基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究腎炎消白顆粒治療糖尿病腎病作用機(jī)制

蔡英杰，李浩經(jīng)，蔡蕭君，吳圓圓，林鵬展

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；3.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是由糖尿病導(dǎo)致的慢性腎臟病，是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，臨床特征為持續(xù)性白蛋白尿排泄率增高，腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降，是導(dǎo)致慢性腎臟病與腎衰竭的重要原因之一，同時(shí)也取代慢性腎小球腎炎成為我國(guó)慢性腎臟病的首要病因[1]。臨床單純以西醫(yī)治療DKD缺乏確切療效，常中西結(jié)合治療。

腎炎消白顆粒（Shenyan Xiaobai granules，SYXB）系黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，依據(jù)名老中醫(yī)張琪教授臨床治療蛋白尿經(jīng)驗(yàn)方“腎炎消白方”研制而成，全方健脾益腎、清熱解毒利濕，主治慢性腎病蛋白尿脾腎兩虛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證，臨床治療以蛋白尿?yàn)橹饕Y狀的慢性腎病效果良好。臨床研究發(fā)現(xiàn)SYXB對(duì)慢性腎小球腎炎存在治療效果[1]，但對(duì)DKD臨床療效的報(bào)道，僅存在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究[2-4]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析SYXB藥物有效成分、活性靶點(diǎn)與疾病之間的相關(guān)性，為SYXB臨床治療DKD提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源網(wǎng)址及數(shù)據(jù)分析軟件

1.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源網(wǎng)址

（1）中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP）[5]（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；（2）PubChem 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；（3）SwissTargetPrediction（數(shù)據(jù)庫(kù)http：//www.swisstargetprediction.ch/）；（4）UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）；（5）GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genecards.org/）；（6）TTD 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）；（7）OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.omim.org）；（8）DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）；（9）Draw Venn Diagram平臺(tái)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；（10）STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）。

1.1.2 數(shù)據(jù)分析軟件

（1）Metascape平臺(tái)（https：//metascape.org/）；（2）生物信息在線作圖網(wǎng)站微生信（http：//www.bioinform atics.com.cn/）；（3）Cytoscape 3.8.2軟件。

1.2 SYXB 藥物成分靶點(diǎn)的篩選

SYXB主要成分為白茅根、黨參、枸杞、黃芪、女貞子、芡實(shí)、山藥、熟地黃、土茯苓、菟絲子、益母草、薏苡仁。通過(guò)挖掘TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以上述藥物為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，依據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，初步篩選出藥物活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充TCMSP未預(yù)測(cè)到的化合物靶點(diǎn)，于PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)尋找其化學(xué)結(jié)構(gòu)式，于SwissTargetPrediction平臺(tái)進(jìn)行分子預(yù)測(cè)[6-9]。將篩選出的活性化合物靶點(diǎn)通過(guò)UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名稱規(guī)范化。

1.3 糖尿病腎病靶點(diǎn)篩選

以糖尿病腎病（diabetic kidney disease）為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards、TTD、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其疾病潛在靶點(diǎn)，合并靶點(diǎn)并刪除重復(fù)值后獲得DKD疾病靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建SYXB“藥物-成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建SYXB“藥物-成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，將篩選出的藥物有效成分與作用靶點(diǎn)導(dǎo)入軟件，運(yùn)用network analyzer分析工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析。

1.5 構(gòu)建SYXB-DKD 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建SYXB-DKD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，分析SYXB與DKD靶點(diǎn)間的聯(lián)系，通過(guò)Draw Venn Diagram平臺(tái)繪制出韋恩圖，在STRING 11.0 平臺(tái)中構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI），將物種限定為人，于Cytoscape 3.8.2軟件中進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 SYXB—DKD 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO-BP、KEGG 分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)提交至Metascape平臺(tái)進(jìn)行基因本體-生物過(guò)程分析（Gene Ontology-biological process，GO-BP）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“SYXB—DKD關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并利用微生信平臺(tái)繪制GO-BP通路與KEGG通路的條形圖。

1.7 構(gòu)建“SYXB 活性成分-重合靶點(diǎn)-DKD-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

通 過(guò)Cytoscape 3.8.2 構(gòu) 建 出“SYXB 活 性 成分-重合靶點(diǎn)-DKD-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，利用network analyzer分析工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，節(jié)點(diǎn)程度以連接度值調(diào)節(jié)，連接度值越大表明其生物活性越高，功能越齊全，重要性越高。

