姜 恒,張 哲,江 申 綜述,董 妥△ 審校

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生微生物學(xué)教研室,黑龍江哈爾濱 150081;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室,黑龍江哈爾濱 150081

呼吸道感染常由多種病原體,包括病毒、細(xì)菌、支原體等引起[1],其中呼吸道病毒或直接、或作為增效病原體、或作為輔助因素參與呼吸道感染的發(fā)生和發(fā)展[2]。常見的呼吸道病毒包括流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒及引發(fā)全球大流行的新型冠狀病毒等。由于呼吸道病毒傳染性強(qiáng)、傳播途徑廣且缺乏特效藥物[3],因此,早檢測、早診斷是阻斷呼吸道病毒傳播的重要手段。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)雖在準(zhǔn)確性和權(quán)威性方面有絕對優(yōu)勢,但因操作繁雜、耗時(shí)較長及生物安全風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)[4],無法滿足臨床檢測需求?，F(xiàn)階段主要使用的檢測方法包括核酸檢測及免疫學(xué)檢測,均存在需配備專業(yè)實(shí)驗(yàn)室、人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)、成本過高、耗時(shí)過長等特點(diǎn)[5],已無法滿足日益增長的呼吸道病毒大規(guī)?，F(xiàn)場快速檢測需求。因此,新型呼吸道病毒檢測技術(shù)的研發(fā)迫在眉睫。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)作為一種已在多領(lǐng)域應(yīng)用的重要光譜學(xué)檢測技術(shù)[6-7],具有優(yōu)良的靈敏度和特異度[8],具備成為一種大規(guī)模呼吸道病毒快速檢測新技術(shù)的潛力。拉曼散射是指當(dāng)光照射到物質(zhì)上發(fā)生散射時(shí),波長發(fā)生變化的散射光被稱為拉曼散射。波長發(fā)生改變的原因是光子與被照射物質(zhì)分子間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移后,分子振動(dòng)能級發(fā)生了改變[9],而光子在不同物質(zhì)上發(fā)生拉曼散射時(shí)轉(zhuǎn)移的能量不同,就可特異性識別被照射物質(zhì)種類。而SERS技術(shù)則是在普通拉曼散射的基礎(chǔ)上將被照射物質(zhì)貼附于粗糙貴金屬表面,使拉曼信號強(qiáng)度獲得極大提升。目前,SERS增強(qiáng)機(jī)制主要包括物理增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)。物理增強(qiáng)主要依靠電磁場增強(qiáng)[10];化學(xué)增強(qiáng)主要依靠非共振增強(qiáng)、共振增強(qiáng)及類共振增強(qiáng)[11]。在普通拉曼散射固有的無損分析、不受水成分影響、樣品不需要復(fù)雜處理、檢測速度快、使用便攜式儀器可進(jìn)行現(xiàn)場分析等優(yōu)勢基礎(chǔ)上,SERS技術(shù)具有更高的靈敏度,在某些條件下可以達(dá)到單分子檢測水平。本文利用SERS技術(shù)對以新型冠狀病毒、腺病毒、流感病毒為代表的多種呼吸道病毒進(jìn)行檢測的研究進(jìn)展及應(yīng)用作一綜述,為尋求更理想的呼吸道病毒檢測方法提供可行的研究思路。

