王亞男　耿銳梅　李世斌　肖志亮　劉正文　賈振國　楊愛國　任民

摘要：鑒定抗煙草青枯病的優(yōu)異種質(zhì)資源，拓寬青枯病抗性品種的遺傳背景，提高品種抗病水平，是當前煙草抗性育種的研究重點。以 Dixie Bright 101、K326、紅花大金元為對照品種，在室內(nèi)接種 FJ-SMNT、FQY-4、Y45等3株菌株，對地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1進行病情指數(shù)調(diào)查與抗性評價，并基于種質(zhì)資源重測序數(shù)據(jù)，開發(fā)了瓊中五指山-1的特異性 SNP 指紋圖譜。結(jié)果表明，瓊中五指山-1發(fā)病緩慢，病情輕微，病情指數(shù)增長平緩，對3株菌株均有良好的抗性，抗性水平顯著高于抗病對照。構建的特異性指紋圖譜由339個 SNP 位點組成，基于云計算平臺開發(fā)了該指紋圖譜的檢測程序并利用測序技術對指紋圖譜的可靠性進行了驗證，證明了該指紋圖譜可以從隨機取樣的樣品中準確鑒定出瓊中五指山-1。瓊中五指山-1是目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的青枯病抗性最好的種質(zhì)資源之一。

關鍵詞：青枯?。粫駸?；種質(zhì)資源；抗性鑒定；指紋圖譜

中圖分類號： S572.03???????? 文獻標識碼： A???????? 文章編號：1007-5119（2023）03-0077-08

Identification of Bacterial Wilt Resistance and Fingerprint Development of Sun-cured Tobacco Qiongzhongwuzhishan-1

WANG Yanan， GENG Ruimei， LI Shibin， XIAO Zhiliang， LIU Zhengwen， JIA Zhenguo， YANGAiguo， REN Min*

（Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： The identification of excellent resistance germplasm resources to bacterial wilt， broadening the genetic background and improving the disease resistance level of tobacco varieties are the research focuses of current tobacco resistance breeding. In this study， Dixie Bright 101， K326， and Honghuadajinyuan were used as control varieties， and three Ralstonia solanacearum strains FJ-SMNT， FQY-4， and Y45 were used to inoculate tobacco plants. We then recorded the disease index and evaluated the bacteria wilt resistance of Qiongzhongwuzhishan-1， a local sun-cured tobacco germplasm resource. And based on the resequencing data of germplasm resources， the characteristic SNP fingerprint of Qiongzhongwuzhishan-1 were developed. The results showed that Qiongzhongwuzhishan-1 had a slow onset， mild disease occurence， and a mild increase in the disease index， with good resistance to all three strains. The level of resistance was significantly higher than that of the resistant control. The specific fingerprint consisted of 339 SNP loci， and a detection program for this fingerprint was developed based on the cloud computing platform. The reliability of this fingerprint was verified using sequencing technologies， and it was demonstrated that this fingerprint could accurately identify Qiongzhongwuzhishan-1 from randomly sampled specimens. The results from this study indicated that Qiongzhongwuzhishan-1 is one of the germplasm resources with the best resistance to tobacco bacteria wilt found in China.

Keywords： bacterial wilt; sun-cured tobacco; germplasm resources; resistance identification; fingerprint

青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細菌性病害，是熱帶、亞熱帶地區(qū)常見的毀滅性植物病害[1]。青枯菌寄主范圍十分廣泛，能夠侵染50多個科450多種植物[2]，其中茄科的重要經(jīng)濟作物煙草[3]、馬鈴薯[4]、番茄[5]、茄子[6]等均能被青枯菌侵染。煙草青枯病對世界各地的煙葉生產(chǎn)均有嚴重影響[7]。在我國，煙草青枯病主要發(fā)生在南方煙區(qū)，包括廣東、廣西、福建、湖南、四川、貴州、安徽等省份。近年來，國內(nèi)煙草青枯病有從南方地區(qū)向北方地區(qū)蔓延的趨勢[8]。

