鄭媛媛,聶鵬

(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所,貴州 貴陽(yáng) 550004)

X射線是一種波長(zhǎng)很短甚至人眼不能觀測(cè)的電磁輻射,其顯著特征是穿透力強(qiáng),是人類認(rèn)識(shí)物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的主要工具之一。1895年,德國(guó)物理學(xué)家倫琴首次發(fā)現(xiàn)了X射線,自此,X射線技術(shù)在物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面得到了廣泛的應(yīng)用,成為人類研究物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)、探討內(nèi)在運(yùn)行規(guī)律的重要方法。1912年,勞厄證實(shí)了X射線在晶體中的衍射現(xiàn)象,為X射線晶體學(xué)的產(chǎn)生奠定了實(shí)際應(yīng)用基礎(chǔ)。1913年,布拉格父子第一次用X射線成功地測(cè)定了NaCl的晶體結(jié)構(gòu),并提出了著名的布拉格方程,標(biāo)志著X-射線晶體學(xué)的誕生[1-2],自此,人類終于掌握了認(rèn)識(shí)微觀世界的利器。在后續(xù)的100年里,X-射線衍射技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用,可應(yīng)用于半導(dǎo)體物理學(xué)、固體物理學(xué)、結(jié)構(gòu)化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、藥學(xué)以及醫(yī)學(xué)等,尤其是在化學(xué)和材料學(xué)基礎(chǔ)研究方面。為彰顯X-射線晶體學(xué)在人類歷史發(fā)展中的重要作用,聯(lián)合國(guó)教科文組織將2014年設(shè)定為國(guó)際晶體學(xué)年。本文簡(jiǎn)單介紹了X-射線衍射技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn),同時(shí)總結(jié)了該技術(shù)在藥學(xué)研究領(lǐng)域的部分應(yīng)用,為該技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域的推廣使用提供了支撐。

1 X-射線衍射技術(shù)的應(yīng)用

1.1 X-射線衍射儀的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

X-射線衍射法具有檢測(cè)相對(duì)快速、操作較為簡(jiǎn)單以及數(shù)據(jù)處理較為方便等優(yōu)點(diǎn),其數(shù)據(jù)經(jīng)處理后可反映純凈化合物結(jié)構(gòu)或混合物具體組成,廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)以及藥學(xué)等諸多基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。在現(xiàn)有使用的X-射線衍射儀主要有兩種,分為X-射線單晶衍射儀(SCXRD)和X-射線粉末衍射儀(PXRD)。其中,單晶衍射儀主要用于純凈化合物的晶體結(jié)構(gòu)表征,該類型儀器能直接顯示晶體中的衍射數(shù)據(jù),進(jìn)而通過精修得到晶體中各個(gè)原子的排列順序及化合物具體結(jié)構(gòu),但是該方法通常需要較多的樣品用于培養(yǎng)晶體,其培養(yǎng)時(shí)間和測(cè)試時(shí)間均較長(zhǎng),但隨著光學(xué)和晶體解析軟件的進(jìn)步,其測(cè)試和解析時(shí)間越來越短,極大地提高了該技術(shù)的效率。而粉末衍射儀專門針對(duì)粉晶或混合物,可用來測(cè)定樣品的物相組成,通過與特定數(shù)據(jù)庫(kù)中特征峰形的對(duì)比,進(jìn)而鑒定出其內(nèi)在物質(zhì)組成,也可通過使用對(duì)照品的內(nèi)標(biāo)法定量分析樣品中的某一組分含量。粉末衍射法對(duì)樣品要求較低,塊狀或粉末均可,并且其測(cè)試時(shí)間相對(duì)較短,數(shù)據(jù)分析也相對(duì)簡(jiǎn)單、快速。但是該方法也存在一定缺陷。首先,該方法使用X-射線對(duì)樣品進(jìn)行照射,有可能產(chǎn)生相應(yīng)輻射,對(duì)環(huán)境和人體影響較大,需嚴(yán)格控制測(cè)試環(huán)境。其次,所需樣品用量為毫克級(jí),相對(duì)高效液相色譜法等其他分析方法用量較多。再次,由于該儀器的防護(hù)設(shè)施較大,占地較大并且價(jià)格相對(duì)高昂,限制了其推廣和使用。