1 SERS在新型冠狀病毒檢測中的應(yīng)用

新型冠狀病毒是第7種可感染人類的冠狀病毒類型[12],由于其傳染性極強(qiáng)且尚無具有明確效果的治療藥物[13],因此,開發(fā)一種超快速、高靈敏的新型檢測方法尤為重要。樂瑋等[14]利用金納米顆粒(Au NPs)對新型冠狀病毒的刺突蛋白進(jìn)行了無標(biāo)記SERS檢測,帶負(fù)電的羧基基團(tuán)與Au NPs表面吸附的檸檬酸根離子產(chǎn)生競爭吸附而發(fā)生分子增強(qiáng),氨基則與Au NPs發(fā)生了電磁增強(qiáng)效應(yīng),使新型冠狀病毒的刺突蛋白拉曼信號明顯增強(qiáng),其最低檢測下限達(dá)到1 mmol/L。樂瑋等[14]方法不同于以病毒核酸或抗體為靶點(diǎn)進(jìn)行檢測,而是從病毒抗原蛋白入手,與目前常用的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)比較,該新型檢測技術(shù)耗時(shí)更短;與膠體金試紙法比較則避免了出現(xiàn)假陰性誤判的問題。ZHANG等[15]開發(fā)了一種基于新型的油/水/油三相液-液界面自組裝工藝的超靈敏生物傳感器以檢測未處理唾液中的新型冠狀病毒,利用上述工藝將兩層Au NPs固定在硅晶片上形成SERS活性基底,再將特異性刺突蛋白抗體偶聯(lián)到基底上以捕獲刺突蛋白,并使用拉曼報(bào)告分子標(biāo)記的銀納米顆粒(Ag NPs)作為標(biāo)記來識別抗原的種類和濃度。這種夾層免疫結(jié)構(gòu)自組裝方式使納米顆粒單層具有良好的均勻性和重復(fù)性,保證SERS檢測的高靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。LEONG等[16]設(shè)計(jì)了一款基于SERS的手持式新型冠狀病毒檢測儀,其內(nèi)包含了搭載3組SERS探針分子(分別為2-巰基苯甲酸、4-巰基吡啶和三磷酸腺苷)的芯片,SERS探針分子附著于Ag NPs表面。被檢者向設(shè)備呼氣10 s左右,由于呼氣中的新型冠狀病毒生物標(biāo)志物會(huì)與傳感器發(fā)生化學(xué)反應(yīng),故可根據(jù)SERS信號的變化對反應(yīng)后的化合物進(jìn)行表征。在醫(yī)院和機(jī)場對501人進(jìn)行的新型冠狀病毒現(xiàn)場檢測結(jié)果表明,LEONG等[16]設(shè)計(jì)的檢測方法的假陰性率為3.8%,假陽性率為0.1%,這與聚合酶鏈反應(yīng)檢測的準(zhǔn)確性相當(dāng),但費(fèi)用更低,可在5 min內(nèi)完成檢測。此外,LEONG等[16]設(shè)計(jì)的儀器不僅可檢測生物源揮發(fā)性有機(jī)物種類改變,還可用于篩查其他類型呼吸道病毒感染。

為滿足超快速、高靈敏、低成本的檢測需求,無標(biāo)記直接捕獲病毒粒子本身SERS信號顯得尤為重要。ZHANG等[17]采用硼氫化鈉作為還原劑制備Ag NPs,不僅可避免檸檬酸鈉本身的雜峰信號,而且還會(huì)阻止Ag NPs表面氧化銀的形成,以增強(qiáng)其與病毒表面氨基的結(jié)合,硼氫化鈉還可以誘導(dǎo)Ag NPs聚集成熱點(diǎn),明顯增強(qiáng)病毒粒子的拉曼信號,最低檢測下限可達(dá)10 copy/mL。此外,可通過主成分分析方法,利用SRES技術(shù)無標(biāo)記鑒別唾液及血清中的新型冠狀病毒、H1N1流感病毒、人腺病毒,具有較好的臨床應(yīng)用前景。

2 SERS在流感病毒檢測中的應(yīng)用

流感病毒具有較高的傳染性和突變率,可造成季節(jié)性流行甚至全球性大流行,給公共健康帶來沉重負(fù)擔(dān)[18]。因此,需要探索一種較常規(guī)的、更加準(zhǔn)確敏捷的流感病毒檢測方法,以便在流感暴發(fā)前通過及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測來遏制其蔓延。將SERS技術(shù)應(yīng)用到流感病毒檢測這一方向已有諸多研究,CHEN等[19]開發(fā)了一種基于SERS的雙模DNA適配體傳感器,可實(shí)現(xiàn)對H1N1流感病毒的快速診斷與鑒別診斷,該傳感器裝配了包裹有H1N1流感病毒特異性DNA適配體的罌粟花狀A(yù)u NPs,當(dāng)流感病毒靠近傳感器時(shí),相應(yīng)的DNA適配體與病毒結(jié)合,Au NPs選擇性地脫離底物,使報(bào)告分子峰強(qiáng)度發(fā)生改變,此外,該傳感器還能夠定量評估流感病毒濃度且不受交叉反應(yīng)的影響。KIM等[20]開發(fā)了一種針對流感病毒H275Y耐藥突變株(pH1N1)的SERS檢測免疫探針。將可與突變株特異性結(jié)合的6E3抗體包被在Au NPs表面,當(dāng)探針與pH1N1毒株結(jié)合后,其會(huì)在納米顆粒和基板之間形成熱點(diǎn),可明顯增強(qiáng)報(bào)告分子的SERS特征峰強(qiáng)度,且特征峰強(qiáng)度與病毒濃度呈正相關(guān)。利用KIM等[20]的檢測方法可在人鼻咽部抽吸物中捕獲到pH1N1毒株的SERS信號,說明該技術(shù)在診斷耐藥突變毒株感染方面具有應(yīng)用潛力。此外,吳佳豈[21]將免疫磁珠與SERS技術(shù)聯(lián)合,通過H5N1亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體與鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)制備成免疫磁珠,與Au NPs分別組合成“一抗三明治”和“雙抗夾心式”兩種結(jié)構(gòu)。其中,利用“雙抗夾心式”結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)基底對H5N1亞型禽流感的最低檢測下限可達(dá)6×103copy/μL,具有高特異度、高穩(wěn)定性、高靈敏度的優(yōu)勢,并且可在1 h內(nèi)快速完成檢測。WANG等[22]利用SERS-側(cè)流免疫層析技術(shù),將Fe3O4包被的Ag NPs作為磁性材料,特異性地識別和磁性富集溶液中的H1N1流感病毒?；诖?磁性SERS試紙條可直接用于真實(shí)的臨床標(biāo)本檢測,而不需要任何預(yù)處理步驟。WANG等[22]的研究方法針對H1N1病毒的最低檢測下限可達(dá)50 PFU/mL,相對于傳統(tǒng)膠體金抗原檢測法提高了2 000倍,是一種可用于病毒感染早期診斷的潛在工具。