種植抗病品種是防治煙草青枯病的一條經(jīng)濟有效途徑，培育抗病品種也是煙草育種的一項重要工作。上世紀30年代，美國率先開展了煙草青枯病抗性育種研究，篩選到高抗水平的煙草種質(zhì)資源 TI 448A[9]。上世紀90年代至本世紀初，CORESTA （Cooperation Centre for Scientific Research Relativeto Tobacco，國際煙草科研合作中心）對多個國家代表性抗源的多年多點抗性鑒定表明，TI 448A 具有穩(wěn)定的抗性。并且由于 TI 448A 烤后煙葉質(zhì)量和香氣類似烤煙，因此逐漸成為了世界煙草青枯病抗性育種的主要抗源。且以 TI 448A 為親本育成的 Dixie Bright 101及其衍生品種 NC95和 Coker139等品種又成為后續(xù)一系列抗性品種的主體親本，世界各國陸續(xù)用這些品種為抗源選育了新的青枯病抗性品種[10]。我國利用的主要抗源其抗性也均來自 TI 448A，育成了巖煙97、安煙2號等抗病品種，但在生產(chǎn)上推廣應用面積較小，抗性達不到親源水平[11]。可見，目前所有育成品種的抗性幾乎都來自 TI 448A[12]，

導致現(xiàn)有抗病品種的抗源單一、遺傳背景狹窄問題特別突出，且現(xiàn)有品種的抗性水平距離生產(chǎn)需要仍有較大差距，不能很好地起到防控青枯病的作用[13-14]。與此同時，煙草種質(zhì)資源的青枯病抗性鑒定仍不充分，高達61%的煙草種質(zhì)資源無青枯病抗性鑒定記錄，現(xiàn)有的鑒定記錄還存在時間跨度大（從建國到至今）、鑒定標準不統(tǒng)一、鑒定方法不精準等問題。

構建分子指紋圖譜對保護和利用優(yōu)異種質(zhì)資源意義重大。單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms ，SNP）作為第三代分子標記，與新一代測序技術（Next-generation Sequencing ，NGS）相結(jié)合[15]，具備低成本、高效率、高準確性等優(yōu)點[16]，在水稻[17]、玉米[18]、小麥[19]等主要農(nóng)作物品種的指紋圖譜開發(fā)中得到日益廣泛的應用。

為此，本研究擬利用青枯病苗期室內(nèi)人工接種抗性鑒定技術[20]，對前期發(fā)現(xiàn)的田間抗性良好的地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1，利用多個青枯菌序列變種進行更加精細的抗性鑒定。以期進一步明確該種質(zhì)的青枯病抗性水平，并基于測序技術開發(fā)瓊中五指山-1的特異性 SNP 指紋圖譜。為應用該種質(zhì)資源進行青枯病抗病育種提供可靠的抗性鑒定依據(jù)，并為該種質(zhì)資源的有效保護提供分子標記。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試煙草品種地方抗青枯病曬煙種質(zhì)瓊中五指山-1，抗性對照品種 Dixie Bright 101（烤煙引進品種），中抗對照品種 K326（烤煙引進品種），感病對照品種紅花大金元（烤煙育成品種）。指紋圖譜驗證種質(zhì)為 ZX145（雪茄煙種質(zhì)資源）、海南7 號（曬煙地方種質(zhì)資源）、中煙300（烤煙育成品種）和紅花大金元。由國家煙草種質(zhì)資源中期庫（青島）提供。青枯病高抗種質(zhì)資源 GDSY-1[21]由廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。

1.1.2 供試青枯菌菌株利用3株青枯菌菌株開展供試材料的抗性鑒定，分別為福建菌株 FJ-SMNT （序列變種34）、貴州菌株 FQY-4（序列變種17）、云南菌株 Y45（序列變種54），均屬1號生理小種、演化 I 型、生化變種 III 型。

1.2 青枯病抗性鑒定

1.2.1 菌株活化與人工接種將用于接種的菌株解凍后，于 TTC 固體培養(yǎng)基（不含抗生素）平板上劃線，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h；挑選單菌落于NB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素）中，28℃、220 r/min 搖床中培養(yǎng)24～48 h。將培養(yǎng)好的菌懸液配制成約 OD600=0.05（約5.0×107 cfu/mL）菌懸液。煙苗培養(yǎng)至4葉 1心期時，采用灌根法人工接種10 mL 菌懸液。每個處理重復2次，每個重復6株煙苗。接菌后的煙苗置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，溫度（30±2）℃、相對濕度75%、光照12 h/d。

