMG（14 g·kg-1），BLG（7 g·kg-1）4組大鼠按20 mL·kg-1體積灌胃給藥，每天1次，連續(xù)30 d。

23大鼠足腫脹度的測(cè)定

測(cè)定造模前和自造模后第6天起，每隔4 d后大鼠的足容積。足腫脹度計(jì)算公式為：造模后足容積-正常足容積。

24大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)檢測(cè)

第45天給藥后，剪取大鼠踝關(guān)節(jié)，10%甲醛固定，10%EDTA脫鈣，乙醇梯度脫水，二甲苯脫酒精，石蠟包埋，切片（5 μm）；切片脫蠟，蘇木素伊紅染色，封片，鏡檢。

25大鼠血清因子含量水平檢測(cè)

造模后第35天，各組大鼠尾靜脈取血并分離血清。按照MILLIPLEX xMAP Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead PanelImmunology Multiplex Assay Kit說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL1β，IL17，TNFα，EGF，IL12p70，IL4，IL6及IFNγ的含量水平。

26熱痹模型大鼠滑膜甲基化水平檢測(cè)及熱痹特征性甲基化基因篩選

根據(jù)NG，AA及RB 3組大鼠血清因子檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17及IL12p70的結(jié)果，做聚類分析，剔出3組中各自離散度大的動(dòng)物，各篩選出3只大鼠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。造模后第44天，處死NG，AA及RB 3組中挑選出的大鼠，取膝關(guān)節(jié)滑膜。按照QIAquick Gel Extraction Kit說(shuō)明書(shū)中組織樣本DNA提取方法，提取各大鼠滑膜DNA，并將DNA樣本立刻送華大基因進(jìn)行MeDIPSeq測(cè)序。將NG相對(duì)RB啟動(dòng)子區(qū)甲基化基因和 NG相對(duì)AA啟動(dòng)子區(qū)甲基化基因以取差集的方式，找出熱痹模型特征性甲基化基因。

27白虎加桂枝湯對(duì)熱痹模型大鼠滑膜特征性甲基化基因表達(dá)的影響

造模后第45天，剝離大鼠后肢膝關(guān)節(jié)滑膜，并提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模版進(jìn)行PCR。擴(kuò)增引物為：βactin上游引物為5′CTGGAGAAGAGCTATGAG3′，下游引物為5′ATGATGGAATTGAATGTAGTT3′；Ahcy上游引物為5′GTCCACAACCTCTACA3′，下游引物為5′CTTGGTGACAGAATCG3′；Rpl3上游引物5′AACAGAGATCAACAAGAAGA3′，下游引物為5′CAGGTCGTAGTCAGTAGA3′；Agxt上游引物為5′GAAGTCTGAGGATGATTGG3′，下游引物為5′TCTGGAACACATACTGGAT3′。

反應(yīng)體系：5x iScript Reaction Mix 12 μL，iScript Reverse Transcriptase 3 μL，Nucleasefree water 30 μL，RNA template 15 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，整個(gè)熒光定量PCR通過(guò)ABI 7900 HT Realtime PCR System以及7900 System SoftwareSDS 24（Applied Biosystems）進(jìn)行。

28統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)均采用±s表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn)；DNA甲基化數(shù)據(jù)采用R語(yǔ)言、PCA和FC的計(jì)算方法；分析2組樣品間的 peak 相關(guān)差異基因，采用卡方檢驗(yàn)，并做 FDR 檢驗(yàn)去除假陽(yáng)性。

3結(jié)果

31各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)大鼠足腫脹度變化

與NG組比較，AA組與RB組足腫脹度顯著升高（P<005）；與AA組比較，RB組足腫脹度于各檢測(cè)點(diǎn)僅有升高趨勢(shì)，第21天最明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義；與RB組比較，白虎加桂枝湯高、低劑量組給藥30 d后，足腫脹度明顯降低（P<005），見(jiàn)表1。

32大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理變化

病理結(jié)果顯示，NG組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜正常；AA組較NG組可見(jiàn)滑膜輕度增生、滑膜細(xì)胞輕度腫脹，

滑膜炎性細(xì)胞中度浸潤(rùn)，輕度纖維化；RB組可見(jiàn)滑膜細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較AA組嚴(yán)重，但未見(jiàn)滑膜細(xì)胞腫脹及纖維化；給予藥物白虎加桂枝湯干預(yù)后，滑膜炎性增生和浸潤(rùn)明顯改善，見(jiàn)圖1。