2 結(jié) 果

2.1 SYXB 藥物成分靶點(diǎn)的信息

通過(guò)挖掘TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)可獲得白茅根有效成分4 種，作用靶點(diǎn)54 個(gè)；黨參有效成分17 種，作用靶點(diǎn)102個(gè)；枸杞有效成分36種，作用靶點(diǎn)184個(gè)；黃芪有效成分17種，作用靶點(diǎn)190個(gè)；女貞子有效成分9種，作用靶點(diǎn)181個(gè)；芡實(shí)有效成分2種，作用靶點(diǎn)18個(gè)；山藥有效成分12種，作用靶點(diǎn)70個(gè)；熟地黃有效成分2種，作用靶點(diǎn)29個(gè)；土茯苓有效成分15種，作用靶點(diǎn)188個(gè)；菟絲子有效成分10種，作用靶點(diǎn)193個(gè)；益母草有效成分8種，作用靶點(diǎn)183個(gè)；薏苡仁有效成分6種，作用靶點(diǎn)29個(gè)。合并刪除重復(fù)值后獲得藥物有效成分共103種，作用靶點(diǎn)共271個(gè)。SYXB活性成分及網(wǎng)絡(luò)標(biāo)記見(jiàn)表1，主要有效成分信息見(jiàn)表2。

表1 腎炎消白顆?；钚猿煞旨熬W(wǎng)絡(luò)標(biāo)記

表2 腎炎消白顆粒主要有效成分信息表

2.2 DKD 疾病靶點(diǎn)

通過(guò)挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)可獲得3512 個(gè)DKD疾病靶點(diǎn)，其relevance score中位數(shù)為4.88，將relevance score≥中位數(shù)的靶點(diǎn)設(shè)定為目標(biāo)靶點(diǎn)，可獲得846個(gè)靶點(diǎn)。繼續(xù)挖掘OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)與TTD數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，共獲得DKD疾病靶點(diǎn)952個(gè)。

2.3 SYXB“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將SYXB中103 種有效成分及271 個(gè)作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件進(jìn)行分析，并構(gòu)建SYXB“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果見(jiàn)圖1。圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)信息，邊表示節(jié)點(diǎn)間的作用聯(lián)系，網(wǎng)絡(luò)圖中共有387 個(gè)節(jié)點(diǎn)，936 條邊，其網(wǎng)絡(luò)度中心性均值為6.54，介度中心性均值為5.74×10-3，緊密中心度均值為0.32。

圖1 腎炎消白顆?！八幬?成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 SYXB-DKD 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的SYXB靶點(diǎn)及DKD疾病靶點(diǎn)于Venn Diagram平臺(tái)繪制韋恩圖（見(jiàn)圖2），可見(jiàn)其存在114 個(gè)共同靶點(diǎn)。通過(guò)STRING 11.0 平臺(tái)構(gòu)建SYXB-DKD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖3），其中線段粗細(xì)代表數(shù)據(jù)支持強(qiáng)度（置信度），本研究置信度設(shè)為0.900，隱藏?cái)嚅_(kāi)連接節(jié)，該網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)數(shù)為114，預(yù)期邊數(shù)102，邊數(shù)415，PPI富集P<1.0×10-16，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)7.28，平均局部聚類系數(shù)0.44，于Cytoscape 3.8.2 進(jìn)行優(yōu)化（見(jiàn)圖4）。顏色越深，面積越大，代表度中心性越大。經(jīng)拓?fù)浞治鍪驹摼W(wǎng)絡(luò)中度中心性均值為8.30，介度中心性均值為1.72×10-2。選取度中心性與介度中心性大于均值的靶點(diǎn)，可篩選出23個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（見(jiàn)表3），占總節(jié)點(diǎn)的21.30%。

圖2 SYXB-DKD 韋恩圖

圖3 SYXB-DKD 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 SYXB-DKD 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化圖

表3 SYXB-DKD 關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋵傩詤?shù)

2.5 GO-BP 與KEGG 通路富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)置于Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO-BP富集分析以及KEGG通路富集分析，以P<0.01 為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示23 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)可參與749條生物過(guò)程及220條KEGG通路。依據(jù)P 值由小到大排列，選取前20 條GO-BP以及KEGG通路進(jìn)行分析。用Cytoscape 3.8.2軟件繪制富集網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖5），通過(guò)生物信息在線作圖網(wǎng)站微生信繪制GO-BP與KEGG通路富集分析條形圖（見(jiàn)圖6、表4）。經(jīng)分析，SYXB治療DKD的生物過(guò)程主要通過(guò)調(diào)節(jié)脂多糖、細(xì)菌、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、脂質(zhì)、活性氧、無(wú)機(jī)物、金屬離子以及對(duì)外界的反應(yīng)，調(diào)控DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性，針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激反應(yīng)；可能與白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化通路等相關(guān)。

I：GO-BP 前20 條通路網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 SYXB-DKD 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析通路網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 SYXB-DKD 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析通路條形圖

表4 KEGG 前20 條通路條目

2.6 “SYXB-DKD-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將SYXB藥物成分、活性化合物、重合靶點(diǎn)、關(guān)鍵靶點(diǎn)、KEGG通路信息通過(guò)Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖7）。

圖7 SYXB-DKD-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

DKD是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，主要包括腎小球肥大、系膜基質(zhì)增生、基底膜增厚、腎間質(zhì)纖維化及腎動(dòng)脈硬化等病理學(xué)改變，其發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、血流動(dòng)力學(xué)紊亂、脂代謝異常、氧化應(yīng)激、炎癥因子等相關(guān)[10]。西醫(yī)常規(guī)治療包括降糖降脂、抗炎、控制血壓等，并調(diào)整生活方式及飲食習(xí)慣，但臨床治療效果欠佳[11]。