3 SERS在腺病毒檢測中的應(yīng)用

腺病毒可在兒童和成人中引起多種疾病,主要影響呼吸系統(tǒng)、眼睛和消化系統(tǒng),是呼吸道感染的主要病原體之一[23]。近年來,我國多出現(xiàn)呼吸道人腺病毒的局部暴發(fā)[24],尤其是在學(xué)校、軍隊(duì)等聚集人群中,腺病毒的危害更加明顯[25]。劉真真等[26]利用基于雙層拉曼分子2-硝基苯甲酸修飾的銀包金納米顆粒構(gòu)建了拉曼報(bào)告分子-抗原-抗體特異性結(jié)合的“三明治”夾心結(jié)構(gòu),結(jié)合SERS-側(cè)流免疫層析技術(shù)可在15 min內(nèi)對人腺病毒實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測。同時(shí),由于劉真真等[26]研究的方法具有較高的穩(wěn)定性,其定量范圍可達(dá)0.1～1 000.0 ng/mL,理論最低檢測下限為0.1 ng/mL,可視化最低檢測下限為10.0 ng/mL。此外,利用劉真真等[26]研究的增強(qiáng)基底還將腺病毒與包括登革熱病毒、黃熱病毒、西尼羅河病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒在內(nèi)的5種新發(fā)傳染病病原體進(jìn)行特異性鑒定,結(jié)果表明,基于SERS-側(cè)流免疫層析技術(shù)的檢測方法具有高度特異性,不存在交叉反應(yīng)。作者認(rèn)為,劉真真等[22]研究的檢測方法耗時(shí)短、操作簡單、成本低,在腺病毒的現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域有巨大應(yīng)用潛力。張曉蕾[27]設(shè)計(jì)了一種“蓮藕狀”的增強(qiáng)基底,通過將PS材質(zhì)的球體進(jìn)行刻蝕,得到適合病毒尺寸的微納結(jié)構(gòu),克服了傳統(tǒng)納米顆?！盁狳c(diǎn)”較小而無法包裹腺病毒的弊端。由于張曉蕾[27]設(shè)計(jì)的增強(qiáng)基底的中空結(jié)構(gòu)內(nèi)存在較多“熱點(diǎn)”,且病毒在隨機(jī)擴(kuò)散的過程中會(huì)優(yōu)先進(jìn)入微納結(jié)構(gòu),因此其SERS信號會(huì)明顯增強(qiáng)。利用張曉蕾[27]設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)陣列,作者成功捕獲了人5型腺病毒,相對于傳統(tǒng)的金膜基底在靈敏度上有了明顯提升。CHOI等[28]設(shè)計(jì)了一種聯(lián)合液滴沉積技術(shù)的SERS檢測平臺(DCD-SERS),利用該方法檢測對諸如淚液等生物流體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)分析。DCD-SERS技術(shù)具有高重復(fù)性、噪聲獨(dú)立性及均勻性等特點(diǎn),用來檢測生物流體中是否存在腺病毒時(shí),其拉曼位移核心區(qū)域內(nèi)(1 242～1 342波數(shù))的檢測靈敏度及特異度均為100%。配合主成分分析,在不需要其他標(biāo)簽或化學(xué)修飾的情況下即可實(shí)現(xiàn)高化學(xué)結(jié)構(gòu)檢測靈敏度,使SERS技術(shù)成為腺病毒早期診斷的理想選擇。