33白虎加桂枝湯對(duì)大鼠血清炎癥因子含量水平的影響

與NG比較，AA和RB 2組大鼠血清各因子含量均明顯升高（P<005）；與AA比較，RB大鼠血清中IL1β，TNFα和VEGF的含量顯著升高（P<005）；與RB比較，BHG，BMG顯著降低IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17及IL12p70的含量水平（P<005），而B(niǎo)LG對(duì)VEGF和IL12p70的含量水平無(wú)明顯降低作用。IL6，IL4和IFNγ因其濃度低于檢測(cè)線，未檢測(cè)出，見(jiàn)圖2。

34熱痹模型大鼠滑膜甲基化水平

341MeDIPSeq序列與參考序列的比對(duì)NG，AA及RB 3組大鼠滑膜DNA甲基化測(cè)序完成后，統(tǒng)計(jì)質(zhì)量合格的read產(chǎn)出量，3組reads數(shù)量產(chǎn)出量均為244，897，960條。與參考基因組進(jìn)行比對(duì)（比對(duì)軟件SOAP221，相關(guān)網(wǎng)站http：//soap.genomics.org.cn），每條read最多允許2個(gè)堿基錯(cuò)配，可見(jiàn)3組reads比對(duì)率均不低于93%。比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。

342reads在CpG Island及其上下2 000 bp的平均覆蓋深度分布趨勢(shì)CpG島甲基化程度與基因表達(dá)存在十分密切的聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，與NG比較，AA及RB組CpG島DNA甲基化水平均明顯降低，且RB組低甲基化狀態(tài)最明顯，見(jiàn)圖3。

343熱痹模型DNA甲基化密度分布情況及各組

差異性甲基化基因?qū)eads映射至參考基因組上，檢測(cè)甲基化reads分布的峰值peak，并進(jìn)一步分析各組甲基化peak在不同基因元件上的密度。結(jié)果表明，NG，AA及RB的peak總數(shù)分別為253，285，233，338和233，461，與NG比較，AA及RB各基因元件上甲基化密度均減少；而與AA比較，RBUpstream2k，CDS與Intron上甲基化密度增加，而5′UTR，3′UTR和Downstream2k甲基化密度減少，見(jiàn)表3。

合并各組樣本peak區(qū)域，統(tǒng)計(jì)合并后區(qū)域中每個(gè)樣本歸一化后的reads數(shù)，并采用FDR檢驗(yàn)去除假陽(yáng)性結(jié)果。根據(jù)所選定區(qū)域中reads數(shù)的差異，將差異區(qū)域分為上升和下降，如樣本1與樣本2比較，同一peak區(qū)域中樣本2的reads數(shù)高于樣本1的reads數(shù)的基因，則認(rèn)為甲基化上調(diào)（up），反之為甲基化下調(diào)（down）。篩選準(zhǔn)則為：P≤001，2個(gè)樣本在相同基因元件內(nèi)都有覆蓋，且覆蓋度的差異在2倍以上。結(jié)果顯示，NG相對(duì)AA共有390個(gè)甲基化上調(diào)基因，315個(gè)甲基化下調(diào)基因，NG相對(duì)RB共有307個(gè)甲基化上調(diào)基因，2 111個(gè)甲基化下調(diào)基因；AA相對(duì)RB共有313個(gè)甲基化上調(diào)基因，974個(gè)甲基化下調(diào)基因。結(jié)果見(jiàn)圖4。

344熱痹差異性甲基化基因相關(guān)KEGG Pathway分析將RB相對(duì)AA的差異性基因投射于KEGG Pathway公共數(shù)據(jù)庫(kù)[7]上，通過(guò)pathway顯著性富集分析，得到RB相對(duì)AA的差異性 KEGG通路。由結(jié)果可知，RB差異性甲基化基因主要富集到細(xì)胞黏附、鈣信號(hào)途徑、MAPK信號(hào)通路、T，B細(xì)胞受體信號(hào)通路、抗原提呈處理等32個(gè)通路上。結(jié)果見(jiàn)表4。

345熱痹特征性甲基化基因采用整合基因組學(xué)瀏覽器（IGV）檢測(cè)MeDIPSeq測(cè)序的原始數(shù)據(jù)中的wig壓縮包，剔除組內(nèi)3個(gè)樣本在peak相同區(qū)域內(nèi)存在較大差異的甲基化基因，再經(jīng)過(guò)取差集的方法篩選啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生差異性甲基化的基因后，分析方法見(jiàn)圖5，得到熱痹特征性甲基化下調(diào)基因36個(gè)，甲基化上調(diào)基因16個(gè)。熱痹特征性甲基化基因見(jiàn)表5。

