張德文,張 麗 綜述,朱喜丹 審校

1.自貢市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川自貢 643020;2.內(nèi)江衛(wèi)生與健康職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,四川內(nèi)江 641100;3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部,四川瀘州646000

大腸癌(CRC)作為常見的惡性腫瘤,包括結(jié)腸癌和直腸癌。據(jù)國(guó)家癌癥中心2022年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌是排名前5的癌癥,占新發(fā)病例總數(shù)的57.4%[1]。有研究表明,CRC患者在早期無明顯臨床癥狀,85%以上的患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就已經(jīng)是晚期。CRC患者早期進(jìn)行臨床治療,約90%的患者不需要化療,5年生存率可達(dá)95%[2],由此提示開展有組織的早期篩查有助于降低CRC的病死率。現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究認(rèn)為,腫瘤的發(fā)生與抑癌基因的丟失和失活有關(guān),發(fā)生表觀遺傳學(xué)的累積改變,該改變可以在癌癥早期通過高靈敏度技術(shù)檢測(cè)到[3]。DNA甲基化是目前最早被發(fā)現(xiàn)、研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一[4]。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)島的高甲基化,是諸多癌癥發(fā)生早期的重要事件之一。因此,DNA甲基化相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)有望成為CRC早期診斷的重要手段。本文就近年來DNA甲基化在CRC早期診斷中的應(yīng)用展開綜述,以期為后續(xù)研究CRC的早期診斷提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 表觀遺傳學(xué)、甲基化及其在CRC中的作用

廣義的表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的情況下,通過DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA表達(dá)等方式發(fā)生可遺傳的表型變化。表觀遺傳學(xué)控制的基因表達(dá)模式破壞會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病、癌癥和各種其他疾病。表觀遺傳的畸變?cè)诩膊≡缙诰涂梢员粰z測(cè)出來[5],并且相比遺傳變化的難以逆轉(zhuǎn),表觀遺傳所導(dǎo)致的變化可以在藥物干預(yù)下發(fā)生一定逆轉(zhuǎn)。隨著靶向基因表達(dá)調(diào)控中所涉及的特定表觀遺傳機(jī)制藥物的發(fā)展,表觀遺傳工具的開發(fā)和利用是一種可應(yīng)用于各種疾病治療的有效方法。因此,表觀遺傳學(xué)可作為新興工具用于癌癥的診斷和治療。

DNA甲基化是生物體內(nèi)普遍存在的表觀遺傳調(diào)節(jié)方式[6]。甲基化是DNA重要的修飾方式之一,是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下,S-腺苷甲硫氨酸中的甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到基因組DNA序列上CpG島的二核苷酸胞嘧啶的5′C端,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的過程[7]。其中CpG島是指基因組中一段含有大量C和G的重復(fù)序列區(qū)域。CRC抑癌基因中的CpG島甲基化通常位于基因組C、G含量大于50%的啟動(dòng)子區(qū)域[8]。相對(duì)于結(jié)腸鏡檢測(cè),CRC中基因甲基化的檢測(cè)具有無創(chuàng)傷性、無侵入性、無飲食限制等優(yōu)點(diǎn),并且與早期診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)情況均密切相關(guān)[9]。

2 CRC早期診斷的常用DNA甲基化基因

2.1黏結(jié)蛋白聚糖2(SDC2)基因 SDC2基因?qū)儆赟yndecans家族,該家族由進(jìn)化保守的4個(gè)不同基因編碼的Ⅰ型跨膜蛋白聚糖構(gòu)成,其中SDC2由糖胺聚糖鏈共價(jià)連接的蛋白質(zhì)核心組成[8]。有研究表明,SDC2主要在間充質(zhì)細(xì)胞,如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá),具有調(diào)節(jié)組織發(fā)育與穩(wěn)態(tài)的功能,包括細(xì)胞增殖、分化、黏附、細(xì)胞骨架組織、遷移、傷口愈合、細(xì)胞基質(zhì)通信、血管生成,還與炎癥反應(yīng)和癌癥的發(fā)生有關(guān)[9-10]。眾所周知,大多數(shù)癌癥是由息肉引起的,息肉癌變過程需要10～15年,開始于異常的隱窩,演變?yōu)槟[瘤前期病變(息肉),最終發(fā)展為結(jié)直腸癌[3]。2017年,OH等[11]通過單向線性靶標(biāo)富集(LTE)和SDC2的定量甲基化特異性實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qMSP)檢測(cè)不同分期(Ⅰ～Ⅳ期)CRC患者(n=50)和癌前病變患者(n=21)及健康體檢者(n=22)糞便中SDC2甲基化的DNA,其檢測(cè)CRC的總體靈敏度為90.0%,檢測(cè)小息肉的總體靈敏度為33.3%,特異度為90.9%。HAN等[12]通過對(duì)245例CRC患者糞便DNA中SDC2基因進(jìn)行LTE和qMSP檢測(cè),CRC(0～Ⅳ期)的總體靈敏度為90.2%,特異度為90.2%;早期(0～Ⅱ期)的靈敏度為89.1%(114/128);晚期和非晚期腺瘤的檢出率分別為66.7%(2/3)和24.4%(10/41),表明SDC2甲基化具備作為CRC早期檢測(cè)的潛力。

