基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索三七治療腦卒中的作用機(jī)制

王惠潔，董藝薇，劉 健，梁亞杰，陳 瑩，苑舒文，趙果毅

（山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619）

三七[Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人參屬植物，又名人參三七、參三七、文三七、田七等，主產(chǎn)于云南文山、馬關(guān)、廣南及江西田陽(yáng)、田東等地，以干燥根和根莖入藥。主根多呈現(xiàn)類(lèi)圓錐形或圓柱形，表面顏色呈灰黃色或灰褐色，氣微味淡，入口味苦而后回甜?！侗静菥V目拾遺》中記載“人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一，味同而功亦等，故稱(chēng)人參、三七為中藥之最珍貴者”。

腦卒中（cerebral stroke）又稱(chēng)“中風(fēng)”“腦血管意外”（cerebralvascular accident，CVA），是目前常見(jiàn)的神經(jīng)內(nèi)科疾病，病癥涉及范圍廣，每年都在威脅著不少患者的性命，即使存活下來(lái)也有著極高的致殘率[1]。腦卒中是中老年人較為常見(jiàn)的疾病，也是中國(guó)成年人殘疾的首要原因，其病因復(fù)雜多樣，患病率、死亡率和致殘率高，為家庭乃至社會(huì)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科，其研究過(guò)程以網(wǎng)絡(luò)分析為核心技術(shù)，通過(guò)尋找藥物、疾病的基因和靶點(diǎn)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)建立聯(lián)系，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，使疾病和藥物的關(guān)系一目了然，重視疾病與藥物之間的相互作用，對(duì)藥物和疾病的研究更加深入與精準(zhǔn)[2]。本研究以三七有效活性成分—靶點(diǎn)—疾?。ㄗ渲校┑臉?gòu)架整理出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)等，形成對(duì)研究對(duì)象的整體描述，為闡明三七治療腦卒中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選三七的活性成分

通過(guò)TCMSP（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）查詢(xún)?nèi)咚械幕瘜W(xué)成分。類(lèi)別選中“herb name”，并輸入關(guān)鍵字“三七”作為詞干在搜索框中進(jìn)行檢索，在“l(fā)atin name”一 欄 中 選 中“Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen ex C.Chow”后得到三七化學(xué)成分的各類(lèi)信息，如分子名、口服生物利用度（OB）、藥物相似性（DL）、血腦屏障（BBB）、藥物半衰期（HL）、分子量（MW）等，在藥物所參與的ADME（吸收、分布、代謝、排泄）特性過(guò)程的基礎(chǔ)上，篩選出“OB≥30%”且同時(shí)滿足“DL≥0.18”的化學(xué)成分，作為此次研究中使用的三七的活性成分。

1.2 預(yù)測(cè)三七活性成分靶點(diǎn)及獲得作用靶點(diǎn)

1.2.1 預(yù)測(cè)三七活性成分的潛在作用靶點(diǎn)

首先使用PubChem化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 檢 索 上 一 步 驟中獲取的所有活性成分，并分別記錄下他們的Smiles 編 號(hào)、InChiKey 數(shù) 值，再 利 用Swiss ADME 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.swissadme.ch/）中 的SwissTargetPrediction功能，在select a species中選homo sapiens，將收集到的Smiles號(hào)粘貼到搜索框中，或使用PubChem保存化學(xué)式的2D圖片將其導(dǎo)入，得到該活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。下載Excel表格文件，將probability為0的刪除，得到全部活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并將活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)名稱(chēng)規(guī)范化。

1.2.2 獲得三七治療腦卒中的作用靶點(diǎn)

DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）是來(lái)自阿爾伯塔大學(xué)的生物信息學(xué)和化學(xué)信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)可將詳細(xì)的藥物數(shù)據(jù)與全面的藥物靶標(biāo)信息相結(jié)合。在搜索框中輸入“cerebralvascular accident”并搜索，獲得腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)基因，并將其規(guī)范化，將結(jié)果與上一步三七活性成分的作用靶點(diǎn)取交集，獲得三七主要活性成分對(duì)腦卒中作用的靶點(diǎn)。

1.3 建立PPI 網(wǎng)絡(luò)