根據(jù)DKD疾病特點(diǎn)與臨床癥狀，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“關(guān)格”“腎消”“水腫”等范疇[12]。國(guó)醫(yī)大師張琪教授認(rèn)為脾腎兩虛、濕熱蘊(yùn)結(jié)是DKD的基本病機(jī)，貫穿DKD疾病發(fā)生發(fā)展整個(gè)過(guò)程[13]。本病虛實(shí)夾雜，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，故治以通補(bǔ)兼施，祛邪與扶正兼顧，補(bǔ)脾腎、泄?jié)駶?，補(bǔ)泄一方，扶正不留邪，祛邪不傷正，方能使病情趨于穩(wěn)定[14]。在糖尿病腎病的綿長(zhǎng)病程中會(huì)出現(xiàn)尿濁、水腫等一系列癥狀，《醫(yī)碥》云“精、髓、乳、汗液、津、淚、溺，皆水也，并屬于腎”。腎虛，封藏失司，精微外泄，故見(jiàn)尿濁；《醫(yī)門法律》指出“腎者，胃之關(guān)也。腎司開(kāi)合，腎氣從陽(yáng)則開(kāi)，陽(yáng)太盛則關(guān)門大開(kāi)，水直下為消；腎從陰則合，陰太盛則關(guān)門常合，水不通而為腫”。五臟之衰，久必及腎，腎失氣化，發(fā)為水腫。SYXB方中黃芪、黨參健脾益氣，熟地黃、枸杞滋陰補(bǔ)腎，四者共為君藥；菟絲子、女貞子、山藥健脾益腎為臣藥；佐以清熱利濕之土茯苓、薏苡仁、白茅根；益母草活血祛濕，芡實(shí)固精收澀為使藥。諸藥共奏健脾益腎、清熱利濕之功。

現(xiàn)代藥理研究表明，SYXB可以通過(guò)上調(diào)podocin、nephrin、α-actinin-4、podocalyxin 及ZO-1水平來(lái)降低尿蛋白排泄率，調(diào)節(jié)脂代謝，從而延緩DKD的進(jìn)展[15]。IL-17 信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化通路等屬于炎癥反應(yīng)相關(guān)性通路。炎癥反應(yīng)是DKD的重要反應(yīng)之一，DKD患者因糖代謝紊亂，刺激腎小球引起血管通透性增加，加速腎臟炎癥反應(yīng)，促使疾病進(jìn)一步進(jìn)展[16-17]。Milas O等[18]研究表明，封鎖IL-17 信號(hào)通路可減輕腎小球損傷和肥大，降低促纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)，減弱糖尿病腎臟中巨噬細(xì)胞的積聚，抑制糖尿病腎臟中親炎和親纖維基因的表達(dá)。IL-17在高血糖條件下發(fā)揮著特殊作用，可以促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)，加速DKD進(jìn)展；使用IL-17中和抗體對(duì)DKD具有保護(hù)作用[19]。Toll樣受體信號(hào)通路參與免疫調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)，該通路中TLR2/4通過(guò)激活MyD88及NF-κB以誘導(dǎo)相應(yīng)炎癥因子轉(zhuǎn)錄[20]。TNF信號(hào)通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、炎癥及免疫調(diào)節(jié)息息相關(guān)，通路中主要因子TNF-α可刺激誘導(dǎo)炎癥因子增加，引起胰島素抵抗，并且能誘導(dǎo)NADPH氧化酶引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[21]。AGE-RAGE信號(hào)通路在DKD中起重要作用，既能激活NF-κB與NADPH氧化酶從而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)也能刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子增強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）表達(dá)[22]。Th17細(xì)胞分化通路亦對(duì)人體免疫與炎癥起調(diào)節(jié)作用，有研究表明DKD患者體內(nèi)循環(huán)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/輔助性T細(xì)胞17（Treg/Th17）為失衡狀態(tài)，而Treg/Th17失衡也是導(dǎo)致DKD進(jìn)展的因素之一[23]。

細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路屬于凋亡-自噬相關(guān)性通路。細(xì)胞凋亡與自噬均是細(xì)胞的正常生理現(xiàn)象，但自噬不足則易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體聚集，促使細(xì)胞過(guò)度凋亡而引起DKD進(jìn)一步進(jìn)展[24]。P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子是MAPK信號(hào)通路中最重要的一環(huán)，既涉及炎癥介質(zhì)的釋放，也通過(guò)調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)從而影響細(xì)胞自噬功能[25]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)SYXB治療DKD可能的潛在作用機(jī)制，研究表明SYXB具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，中藥依據(jù)君臣佐使配伍，通過(guò)參與多種生物過(guò)程及信號(hào)通路協(xié)同發(fā)揮功效，其作用途徑可能為參與炎癥反應(yīng)與細(xì)胞自噬凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，但本研究無(wú)法代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中藥物代謝的過(guò)程，需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。