1.2.2 病情指數(shù)調(diào)查接種后每隔3～4 d 調(diào)查供試材料發(fā)病情況并計算病情指數(shù)。供試材料的發(fā)病等級參考孫希芳[22]方法、抗性評價參考國家標準 GB/T 23222—2008[23]。

按照公式（1）計算病情指數(shù)（Disease Index， DI）。

病情指數(shù)（DI）=查總株數(shù)（發(fā)病株數(shù)）最高級代表值（該病級代表值）×100? （1）

1.3 指紋圖譜構建

種質(zhì)資源的 GBS（Genotyping-by-Sequencing）重測序由國家煙草種質(zhì)資源中期庫（青島）提供，從中挑選了5196份煙草種質(zhì)資源的群體 SNP 分型數(shù)據(jù)。按照以下條件過濾 SNP 位點：（1）二態(tài)性 SNP 位點，（2）SNP 位于組裝后的染色體區(qū)域，（3）種質(zhì)資源群體的平均測序深度dp≥10，（4）種質(zhì)資源群體中瓊中五指山-1的測序深度dp≥10，（5）位點的質(zhì)量值 QUAL≥3000，（6）缺失率 miss≤0.3，（7）群體雜合率 his≤0.1；然后，利用vcftools軟件的--freq命令計算入選位點的等位變異頻率，并篩選稀有等位變異（minor allele）頻率Maf≤0.2的位點；最后，利用 Python（V 3.8.10）計算機語言編寫的腳本程序（下載地址： http：//47.104.13.144：8686/down/HgiSCa8dQ0Jc.py ），從上述步驟獲得的數(shù)據(jù)中，進一步篩選滿足以下條件的 SNP 位點：（1）瓊中五指山-1在該位點是純合基因型，（2）瓊中五指山-1的等位變異屬于稀有等位變異。利用以上步驟獲得的 SNP 位點組成瓊中五指山-1的特異性指紋圖譜。指紋圖譜位點的染色體分布圖采用 MG2C 軟件[24]繪制。

1.4 指紋圖譜分析程序的開發(fā)

利用 Python（V3.8.10）計算機語言，Django Web 框架（V4.0.3），基于阿里云技術開發(fā)了瓊中五指山-1種質(zhì)資源特異性 SNP 指紋圖譜檢測程序，訪問地址為 http：//47.104.13.144/fingerprint/qzwzs/。用戶界面如圖1所示。按照 Worku 等[25]、Povysil等[26]的方法計算遺傳距離。

1.5 指紋圖譜的驗證

于中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所青島試驗基地溫室內(nèi)，選取海南7號、紅花大金元、 ZX145、中煙300和瓊中五指山-1等5份材料的苗期葉片組織，隨機編號后送北京諾禾致源科技股份有限公司，利用 Illumina HiSeq PE150測序平臺進行雙末端（Paired-End）150全基因組重測序（Whole Genome Sequencing ，WGS），測序深度為3X。從測序結(jié)果中，提取相應指紋圖譜 SNP 位點的分型數(shù)據(jù)，利用瓊中五指山-1種質(zhì)資源特異性 SNP 指紋圖譜檢測程序進行分析，最后分析結(jié)果與實際品種進行核驗，判定指紋圖譜的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 瓊中五指山-1植物學性狀

瓊中五指山-1是原產(chǎn)地為海南省瓊中黎族苗族自治縣的地方曬煙種質(zhì)資源。株型塔形（圖2），葉形長橢圓，葉尖漸尖，葉面較平，葉緣波浪形，葉色綠，葉耳中，葉片主脈細，葉片較薄，莖葉角度中，花序松散、菱形，花色淡紅，種子橢圓形、淺褐色，蒴果卵圓形，株高140.3 cm，莖圍5.84 cm，節(jié)距6.91 cm，葉數(shù)14，葉長47.2 cm，葉寬18.1 cm，花冠長度5.03 cm ，花冠直徑1.8 cm ，花萼長度1.17 cm ，千粒質(zhì)量0.17 g，移栽至現(xiàn)蕾時間48 d，移栽至中心花開放時間57 d，全生育期148 d。