STRING 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//string-db.org/）是 一款可在線搜索已知蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，點(diǎn)擊STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的search功能，選中multiple proteins，將1.2.2中整理的三七治療腦卒中的靶點(diǎn)基因名稱(chēng)分別輸入list of names一欄，在organism中選中homo sapiens，將輸出的蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)以Excel形式保存。

1.4 取蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）交集分析核心靶點(diǎn)

利用Cytoscape 3.6.1軟件將三七與腦卒中的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，并選用Merge功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，查出核心靶點(diǎn)及其關(guān)系。

1.5 基因本體富集分析（geneontology，GO）與京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）是一個(gè)集成了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具的數(shù)據(jù)庫(kù)，可為大規(guī)模的基因和蛋白質(zhì)列表提供系統(tǒng)而全面的生物學(xué)功能注釋信息。使用在線GO生物學(xué)過(guò)程分析和KEGG通路富集分析，保留P<0.05的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 三七的主要活性成分

三七共有119 個(gè)化學(xué)成分，篩選條件取口服生物利用度（OB）≥30%且藥物相似性（DL）≥0.18，共篩選出8個(gè)活性成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 篩選后的三七活性成分

2.2 三七活性成分的潛在作用靶點(diǎn)

活性成分潛在作用靶點(diǎn)共456 個(gè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 三七活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.3 三七治療腦卒中作用靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)69個(gè)（圖2），與三七潛在作用靶點(diǎn)取交集，共5個(gè)靶點(diǎn)基因，分別是凝血因子Ⅱ（F2）、淀粉樣前體蛋白基因（APP）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、細(xì)胞色素P4502C19（CYP2C19）和N-甲基-D-天冬氨酸離子型谷氨酸受體2B（GRIN2B）（圖3），構(gòu)建活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，共13個(gè)節(jié)點(diǎn)，26條邊線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖2 腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)

圖3 三七活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)交集

圖4 活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

三七活性物質(zhì)與腦卒中的靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示APP與F2、MMP9、GRIN2B相互作用，聯(lián)系密切（圖5）。

圖5 三七治療腦卒中PPI 拓?fù)浞治鰣D

2.5 核心靶點(diǎn)的GO 功能及KEGG 通路富集分析結(jié)果

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)一次性進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析，以P<0.05 進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示這5 個(gè)基因參與的GO生物過(guò)程（BP）有離子型谷氨酸受體信號(hào)途徑（ionotropic glutamate receptor signaling pathway）、腎上腺素受體信號(hào)途徑（ephrin receptor signaling pathway）、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程（cellular protein metabolic process）、白細(xì)胞遷移（leukocyte migration）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）；參與的分子功能（MF）有絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、酶結(jié)合（enzyme binding）、受體結(jié)合（receptor binding）；相關(guān)的細(xì)胞成分（CC）有細(xì)胞外空間（extracellular space）、胞外區(qū)（extracellular region）。

以P<0.05進(jìn)行篩選，KEGG通路分析顯示有3個(gè)核心靶點(diǎn)基因參與腦卒中疾病的相關(guān)通路，分別是APP、CYP2C19、GRIN2B，涉及到的通路為5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）和阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 KEGG 通路分析結(jié)果

3 討 論

腦卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中兩種，是由于腦供血障礙或血管破裂而造成的急性腦血管疾病，在臨床上致殘率、病死率均較高。三七是一種名貴中藥材，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七及其總皂苷提取物具有多種生物活性，包括保護(hù)心腦血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、抗菌抗炎、干預(yù)興奮毒性、抗氧化及其他藥理作用[3]。