1.2 在化藥中的應(yīng)用

化合物經(jīng)過不同的處理方法可以得到具有不同排列形式的晶型,并且同一藥物的不同晶型在溶出度、熔點(diǎn)以及生物等效性方面會(huì)有顯著差異,也會(huì)對(duì)藥物的穩(wěn)定性以及具體療效產(chǎn)生不同的影響。2007年美國(guó)FDA發(fā)布《仿制藥晶型研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》,提出了評(píng)價(jià)多晶型質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的必要性。XRD可有效區(qū)分化合物分子結(jié)構(gòu)或混合物特征信號(hào),是物質(zhì)結(jié)構(gòu)表征的有效方法之一。

西咪替丁的晶體具有四種不同的晶型排列,由于這四種晶型的溶出情況不同,從而導(dǎo)致其實(shí)際療效有一定區(qū)別。陳永康[3]等人通過不同的重結(jié)晶條件制備出了四種不同晶型的西咪替丁晶體,并通過相應(yīng)實(shí)驗(yàn)和表征表明,A晶型物質(zhì)在不同實(shí)驗(yàn)條件下的特征譜線基本吻合,溫度、濕度以及光照等參數(shù)對(duì)該晶型物質(zhì)的影響不大。而改變PXRD的電壓、電流或掃描速度等測(cè)試條件,篩選出了信噪比高、掃描速度快、重現(xiàn)性好的最優(yōu)測(cè)試條件,全方面論證了該晶型的穩(wěn)定性。該測(cè)試方法可以用于原料藥到制劑成品之間諸多處理環(huán)節(jié)的物質(zhì)晶型變化監(jiān)控,可以有效地分別該藥品的變化情況,從而保證了藥品的質(zhì)量。

通常來講,SCXRD(單晶X-射線衍射技術(shù))是解析物質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的權(quán)威方法,但是生長(zhǎng)出符合SCXRD尺寸和穩(wěn)定性要求的晶體較為困難,而PXRD的數(shù)據(jù)能夠解析出物質(zhì)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)而不受晶體培養(yǎng)的制約,逐漸成為SCXRD的有效補(bǔ)充及拓展。潘晴晴[4]等人比較了兩種不同XRD測(cè)試灰黃霉素晶體的方法。根據(jù)測(cè)試數(shù)據(jù)對(duì)比,兩種方法測(cè)得的晶胞參數(shù)最大相對(duì)偏差均小于0.5%,其鍵長(zhǎng)鍵角數(shù)據(jù)也基本相符,不過,兩者的鍵角和鍵長(zhǎng)最大相對(duì)偏差分別為2.49%和4.19%,可能原因?yàn)槭褂玫腞ietvld模塊精修功能較弱,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。隨著PXRD技術(shù)的改進(jìn)和處理方法的提升,PXRD可作為SCXRD的有力輔助工具,在有機(jī)小分子結(jié)構(gòu)表征方面有著廣泛的用途。

XRD也可以與其他檢測(cè)方法共同使用,用于表征不同配方藥品的物質(zhì)結(jié)構(gòu),進(jìn)而聯(lián)合其他檢測(cè)數(shù)據(jù)分析出最優(yōu)的配方組成。顧念[5]等人通過掃描電子顯微鏡法SEM、PXRD以及差示掃描量熱法(DSC)表征了他克莫司分散體的結(jié)構(gòu)。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),他克莫司原料藥在3°～20°有強(qiáng)的結(jié)晶衍射峰,輔料在此角度無特征衍射峰,而制劑分散體XRD圖中僅存在輔料衍射峰,未出現(xiàn)原料藥的結(jié)晶衍射峰,說明該藥物分散體中不存在他克莫司晶體。由此可以推測(cè),輔料能有效抑制他克莫司晶體的形成,導(dǎo)致在制劑中他克莫司是以無定形狀態(tài)存在。羅雪玲[6]等人通過浸漬離心法制備了負(fù)載姜黃素的金納米復(fù)合微粒,使用粒度分析儀、XRD、紅外、熱重等方法表征了該復(fù)合微粒的結(jié)構(gòu)。在XRD圖中,發(fā)現(xiàn)該金納米微粒顯示了四個(gè)特征衍射峰,峰形清晰且尖銳,表明復(fù)合微粒的晶化程度較高。通過實(shí)驗(yàn),確定了該微粒的最大載藥量,并優(yōu)化了該納米微粒的載藥和緩釋性能。蘇文強(qiáng)[7]等人也通過XRD、DSC以及溶出法對(duì)姜黃素和半胱氨酸的混合物進(jìn)行表征及測(cè)試,發(fā)現(xiàn)研磨法制備出的藥物特征峰信號(hào)明顯,并且沒有新的衍射峰。結(jié)合溶出數(shù)據(jù)表明加液研磨并沒有改變藥物的晶型,該藥物相對(duì)比較穩(wěn)定。

