微小RNA 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡在動(dòng)脈硬化閉塞癥中的研究進(jìn)展

洪碧瑩，顏天華，曹永兵，曹燁民,3，賈成林

動(dòng)脈硬化性閉塞癥（arteriosclerosis obliterans,ASO）是由于管腔狹窄、血管閉塞引起血流量減少或中斷的一種常見的外周血管疾病，具有高致殘率和死亡率的特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國45 歲以上的人群中，ASO 患者占6.6%，且隨著年齡的增長，ASO 的患病率逐漸增加[1]。因缺血程度不同，輕則表現(xiàn)為麻木、低溫、色白等癥狀，重則會(huì)導(dǎo)致間歇性跛行、靜息痛、足部潰瘍或壞疽，甚至危及患者生命。

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)即炎癥性壞死，是一種介于壞死與凋亡之間的程序性細(xì)胞死亡模式，兼具二者的特征[2]。焦亡細(xì)胞中的NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（nod-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）是動(dòng)脈粥樣硬化形成的炎性標(biāo)志物，能激活caspase-1 引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中可通過NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡參與動(dòng)脈粥樣硬化早期過程，內(nèi)皮通透性下降、釋放炎性因子又能進(jìn)一步引起泡沫細(xì)胞堆積，促進(jìn)ASO 病程[5-7]。因此，進(jìn)一步闡明細(xì)胞焦亡在ASO 形成中的機(jī)制和具體作用靶點(diǎn)，可為尋找不良反應(yīng)少、治療效果顯著的ASO 新藥提供新思路。

微小RNA（microRNA, miRNA）是長度為20～25個(gè)核苷酸、高度保守的單鏈非編碼RNA 分子，在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化以及癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用[8-9]。miRNAs 能夠通過堿基互補(bǔ)配對方式識(shí)別mRNA，具有反義抑制mRNA 的3′非翻譯區(qū)沉默基因表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡以及遷移的作用[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs能通過調(diào)節(jié)caspase-1、NLRP3、膜穿孔蛋白Gasdermin-D（GSDMD）等分子影響細(xì)胞焦亡進(jìn)程[11]。而此前已有研究證明miRNAs 也可通過影響內(nèi)皮功能[12]、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞遷移[13]等方式參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程。因此本文將從miRNA、細(xì)胞焦亡兩方面著手，總結(jié)二者在ASO 中的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步研究ASO 發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供新思路。

1 細(xì)胞焦亡在動(dòng)脈硬化閉塞癥中的研究進(jìn)展

1.1 經(jīng)典途徑 由caspase-1 誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥小體NLRP3 激活的細(xì)胞焦亡途徑被稱作經(jīng)典途徑。細(xì)胞受到病原體損害或活性氧（ROS）損傷時(shí)能激活胞質(zhì)中特定的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），包括Toll 樣（toll-like receptors，TLRs）、核苷酸結(jié)合域（nucleotide-binding domain,NBD）和NOD 樣（nod-like receptors，NLRs）以及黑色素瘤缺乏因子類（absent in melanoma，AIMs）[14]。同時(shí)銜接蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）發(fā)生聚集，募集pro-caspase-1 與激活的PRRs 銜接形成炎性小體，導(dǎo)致相鄰的procaspase-1 自剪、水解，活化形成caspase-1[15-16]。caspase-1 激活并介導(dǎo)細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素（IL）-18和IL-1β，同時(shí)還能切割膜穿孔蛋白GSDMD，使GSDMD 親脂性N 末端斷裂，在細(xì)胞膜上形成孔道，引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓改變，細(xì)胞腫脹至裂解發(fā)生焦亡，釋放促炎因子，加劇炎癥反應(yīng)[17-18]?，F(xiàn)有研究表明，粥樣硬化斑塊與內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞發(fā)生caspase-1 和NLRP3 誘導(dǎo)的焦亡有關(guān)。焦亡導(dǎo)致血管通透性增加，募集、激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，引起局部脂質(zhì)沉積、斑塊穩(wěn)定性下降，進(jìn)而導(dǎo)致ASO發(fā)生發(fā)展[19]。