三七可通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本研究通過(guò)GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)三七與腦卒中關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路涉及離子型谷氨酸受體信號(hào)途徑。GRIN2B 為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asparticacid，NMDA）受體，谷氨酸受體中的離子型受體NMDA可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、樹(shù)突與軸突的結(jié)構(gòu)發(fā)育和突觸可塑性，對(duì)生物發(fā)育過(guò)程極為重要。腦缺血后，谷氨酸過(guò)度釋放，造成谷氨酸堆積，促進(jìn)NMDA受體活化，引起Ca2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致腦部微環(huán)境異常，最終產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性反應(yīng)，引起神經(jīng)元凋亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1 可選擇性作用于NMDA受體的NR1/NR2B亞型，競(jìng)爭(zhēng)性抑制谷氨酸所導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用[5]。Wang Shiyun等[6]采用谷氨酸和鈣微灌注法及光栓法誘導(dǎo)腦缺血，制備大鼠海馬微環(huán)境紊亂模型，三七皂苷能夠促進(jìn)兩種模型大鼠谷氨酸受體轉(zhuǎn)運(yùn)體-1的表達(dá)，抑制NMDA受體表達(dá)和細(xì)胞色素C（Cyt-C）釋放，減輕興奮性神經(jīng)毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)三七與腦卒中關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路涉及腎上腺素受體信號(hào)途徑，與以往的研究是一致的。腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）是G蛋白偶連受體家族的代表性受體，在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)活動(dòng)中發(fā)揮基礎(chǔ)作用，腎上腺素受體介導(dǎo)的信號(hào)發(fā)生異?？纱龠M(jìn)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。腎上腺素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidy-linositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激酶B（protein kinase B，PKB即Akt）細(xì)胞通路，有研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷類(lèi)成分可促進(jìn) PI3K 和 Akt 蛋白磷酸化，激活P13K/Akt信號(hào)通路[8]。三七總皂苷（PNS）結(jié)合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠具有顯著的血腦屏障保護(hù)作用，可有效改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)狀況，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)[9]；三七提取物能夠作為一種外源性調(diào)節(jié)因子，激活依賴(lài)于P13K/Akt的核因子紅細(xì)胞系相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related facror 2，NRF2）抗氧化防御系統(tǒng)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）炎癥信號(hào)，從而減輕炎癥反應(yīng)[10]。

KEGG富集分析結(jié)果涉及APP基因，APP基因變異，在錯(cuò)誤的位置被酶切會(huì)形成淀粉樣蛋白沉淀。研究表明，三七總皂苷能在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)腦內(nèi)APP基因的表達(dá)[11]，從而降低β-淀粉樣蛋白（Aβ）的生成，改善快速老化模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。人參皂苷可促進(jìn)APP以α-分泌酶方式進(jìn)行剪切，抑制APP以β-分泌酶方式進(jìn)行剪切，抑制γ-分泌酶活性，從而降低Aβ的生成[11]。研究表明，阿爾茨海默?。ˋD）和腦缺血常常并存，互相促進(jìn)。腦卒中或腦血管病變加重AD患者的認(rèn)知損傷并加速其衰老，同時(shí)患有AD和血管疾病的患者癡呆要嚴(yán)重得多。炎癥是二者的共同特征之一，炎癥既促進(jìn)AD發(fā)展，又加重腦缺血損傷[12]。李?lèi)?ài)東等[13]研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可降低阿爾茨海默病患者炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平，有效改善阿爾茨海默病患者臨床癥狀和腦部灌注血流量，從而改善認(rèn)知功能。

研究人員利用小鼠腦缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，在海馬體部分人參皂苷Rg1 和Rb1 能應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激，在皮層部分其主要是通過(guò)恢復(fù)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellularregulated kinase，ERK）的磷酸化水平以誘導(dǎo)硫氧還蛋白1（thioredoxin，Trx-1）和細(xì)胞周期依賴(lài)蛋 白 激 酶5（cyclin dependent kinase，CDK5）的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)腦組織的目的[14]。人參皂苷Rg1 和Rb1 都可抑制東莨菪堿誘導(dǎo)的5-羥色胺（5-hydroxytrptamine，5-HT）減少，發(fā)揮益智作用[15]。三七中的黃酮類(lèi)成分槲皮素還具有降血壓、降血脂、祛痰、強(qiáng)心等作用[16]。

綜上所述，本研究初步預(yù)測(cè)了三七主要活性成分通過(guò)作用于疾病靶點(diǎn)APP、CYP2C19、GRIN2B治療腦卒中，涉及抗炎、神經(jīng)遞質(zhì)和受體的調(diào)節(jié)等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，形成非常復(fù)雜的藥理作用來(lái)保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)為后續(xù)應(yīng)用中醫(yī)藥研究和治療腦卒中提供了理論基礎(chǔ)。