35白虎加桂枝湯對(duì)熱痹模型特征性甲基化基因表達(dá)的影響

檢測(cè)白虎加桂枝湯不同劑量對(duì)熱痹特征性甲基化上調(diào)基因AGXT及甲基化下調(diào)基因AHCY和RPL3 3個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明與RB比較，BHG與BLG均能降低Ahcy基因mRNA表達(dá)水平；BHG，BMG，BLG均能下調(diào)Rpl3基因mRNA表達(dá)水平；而對(duì)于甲基化上調(diào)的Agxt，BHG與BMG均能提高Agxt基因mRNA表達(dá)水平，見(jiàn)表6。

4討論

風(fēng)寒濕熱是痹證重要的發(fā)病病因。中醫(yī)將RA歸屬于痹證，在以往的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，濕熱環(huán)境能使RA模型大鼠滑膜細(xì)胞增生程度、CD44表達(dá)水平增加，導(dǎo)致RA炎癥和免疫反應(yīng)加重[89]。本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)典RA大鼠模型基礎(chǔ)上復(fù)合濕熱環(huán)境，制備熱痹大鼠模型。與申洪波[9]、鎮(zhèn)蘭芳[10]等的研究相比，本實(shí)驗(yàn)表明，給予濕熱環(huán)境刺激后大鼠足腫脹度及滑膜病理嚴(yán)重程度僅有輕微增加，其原因可能是每日造模時(shí)間相對(duì)較短，致使?jié)駸岘h(huán)境對(duì)AA模型的作用減弱。

研究表明，DNA甲基化可能改變RA發(fā)病關(guān)鍵基因的甲基化修飾水平，而參與到RA發(fā)病過(guò)程中，如CD4+T細(xì)胞全基因組出現(xiàn)低甲基化模式[11]，DNA甲基化動(dòng)態(tài)的參與到患者滑膜Th細(xì)胞的分化過(guò)程中等[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在CPG島上

AA模型較NG組呈明顯低甲基化狀態(tài)，而濕熱環(huán)境刺激后，RB組低甲基化狀態(tài)進(jìn)一步擴(kuò)大，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[13]。另外，在基因的各區(qū)域中RB較AA大鼠，甲基化下調(diào)基因數(shù)目均明顯多于甲基化上調(diào)的基因數(shù)目。熱痹模型甲基化水平低于AA模型的結(jié)果和足腫脹度、踝關(guān)節(jié)病理的結(jié)果，說(shuō)明低甲基化狀態(tài)可能是濕熱環(huán)境推動(dòng)AA模型疾病進(jìn)程的原因之一。KEGG Pathway分析結(jié)果顯示，RB與AA的差異性甲基化基因主要集中與炎癥、免疫相關(guān)的通路上，如細(xì)胞黏附、鈣信號(hào)途徑、MAPK信號(hào)通路、T，B細(xì)胞受體信號(hào)通路、抗原提呈處理等，說(shuō)明濕熱環(huán)境可能通過(guò)對(duì)這些炎癥免疫通路的作用，影響疾病的轉(zhuǎn)歸。此外，除了炎癥和免疫通路，這些差異性甲基化基因還富集到某些物質(zhì)合成及代謝通路上，說(shuō)明濕熱環(huán)境另一方面可能造成生物機(jī)體代謝系統(tǒng)紊亂引發(fā)或加重疾病。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域取差集的方法（NG相對(duì)RBNG相對(duì)AA），扣除了RB與AA因reads倍數(shù)差異而共同擁有的甲基化基因，進(jìn)而得到熱痹特有的甲基化基因，第一次闡述了熱痹滑膜基因存在獨(dú)特甲基化變化，這些基因主要編碼與炎癥免疫反應(yīng)（如Ahcy，Rpl3，Crn2，Map3k14，Stat2）、能量代謝（Fut2，Kcnj11，Stat2）、DNA及RNA轉(zhuǎn)錄（Sertad1）、細(xì)胞成分（Sertad1）等相關(guān)的蛋白，與關(guān)節(jié)炎，自身免疫性疾病，代謝紊亂等疾病有關(guān)。說(shuō)明濕熱環(huán)境可能通過(guò)特異性改變這些基因的甲基化水平，參與到熱痹疾病進(jìn)程中。