4 SERS在其他呼吸道病毒檢測中的應(yīng)用

呼吸道合胞病毒具有較強(qiáng)的傳染性,是嬰幼兒急性呼吸道感染的主要原因,可引起細(xì)支氣管炎和肺炎等嚴(yán)重下呼吸道感染[29]。詹蕾[30]構(gòu)建了以酶反應(yīng)產(chǎn)物為報(bào)告分子的SERS免疫分析技術(shù),該技術(shù)以免疫學(xué)檢測原理為基礎(chǔ),構(gòu)建了病毒-抗體-辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗的“三明治”免疫結(jié)構(gòu)。辣根過氧化物酶經(jīng)過氧化氫催化形成TMB+,通過靜電吸附作用吸附至帶有負(fù)電荷的Ag NPs表面,并產(chǎn)生強(qiáng)烈的SERS信號。相比傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法,SERS免疫分析技術(shù)對呼吸道合胞病毒檢測的靈敏度提高了50倍。ZHAN等[31]也利用了相似的原理對呼吸道合胞病毒進(jìn)行檢測,其檢測下限為0.05 pg/mL,相對于比色法的靈敏度提高了20倍。

針對多種呼吸道病毒的高通量檢測,ZHANG等[32]開發(fā)了一種基于SERS納米標(biāo)簽的側(cè)流微陣列技術(shù),該SERS納米標(biāo)簽標(biāo)記編碼包括副流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒在內(nèi)的11種常見呼吸道病毒的核酸序列,因?yàn)闃?biāo)簽的SERS信號放大效應(yīng)及硝化纖維素膜的高表面積體積比,所以能在一個(gè)側(cè)向流動(dòng)微陣列上實(shí)現(xiàn)對11種病原體的高通量快速定量,且具有廣泛的線性動(dòng)態(tài)范圍[(1～5)×104pmol/L]和超高的靈敏度(最低可達(dá)0.03 pmol/L)。

5 小 結(jié)

隨著SERS技術(shù)的發(fā)展,目前將其應(yīng)用在檢測方面主要有3種思路:(1)將特異性的核酸序列、抗體附著在納米顆粒表面構(gòu)成SERS標(biāo)簽,使在復(fù)雜體液中準(zhǔn)確檢測呼吸道病毒成為可能;(2)利用新型增強(qiáng)基底制備技術(shù),使納米顆粒間“熱點(diǎn)”的尺寸更適合于病毒顆粒本身,在提高檢測效率、降低檢測成本的同時(shí),有效避免了唾液、血液等生物背景對檢測結(jié)果的干擾;(3)與其他檢測技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,例如SERS-色譜聯(lián)合應(yīng)用技術(shù),可以將SERS增強(qiáng)基底組裝到光纖上作為高靈敏的檢測傳感器。而SERS與等離子體傳感結(jié)合,可用于生物分子相互作用的高靈敏度的定量檢測。SERS技術(shù)克服了普通拉曼光譜信號較弱的缺點(diǎn),從而獲得普通拉曼光譜不易得到的結(jié)構(gòu)信息?；谄渚哂械母哽`敏度、高特異度、非侵入性、高穩(wěn)定性及出色的高通量檢測能力等優(yōu)勢,SERS技術(shù)在呼吸道病毒檢測方面有巨大的應(yīng)用潛力。

SERS技術(shù)的優(yōu)勢決定了其迅速發(fā)展的必然性,但目前尚有一定的技術(shù)瓶頸有待突破:在病毒檢測方面,仍在探索如何實(shí)現(xiàn)病毒顆粒的高效捕捉,解決因納米顆?！盁狳c(diǎn)”與病毒間大小差異所致的檢測可靠性較差問題。對于日益興起的無標(biāo)簽SERS檢測,雖然消除了設(shè)計(jì)特異性標(biāo)簽的成本,且具有良好的普適性,但尚需要結(jié)合其他技術(shù),如深度學(xué)習(xí)、機(jī)器學(xué)習(xí)等以保證其特異性區(qū)分能力。此外,將增強(qiáng)基底材質(zhì)拓寬到金、銀以外的非貴金屬體系以降低成本及如何構(gòu)建增強(qiáng)效果更好的特殊結(jié)構(gòu)納米顆粒等研究還有待深入。

綜上所述,SERS技術(shù)在呼吸道病毒超快速、高靈敏度檢測應(yīng)用上具有巨大潛力,但仍然需要不斷將技術(shù)完善成熟。