1.2 非經(jīng)典途徑 非經(jīng)典途徑激活的細(xì)胞焦亡途徑不同于經(jīng)典途徑，該途徑是通過細(xì)胞中caspase-4/5/11 直接識(shí)別并結(jié)合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后，啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使促炎因子IL-1β 轉(zhuǎn)錄[20]，同時(shí)caspase-4/5/11 發(fā)生寡聚化被激活后，能對GSDMD 進(jìn)行切割，產(chǎn)生N 端結(jié)構(gòu)域，致使細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞，破壞胞內(nèi)滲透壓，胞內(nèi)物質(zhì)持續(xù)外流，最終引起細(xì)胞焦亡[21]。有研究發(fā)現(xiàn)由caspase-11 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可影響由于微生物感染或內(nèi)皮破損等刺激導(dǎo)致的疾病，特別是具有明顯炎癥特征的疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等發(fā)生[22]。

2 miRNAs 在動(dòng)脈硬化閉塞中的研究進(jìn)展

2.1 miRNAs 調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞從而影響動(dòng)脈硬化閉塞進(jìn)程 內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）是覆蓋在血管內(nèi)表面的單層細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞通過增殖可發(fā)揮修復(fù)血管損傷、防止動(dòng)脈斑塊進(jìn)一步發(fā)展的作用。目前已逐漸證明miRNAs 具有調(diào)節(jié)ECs 增殖的作用，特別是miR-126。研究發(fā)現(xiàn)miR-126-5p 敲除小鼠存在內(nèi)皮修復(fù)功能受阻的問題，這是因?yàn)閙iR-126-5p 具有抑制跨膜蛋白delta-like（DLL1），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的功能[23-24]。miR-126-5p 還能通過抑制caspase-3 p17 亞基二聚化來阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的目的[25]。除此之外，miR-181-5p 和miR-181-3p 可分別通過結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子-β 活化激酶1（transforming growth factor β -activated kinase 1，TAK1） 的連接蛋白（transforming growth factor β-activated kinase 1-binding protein 2，TAB2）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-кB）基因調(diào)節(jié)體，產(chǎn)生協(xié)同抑制NFкB 信號(hào)通路的作用，減輕血管炎癥并延緩動(dòng)脈粥樣硬化[26]。miR-155 則可通過靶向抑制肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）來防止內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高，從而減緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，發(fā)揮血管保護(hù)作用[24]。

2.2 miRNAs 調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞影響動(dòng)脈硬化閉塞進(jìn)程 血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的異常增殖、遷移或表型轉(zhuǎn)換都會(huì)引起管壁增厚乃至管腔狹窄閉塞等問題，對血栓形成、ASO 發(fā)展具有促進(jìn)作用[27]。目前，研究發(fā)現(xiàn)一些miRNAs 可通過調(diào)節(jié)VSMCs 的遷移和表型轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促進(jìn)ASO 的發(fā)生。研究表明，通過抑制miR-4463的表達(dá)水平激活JNK 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)VSMCs發(fā)生遷移和細(xì)胞骨架變化，促進(jìn)ASO 的發(fā)生發(fā)展[28]。而miR-21 則可通過激活A(yù)KT 和ERK1/2 信號(hào)通路，抑制肌動(dòng)蛋白絲收縮，進(jìn)而促進(jìn)VSMCs 遷移，促進(jìn)ASO 的形成[29]。亦有研究表明，在ASO 病理?xiàng)l件下，血管平滑肌細(xì)胞中的miR-338-3p 表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，可引起α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)水平下降，促使VSMCs 由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步促進(jìn)了ASO 發(fā)展[30]。而在ASO 影響下，血漿中的miR-141-5p 表達(dá)減少，會(huì)引起下游高遷移率族蛋白B1 的表達(dá)量上調(diào)，NF-κB通路活化，使VSMCs 細(xì)胞凋亡受到抑制，同時(shí)促進(jìn)VSMCs 遷移，加重ASO 病情[31]。