白虎加桂枝湯抗炎和提高機(jī)體免疫能力效果顯著[1415]。本實(shí)驗(yàn)從減輕熱痹大鼠足腫脹度、踝關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜細(xì)胞增生及降各炎癥因子含量三方面，證明了白虎加桂枝湯抗炎作用明顯。除此之外，首次從表觀遺傳學(xué)角度探討了其對(duì)熱痹特征性甲基化基因表達(dá)水平的影響。眾所周知，基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化程度與基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)表明，白虎加桂枝湯能上調(diào)熱痹特征性甲基化上調(diào)基因AGXT的表達(dá)水平，下調(diào)熱痹特征性甲基化下調(diào)基因AHCY和RPL3的表達(dá)水平，其中AGXT編碼的蛋白參與cAMP，絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性，丙氨酸代謝等過(guò)程，而RPL3編碼的蛋白參與細(xì)胞對(duì)IL4反應(yīng)過(guò)程和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，AHCY編碼的蛋白參與抗原刺激性炎癥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎等過(guò)程。以上結(jié)果說(shuō)明，白虎加桂枝湯可能影響熱痹特征性基因的甲基化水平扭轉(zhuǎn)因外界濕熱環(huán)境引起的甲基化異常變化，這可能是白虎加桂枝湯治療熱痹的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步完善，如檢測(cè)白虎加桂枝湯各劑量組大鼠滑膜全基因組甲基化水平，并和熱痹模型組全基因組甲基化進(jìn)行對(duì)比，以及考察白虎加桂枝湯對(duì)多個(gè)熱痹特征性甲基化基因表達(dá)的影響等。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Liu L， Li Y， Tollefsbol T OGeneenvironment interactions and epigenetic basis of human diseases[J] Curr Issues Mol Biol， 2008，10： 25

[2]Cribbs A， Feldmann M， Oppermann U Towards an understanding of the role of DNA methylation in rheumatoid arthritis： therapeutic and diagnostic implications[J] Ther Adv Musculoskel Dis， 2015， 20（15）： 1549

[3]Kass S U， Landsberger N， Wolffe A P DNA methylation directs a timedependent repression of transcription initiation[J] Curr Biol， 1997， 7（3）： 157

[4]徐世軍，李磊，張文生，等基于方證相關(guān)理論的治“痹”經(jīng)方藥效學(xué)比較研究[J]中國(guó)中藥雜志，2009， 34（23）：2030

[5]巨少華，陳歡，魏江平，等基于"以方測(cè)證"思路的治痹經(jīng)方抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的比較藥理學(xué)研究[J]中藥藥理與臨床，2015，31（6）：4

[6]陳哲，郭艷幸類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究綜述[J]風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2015，4（12）：67

[7]Kanehisa M， Araki M， Goto S， et al KEGG for linking genomes to life and the environment[J] Nucleic Acids Res， 2008， 36（suppl 1）： D480

[8]鎮(zhèn)蘭芳，宋玉，張六通外感風(fēng)寒濕熱對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠血清CD44水平的影響[J]遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15（10）：159

[9]申洪波，白云靜，胡蔭奇環(huán)境因素對(duì)痹證大鼠自身抗體表達(dá)的影響[J]中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16（9）：832

[10]鎮(zhèn)蘭芳，外感風(fēng)寒濕與痹證相關(guān)性的理論和實(shí)驗(yàn)研究[D]武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2014

[11]Janson P C J， Linton L B， Bergman E A， et al Profiling of CD4+T cells with epigenetic immune lineage analysis[J]J Immunol， 2011， 186（1）： 92

[12]Cohen C J， Crome S Q， MacDonald K G， et al Human Th1 and Th17 cells exhibit epigenetic stability at signature cytokine and transcription factor loci[J] J Immunol， 2011， 187（11）： 5615

[13]Saxonov S， Berg P， Brutlag D L A genomewide analysis of CpG dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes of promoters[J] Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103：1412

[14]徐世軍，代淵，李磊，等基于“方證相關(guān)”理論的治“痹”經(jīng)方調(diào)控T細(xì)胞亞群比較研究[J]中國(guó)中藥雜志， 2010（15）：2030

[15]徐世軍，李磊，張文生，等基于“方證相關(guān)”理論的治“痹”經(jīng)方調(diào)控TLR/TRAF信號(hào)通路的比較研究[J]中國(guó)中藥雜志，2010（8）：1025

[16]Cribbs A， Feldmann M， Oppermann U Towards an understanding of the role of DNA methylation in rheumatoid arthritis： therapeutic and diagnostic implications[J] Ther Adv Musculoskel Dis， 2015， 20（15）： 1549

[責(zé)任編輯張寧寧]

[收稿日期]20161009

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273900）；中藥藥理四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)（2014TD0007）

[通信作者]*徐世軍，Tel：（028）61800231，Email：docxu@126com

[作者簡(jiǎn)介]陳歡，博士研究生，主要從事中藥抗炎與免疫藥理學(xué)研究，Email：rata555@163com