XRD也可用于晶體的定量分析,通常為單峰法或全譜法。全譜法準(zhǔn)確度高,但是很多藥物暫時(shí)沒有或者很難得到晶體結(jié)構(gòu)文件(cif文件),其廣泛使用受到一定限制,而單峰法對(duì)樣品的信息要求較少,同時(shí)具有簡(jiǎn)便和靈敏等優(yōu)點(diǎn),適用于較多藥品晶體定量分析情況,但是該方法需要純度較高的對(duì)照品,同時(shí)該方法中樣品的形態(tài)也會(huì)對(duì)準(zhǔn)確度和重復(fù)性產(chǎn)生影響。樓永軍[8]等人挑選了這兩種晶型中的不同特征峰作為參照,通過PXRD建立了厄貝沙坦中晶型A和晶型B的定量分析方法。以特征峰的峰面積作為考察對(duì)象,開展了線性范圍、檢測(cè)限以及其他相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)表明該方法專屬性強(qiáng),線性關(guān)系良好,為厄貝沙坦的晶型質(zhì)量控制提供了有力的技術(shù)支撐。據(jù)報(bào)道,鹽酸文拉法辛至少有6種晶型,而在實(shí)際生產(chǎn)中以晶型2為主。徐婷[9]等人以純晶型作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),考察鹽酸文拉法辛藥品的穩(wěn)定性。經(jīng)PXRD檢測(cè)和分析,發(fā)現(xiàn)該藥物在48 h內(nèi)組成穩(wěn)定,其不同晶型的含量變化基本無偏差,證明該方法可廣泛應(yīng)用于不同晶型混合物的定量分析和結(jié)晶度的測(cè)定。

1.3 在中藥中的應(yīng)用

XRD在中藥研究中也有較多的應(yīng)用,可以鑒定中藥配方中某一單體的真實(shí)結(jié)構(gòu),也可以用來分析中藥配方的具體組成。時(shí)偉[10]等人以方解石的X射線衍射試驗(yàn)為例,分析單晶衍射SCXRD和粉末衍射PXRD的優(yōu)劣。其結(jié)果顯示:單晶衍射適合晶體尺寸較大、成分比較純凈的樣品測(cè)定,而粉末衍射更適合晶體顆粒較小或成分不太純凈的樣品,可有效地測(cè)定樣品的成分和雜質(zhì)組成。楊東愛[11]等人首次從土甘草中分離了土甘草A,生長(zhǎng)出了該化合物的晶體并通過SCXRD進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,確定了土甘草A的分子構(gòu)型和晶體結(jié)構(gòu)。

徐旖旎[12]等人以載藥量、包封率和收率為主要指標(biāo),使用掃描電鏡、紅外以及PXRD等表征儀器,確定了丹參酮IIA微球的最佳處方工藝。經(jīng)XRD表征發(fā)現(xiàn),樣品的峰為二者簡(jiǎn)單疊加而成,在圖中仍然存在藥物晶體的信號(hào),說明藥物在該微球中仍然以晶體形式存在,同時(shí)也經(jīng)紅外信號(hào)分析,在紅外圖譜中未觀測(cè)到新的信號(hào)峰,證實(shí)藥物未與吸附材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。張立娟[13]等人利用XRF、PXRD以及FT-IR技術(shù)對(duì)廣藿香的主要組分及微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定,建立了鑒別中藥材主要成分以及產(chǎn)地特征的新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,廣藿香中含有K、Ca、P、Cl等元素,其獨(dú)有的元素特征譜是廣藿香道地藥材鑒別的基礎(chǔ),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該藥材含有大量的晶態(tài)物質(zhì)及少量非晶態(tài)物質(zhì)。該法聯(lián)用XRF、PXRD以及FT-IR技術(shù),從元素、原子以及分子層面表征了廣藿香的主要成分和微觀結(jié)構(gòu),避免了某種方法單獨(dú)使用的缺陷,又避免了前處理的復(fù)雜工藝影響樣品的原有特征,具有快速、簡(jiǎn)潔以及再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),為中藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了新借鑒和參考。李燕華[14]報(bào)道了一種包含漆黃素的超分子體系,并利用核磁共振(NMR)、PXRD、DSC、SEM以及UV等技術(shù)對(duì)該包合物進(jìn)行分析和表征。經(jīng)PXRD檢測(cè),藥物漆黃素與環(huán)糊精的包合物信號(hào)與單體有所區(qū)別,其衍射峰的強(qiáng)度較漆黃素單體顯著減弱,而包合物本身的衍射峰有小部分環(huán)糊精的特征峰信號(hào),可能原因?yàn)槠狳S素與環(huán)糊精發(fā)生部分化學(xué)反應(yīng),使得XRD圖存在差異。通過XRD等表征手段確定了漆黃素與環(huán)糊精衍生物的最佳比例,使得該藥物的水溶性、熱穩(wěn)定性以及生物環(huán)境穩(wěn)定性都得到了極大地提升。