2.2 青枯病發(fā)病情況

從接種 FJ-SMNT 、FQY-4、Y45菌株后不同時間的供試材料病情指數(shù)可知（圖3），接種后28 d 是調(diào)查抗性水平的關鍵時期。此時感病對照紅花大金元的抗性評價達到感病至高感，病情指數(shù)分別為93.8、91.7、83.3；瓊中五指山-1的抗性評價均為高抗，病情指數(shù)分別為12.5、2.1、18.8；抗病對照 Dixie Bright 101的抗性評價為中抗至高抗，病情指數(shù)分別為45.8、18.8、45.8。由此可見，瓊中五指山-1對3株菌株均表現(xiàn)為高抗，抗性水平顯著高于 Dixie Bright 101。不同菌株間，瓊中五指山-1對 FQY-4菌株抗性最好，其次為 FJ-SMNT 和 Y45。

從發(fā)病時間看，瓊中五指山-1的特點為發(fā)病晚，在抗病對照 Dixie Bright 101發(fā)病中期，即接種后17～21 d，瓊中五指山-1才開始發(fā)病，且發(fā)病程度輕，多為1～2級，病情指數(shù)呈緩慢平穩(wěn)增長。

2.3 SNP 指紋圖譜構建

按照1.3中的步驟，共篩選到339個符合條件的 SNP 位點，標記編號、位置信息及分型詳見鏈接 http：//47.104.13.144：8686/down/oPGGNMfAHFy4.do cx ，分布在參考基因組的24條染色體上（圖4），指紋圖譜 SNP 位點間的平均間距為23.2 Mb，在 Chr6染色體上的指紋圖譜位點最多，為37個。SNP 的變異類型中， A/G 轉(zhuǎn)換136個，C/T 轉(zhuǎn)換118個，G/T 顛換25個，A/T 顛換25個，A/C 顛換27個， C/G 顛換8個，其中轉(zhuǎn)換（ts）共計254個，顛換（tv）共計85個，轉(zhuǎn)換顛換比（ts/tv）為2.99。參試瓊中五指山-1群體指紋圖譜 SNP 位點上的基因型均為稀有等位變異，等位變異頻率從0.001到0.199，平均為0.092。

2.4? SNP 指紋圖譜的可靠性驗證

按照1.5中的方法步驟，對瓊中五指山-1種質(zhì)資源 SNP 特異性指紋圖譜的可靠性基于測序技術進行了實際驗證。對海南7號、紅花大金元、ZX145、中煙300和瓊中五指山-1等5份供試材料隨機編號后，進行3X 覆蓋度的全基因組重測序。從測序數(shù)據(jù)中提取各供試材料在339個指紋圖譜位點上的實際測序分型結(jié)果。將數(shù)據(jù)輸入“瓊中五指山-1種質(zhì)資源特異性 SNP 指紋圖譜檢測程序”，計算上述5份材料與數(shù)據(jù)庫中各種質(zhì)資源的遺傳距離，相關計算結(jié)果詳見表1，然后找到與種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫中瓊中五指山-1最近的供試材料編號，并將編號對應回樣品的品種名稱。由于 WGS 測序技術的隨機性，3X 覆蓋度無法完全涵蓋供試材料的基因組全長，故339個指紋圖譜位點，在5個樣品中實際檢測到的位點數(shù)量為231～274。實際分析結(jié)果表明，利用本研究開發(fā)的特異性 SNP 指紋圖譜，能夠有效區(qū)分瓊中五指山-1樣品與其他4份供試材料，并且與數(shù)據(jù)庫中的瓊中五指山-1遺傳距離最近。