梁霞等[13]通過比較56例原發(fā)性CRC患者與50例健康體檢者的SDC2甲基化表達(dá)量、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)水平發(fā)現(xiàn),SDC2甲基化基因在CRC組織中呈高表達(dá),并且SDC2甲基化基因診斷CRC的靈敏度和特異度均高于CEA、CA19-9及CEA聯(lián)合CA-199的診斷結(jié)果。同時(shí),MA等[14]以一種新的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)試劑用于102例CRC患者中SDC2 CpG島中含有2個(gè)差異甲基化區(qū)域的檢測(cè),結(jié)果顯示,單獨(dú)通過甲基化SDC2-A檢測(cè)CRC的靈敏度為85.3%,特異度為96.2%;單獨(dú)甲基化SDC2-B檢測(cè)的靈敏度為83.3%,特異度為97.7%。然而,當(dāng)甲基化SDC2-A和甲基化SDC2-B合并時(shí),檢測(cè)CRC的靈敏度提高至87.3%,特異度降低為94.6%。這預(yù)示著對(duì)SDC2 CpG島中多個(gè)差異甲基化區(qū)域進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)將更有助于CRC的早期診斷,并且檢測(cè)結(jié)果相比腫瘤標(biāo)志物更準(zhǔn)確。事實(shí)上,CRC發(fā)生前期,腫瘤細(xì)胞脫落到結(jié)直腸腔的頻率是正常大腸細(xì)胞的4～5倍,且早于血管侵襲[15],因此,從理論上講,糞便SDC2基因檢測(cè)比血液更適合作為早期發(fā)現(xiàn)大腸腫瘤的標(biāo)本,NIU等[7]的研究結(jié)果也證明了這一結(jié)論。

2.2胞裂蛋白9(SEPT9)基因 SEPT9基因?qū)儆诩?xì)胞骨架三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白家族[16]。目前,在哺乳動(dòng)物中已鑒定出13個(gè)SEPT基因(SEPT1～SEPT12和SEPT14),可以分為4個(gè)亞組(SEPT2、SEPT3、SEPT6和SEPT7)。其中SEPT9是一種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,在細(xì)胞分裂過程中協(xié)調(diào)肌球蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白[17]。當(dāng)SEPT9基因在體內(nèi)異常表達(dá)或出現(xiàn)缺失時(shí),細(xì)胞分裂會(huì)受到嚴(yán)重影響,在一定程度上導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。AMIR等[18]提出,SEPT9過表達(dá)可抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的泛素化和降解,提高HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性和下游基因,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子過表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤組織的血管生成,這為腫瘤的增殖和浸潤(rùn)奠定了基礎(chǔ)。在CRC中,當(dāng)SEPT9基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島出現(xiàn)高度甲基化時(shí),會(huì)阻斷SEPT9基因的表達(dá),導(dǎo)致其抗癌功能喪失。2008年以來,已有許多研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表了一系列通過檢測(cè)SEPT9基因甲基化來監(jiān)測(cè)CRC的臨床數(shù)據(jù)。TTH等[19]使用EpiproColon2.0 RT-PCR定性檢測(cè)93例結(jié)直腸癌患者和94例健康體檢者的血標(biāo)本,相對(duì)于糞便隱血試驗(yàn)、癌胚抗原(CEA)和EpiproColon1.0 RT-PCR的檢測(cè),EpiproColon2.0 RT-PCR檢測(cè)CRC的靈敏度為79.3%,特異度為98.9%,其中對(duì)Ⅰ期CRC的靈敏度為95.6%,特異度為84.8%,對(duì)Ⅱ～Ⅳ期CRC的靈敏度可達(dá)100.0%,特異度為98.9%。這表明SEPT9基因比糞便隱血試驗(yàn)和CEA更敏感和特異,也更適合于CRC Ⅱ～Ⅳ期患者的評(píng)估。