中藥配方顆粒是中藥走向國(guó)際化、標(biāo)準(zhǔn)化的重要步驟,對(duì)其質(zhì)量控制也顯得尤其重要。XRD技術(shù)可在無損傷的條件下,直觀反映藥品的綜合信息。礦物藥也是中藥和配方顆粒的重要組成,由于各個(gè)地區(qū)的環(huán)境不同以及制劑加工環(huán)節(jié)和方法不一,礦物藥的成分和含量也有所區(qū)別。通過PXRD技術(shù)對(duì)礦物藥進(jìn)行表征,同時(shí)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì),可以分析出礦物藥的基本組成。王向麗[15]等人利用X-射線粉末衍射技術(shù),優(yōu)化了測(cè)試條件,對(duì)自然銅的組成進(jìn)行表征和物相分析,并將其結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)。測(cè)試結(jié)果表明,四種自然銅樣品均含有二硫化鐵和硫化亞鐵,廠家A的配方顆粒和中藥材樣品中含有氧化鐵,而另一廠家的藥品中含有四氧化三鐵。同時(shí)也發(fā)現(xiàn),由于不同廠家生產(chǎn)配方顆粒的原料產(chǎn)地不同、生產(chǎn)炮制工藝及輔料添加,使得同種的配方顆粒測(cè)試結(jié)果以及中藥材測(cè)試結(jié)果存在較大差異。同時(shí),他們也應(yīng)用了聚類分析法,對(duì)赤石脂、磁石、赭石進(jìn)行PXRD的表征及物相分析,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

2 小結(jié)及展望

經(jīng)過百年的發(fā)展,X-射線衍射技術(shù)得到了長(zhǎng)久的進(jìn)步和沉淀,已成為物質(zhì)結(jié)構(gòu)表征及解析的關(guān)鍵方法之一。隨著新型光學(xué)技術(shù)和微電子技術(shù)的應(yīng)用、解析軟件的不斷更迭,X-射線衍射技術(shù)在化學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)及醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域得到了越來越廣泛的使用,其檢測(cè)效率更高,處理方法更為簡(jiǎn)單,檢測(cè)結(jié)果更為全面和準(zhǔn)確。在藥學(xué)領(lǐng)域,不僅適用于化藥的結(jié)構(gòu)表征和定量分析,同時(shí)也能適用于中藥和礦物藥的組成分析。通過鑒定樣品的晶型、晶胞以及特征峰信號(hào)等相關(guān)結(jié)構(gòu)信息,結(jié)合其他相關(guān)的分析表征技術(shù),可有效判斷藥物的有效成分及轉(zhuǎn)變途徑,判斷藥物的基本組成和真?zhèn)?探索藥物制劑的最優(yōu)制備方法和路徑。但是相比其他表征技術(shù)而言,X-射線衍射技術(shù)也存在一些不足,例如晶體培養(yǎng)較為困難、定量分析仍需要標(biāo)準(zhǔn)品、所需樣品量相對(duì)較大、測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)解析過程較為復(fù)雜、不能與其他設(shè)備聯(lián)用。盡管如此,隨著科技的發(fā)展和技術(shù)的提升,X-射線衍射技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域會(huì)有更為廣闊的作為。