3 討論

煙草青枯病抗性優(yōu)異種質(zhì)資源是抗病品種培育的關鍵材料，決定著青枯病抗性育種的成效和水平。相比田間病圃自然發(fā)病抗性鑒定，室內(nèi)苗期人工接種抗性鑒定具有周期短、環(huán)境可控、菌株類型明確、效率高等優(yōu)勢，非常適合種質(zhì)資源的青枯病抗性精準鑒定[27]。利用人工接種抗性鑒定可以比較種質(zhì)資源對不同菌株的抗性反應差異，對全面分析種質(zhì)資源實際抗性表現(xiàn)和適宜生態(tài)區(qū)具有重要幫助[28]。本研究對煙草地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1，在氣候室內(nèi)進行了苗期人工接種抗性鑒定，結(jié)果表明，瓊中五指山-1對3株菌株均有良好的抗性，發(fā)病緩慢，病情輕微，病情等級增長平緩。本研究所選用的3株菌株廣泛分布在我國主要煙區(qū)[29]，因此可預見瓊中五指山-1能夠在國內(nèi)大部分煙區(qū)表現(xiàn)出良好抗性。與目前已知的煙草青枯病抗性種質(zhì)資源 TI 448A[30]、GDSY-1[21]、反帝三號[31]、大葉密合[32]、巖煙97[33]等相比，瓊中五指山-1與 GDSY-1的抗性表現(xiàn)相近，優(yōu)于已報道的抗性品種或種質(zhì)資源[34]，是目前青枯病抗性最好的煙草種質(zhì)資源之一。

構建 DNA 指紋圖譜是種質(zhì)資源保護與鑒定的重要技術手段[35]。分子指紋圖譜的檢測技術不斷發(fā)展[36]，呈現(xiàn)了從人工到全自動、從低通量高成本到高通量低成本的發(fā)展趨勢。目前煙草栽培品種的測序技術已經(jīng)十分成熟[37]，且測序成本也降到較為經(jīng)濟的水平，高通量測序在煙草上的應用更加深入、廣泛，因此本研究選擇利用測序技術作為檢測指紋圖譜位點分型的技術手段。高通量測序最常遇到的問題是由于測序的隨機性而帶來的位點缺失[38]。例如在本研究中，5個樣品都未檢測到全部339個位點，檢測到位點的比例從68.1%到80.8%，但實際分析結(jié)果證明，該指紋圖譜仍然能有效地進行種質(zhì)資源鑒定。與基于相同 SNP 位點鑒別大批量種質(zhì)[39] 的通用性指紋圖譜相比，本研究開發(fā)的特異性指紋圖譜，需要預先分析每個品種或種質(zhì)的特異 SNP 位點，因此本研究開發(fā)特異性位點分析程序（材料與方法1.3）實現(xiàn)了批量化種質(zhì)資源 SNP 數(shù)據(jù)處理，解決了特異性指紋圖譜開發(fā)的效率問題。綜上所述，基于測序技術的特異性 SNP 指紋圖譜為煙草種質(zhì)資源的保護與鑒定提供了高效、可靠、低成本的技術手段。

我國有豐富的曬晾煙種質(zhì)資源，在國家煙草種質(zhì)資源中期庫保存的煙草種質(zhì)資源中，曬晾煙是數(shù)量最豐富的種質(zhì)類型[40]。瓊中五指山-1作為地方曬煙種質(zhì)資源，不適合直接用于生產(chǎn)，但作為優(yōu)異青枯病抗病種質(zhì)資源，在青枯病抗性品種培育和抗病基因發(fā)掘方面應用前景廣闊。瓊中五指山-1的抗性水平優(yōu)異，且與烤煙主栽品種間遺傳差異更加豐富，因此十分適合作為遺傳定位群體的抗病親本。以瓊中五指山-1為供體親本，開展抗病性狀向主栽品種的定向轉(zhuǎn)移，有希望系列化培育青枯病抗性改良品種。綜上所述，本研究鑒定發(fā)現(xiàn)的優(yōu)異種質(zhì)資源瓊中五指山-1及其特異性 SNP 指紋圖譜，為該種質(zhì)在青枯病抗性育種中的有效應用奠定了堅實基礎。

4 結(jié)論

青枯病人工接種抗性鑒定結(jié)果表明，地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1對我國常見青枯菌序列變種的抗性水平為高抗，是目前我國發(fā)現(xiàn)的抗性最好的種質(zhì)資源之一。構建了由339個 SNP 位點組成的瓊中五指山-1品種特異性指紋圖譜，實際驗證結(jié)果表明，該指紋圖譜簡便、高效、可靠性好，可用于瓊中五指山-1的種質(zhì)資源鑒定。

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