2.3分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(SFRP1)基因 SFRP1基因?qū)儆赟FRPs家族,是新近發(fā)現(xiàn)的對(duì)Wnt信號(hào)通路有抑制作用的候選抑癌基因[20]。SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的高度甲基化是基因失活的重要原因,Wnt信號(hào)通路的異常激活會(huì)使CRC中細(xì)胞凋亡受到抑制,腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大量增殖[21]。SFRP1基因不僅在早期CRC中會(huì)出現(xiàn)高度甲基化,而且在大腸息肉患者中也會(huì)出現(xiàn)。銀廣悅等[22]選取32例健康體檢者(對(duì)照組)與50例CRC患者(CRC組)、30例大腸增生性息肉患者(增生組)、36例大腸腺瘤患者(腺瘤組)作為研究對(duì)象,分析糞便中Wnt抑制因子-1(WIF-1)及SFRP1基因甲基化情況后發(fā)現(xiàn),CRC組WIF-1及SFRP1基因甲基化率為60.0%及64.0%,增生組為20.0%及20.0%,腺瘤組為44.4%及52.8%。聯(lián)合WIF-1及SFRP1檢測(cè)對(duì)大腸腺瘤及CRC的靈敏度分別為66.7%及76.0%,且2個(gè)基因在腺瘤組及CRC組中的甲基化水平均高于對(duì)照組及增生組。

3 DNA甲基化基因與其他技術(shù)聯(lián)合診斷CRC

目前,CRC的診斷方法較多,包括糞便隱血試驗(yàn)、結(jié)直腸鏡檢查、血清腫瘤標(biāo)志物篩查、糞便DNA檢查、病理組織活檢等。DNA甲基化作為近年來越來越受認(rèn)可的CRC診斷方法,雖然其具備無創(chuàng)性、無侵入性、較高的靈敏度和特異度,但是標(biāo)本質(zhì)量容易受到患者飲食、藥物等因素的影響,且標(biāo)本處理,尤其是糞便標(biāo)本的處理較為復(fù)雜,限制其用于大范圍人群的篩查。因此,采用DNA甲基化檢測(cè)與其他檢測(cè)方法聯(lián)合診斷CRC,可提高檢測(cè)的診斷價(jià)值。

潘輝等[23]經(jīng)過對(duì)64例CRC患者糞便標(biāo)本進(jìn)行甲基化特異性 PCR檢測(cè)后,糞便基因SDC2和BMP3聯(lián)合檢測(cè)結(jié)直腸癌的診斷效能優(yōu)于BMP3檢測(cè)。譚琪等[24]采用熒光PCR同步檢測(cè)外周血血漿游離SEPT9、SDC2、支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶1(BCAT1)3種基因中甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn),血漿SEPT9、SDC2、BCAT1甲基化聯(lián)合檢測(cè)在CRC組中Ⅰ～Ⅳ期的陽性率分別為72.7%(16/22)、87.2%(34/39)、85.7%(30/35)和96.0%(24/25),其在結(jié)直腸癌Ⅰ～Ⅲ期陽性率明顯高于CEA,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在此研究中可以發(fā)現(xiàn),聯(lián)合分子標(biāo)記物檢測(cè)可在一定程度上提高靈敏度,但臨床早期CRC的診斷還需要結(jié)合其他檢測(cè)方法和臨床癥狀進(jìn)行綜合判斷。

李建等[25]通過收集47例CRC患者和33例非結(jié)直腸癌體檢者的外周血對(duì)其進(jìn)行SFRP1、SEPT9基因甲基化和糞便隱血試驗(yàn)結(jié)合檢測(cè),結(jié)果顯示,SFRP1和SEPT9基因甲基化診斷結(jié)直腸癌的靈敏度為80.0%,特異度為95.3%,糞便隱血試驗(yàn)的靈敏度為86.3%,特異度為54.3%,二者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為97.6%,特異度為96.8%,明顯高于單項(xiàng)檢測(cè)。李建等[25]研究表明,DNA甲基化與糞便隱血試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)具有無創(chuàng)、采樣簡(jiǎn)單、依從性好、實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定等特點(diǎn),更適合于臨床。吳秀方等[26]評(píng)估對(duì)照組、腺瘤組、早期癌組、進(jìn)展期癌組患者血漿中SEPT9基因甲基化、血清CEA單項(xiàng)及二者聯(lián)合檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),早期癌組患者血漿SEPT9甲基化和血清CEA檢測(cè)的陽性率分別為33.3%和16.7%,二者聯(lián)合檢測(cè)的陽性率可提高至41.7%;進(jìn)展期癌組患者血漿SEPT9甲基化和血清CEA檢測(cè)的陽性率分別為88.9%和55.6%,二者聯(lián)合檢測(cè)的陽性率可達(dá)到100.0%,表明血漿SEPT9甲基化單項(xiàng)檢測(cè)用于鑒別腺瘤和早期癌癥價(jià)值有限,在早期和進(jìn)展期CRC患者中,血漿SEPT9甲基化檢測(cè)陽性率均高于血清CEA,二者聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值更高。高海鋒等[27]在血漿SEPT9甲基化、血清CEA的基礎(chǔ)上,聯(lián)合糖類抗原(CA)724診斷CRC發(fā)現(xiàn),血清CEA檢測(cè)診斷CRC的靈敏度不及血漿SEPT9基因甲基化,但特異度和陰性預(yù)測(cè)值均最高,可以彌補(bǔ)SEPT9基因甲基化和CA724診斷過程中誤診率高的不足;CA724檢測(cè)雖然靈敏度較低,但特異度較SEPT9基因甲基化高,亦可彌補(bǔ)SEPT9基因甲基化誤診率高的不足。SEPT9甲基化、血清CEA、CA724聯(lián)合檢測(cè),很好地實(shí)現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、患者依從性好及適于普查等優(yōu)點(diǎn),極大地提高了CRC的診斷效率。

梁霞等[13]經(jīng)過比較SDC2和SEPT9基因甲基化檢測(cè)的陽性率及二者聯(lián)合結(jié)腸鏡檢查對(duì)進(jìn)展性CRC的檢出率,在1 000例篩查對(duì)象中,糞便SDC2基因甲基化檢測(cè)陽性率明顯高于血漿SEPT9基因甲基化,糞便SDC2基因甲基化檢測(cè)聯(lián)合結(jié)腸鏡檢查的檢出率均明顯高于血漿SEPT9基因甲基化檢測(cè)聯(lián)合結(jié)腸鏡檢查的篩查率,表明糞便SDC2甲基化檢測(cè)聯(lián)合結(jié)腸鏡檢查可作為CRC早期篩查的策略之一。龔志贇等[28]選取結(jié)直腸癌患者51例、結(jié)直腸腺瘤患者22例、健康體檢者39例的糞便和血清標(biāo)本,分析結(jié)果后發(fā)現(xiàn),血清CEA聯(lián)合糞便SDC2基因甲基化檢測(cè)可將SDC2基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)CRC陽性率從84.3%提高至90.2%,有效提升了CRC的檢出率。

4 小 結(jié)

CRC是目前中國(guó)男性發(fā)病率排名第3的癌癥[1],以早期無明顯的臨床病理癥狀,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就已經(jīng)是中晚期為主要特點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行有效早期診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)的檢測(cè)十分必要。目前,雖然檢測(cè)方法較多,但各有優(yōu)缺點(diǎn)。糞便隱血試驗(yàn)診斷CRC的特異度較低,且檢測(cè)結(jié)果易受到食物、藥物等因素的影響而不穩(wěn)定;結(jié)直腸鏡是侵入性檢查,患者依從性較差,且易引起腸穿孔、感染等并發(fā)癥,不易被患者接受;血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)雖然是常規(guī)篩查手段,但其靈敏度和特異度較低,對(duì)于早期病變?cè)\斷價(jià)值不大;DNA甲基化無創(chuàng)傷、無侵入,靈敏度和特異度較高,但標(biāo)本質(zhì)量容易受到患者飲食、藥物等因素的影響。SDC2甲基化在早期結(jié)直腸癌患者的血液和糞便標(biāo)本中檢出率高,并且糞便標(biāo)本SDC2甲基化具備更易檢出,可作為CRC早期檢測(cè)指標(biāo)。但SDC2甲基化單位點(diǎn)檢測(cè)的特異度、靈敏度不如多位點(diǎn),即聯(lián)合檢測(cè)診斷能更快、更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)CRC的發(fā)生和發(fā)展。本研究認(rèn)為,采用DNA甲基化多位點(diǎn)與其他方法聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CRC進(jìn)行診斷,可提高早期診斷價(jià)值。