2.3 miRNAs 調(diào)控巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)影響動(dòng)脈硬化閉塞進(jìn)程 動(dòng)脈壁中的巨噬細(xì)胞由于過度吞噬極低密度脂蛋白而形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)在促炎因子的作用下繼續(xù)聚集、沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積不斷增大，加快了ASO 形成與發(fā)展[32]。miRNAs 可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞膽固醇代謝來參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。研究表明，miRNA-33 可負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞上具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇并形成高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）的ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 A1 （recombinant ATP Binding Cassette Transporter A1，ABCA1）的表達(dá)，進(jìn)而防止巨噬細(xì)胞因膽固醇過度積累轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，抑制ASO 的發(fā)生發(fā)展[33]。同時(shí)，亦有研究表明，miR-144 可下調(diào)ABCA1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制膽固醇的外排速度，降低HDL 的表達(dá)水平，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[34]。除此之外，miRNAs 也可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響ASO 發(fā)展。研究表明，miR-155 受促炎因子與氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）影響，表達(dá)量上調(diào)，可靶向抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1（auppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）的表達(dá)，進(jìn)而激活NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，加快了ASO 進(jìn)程[35-36]。

3 miRNAs 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在動(dòng)脈硬化閉塞癥中的研究進(jìn)展

近年來，諸多研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 通過介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，參與ASO 發(fā)生和發(fā)展。如Wang 等[37]發(fā)現(xiàn)ox-LDL 能夠下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-233 表達(dá)，激活NLRP3 炎性小體，促進(jìn)caspase-1 和GSDMD 的活化，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生焦亡，釋放促炎因子，引起局部炎癥，促進(jìn)ASO 的形成。Li 等[38]則發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p 能抑制NOD 樣模式識(shí)別受體活化，抑制NLRP3 炎性小體和caspase-1 信號(hào)通路活化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，進(jìn)而發(fā)揮抑制ASO 發(fā)生發(fā)展的作用。Yao 等[39]發(fā)現(xiàn)miRNA let-7 在腫瘤壞死因子（TNF）-α 誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠內(nèi)皮細(xì)胞焦亡、釋放IL-1β 中起到了重要的作用。TNF-α 能夠減少沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白 (silent mating type information regulation 2 homolog，Sirt) 家族成員Sirt6 蛋白的表達(dá)，引起let-7 家族表達(dá)水平下調(diào)，使得胞內(nèi)NF-кB信號(hào)通路發(fā)生活化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生焦亡作用，最終加快動(dòng)脈粥樣硬化形成。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p 表達(dá)上調(diào)可負(fù)調(diào)控DNA 去甲基化酶的表達(dá)，引起線粒體功能障礙，促進(jìn)胞內(nèi)ROS水平的上調(diào)，激活caspase-1 經(jīng)典焦亡途徑，促進(jìn)AS 的發(fā)生[40]。Ge 等[41]通過雙熒光素報(bào)告酶等試驗(yàn)證明，暴露在ox-LDL 中的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的miR-635 表達(dá)受到抑制，內(nèi)皮功能受損，使得胞內(nèi)NLRP3 水平升高，caspase-1 與GSDMD 蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡、炎性因子釋放，促進(jìn)ASO 形成。而在針對衰老的研究中也意外的發(fā)現(xiàn)其中一些藥物具有治療ASO 的作用，如褪黑素被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中可產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其作用機(jī)制主要是通過miR-223/NLRP3 軸介導(dǎo)，抑制主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中NF-кB/GSDMD 信號(hào)通路來改善ASO狀況[42]。綜上，miRNAs 可通過不同途徑引起細(xì)胞焦亡從而參與ASO 發(fā)展。據(jù)此可見，靶向miRNAs 調(diào)控細(xì)胞焦亡進(jìn)行ASO 相關(guān)的治療機(jī)制與藥物的研究也并非望空撲影。

4 結(jié)語與展望

近年來，隨著生活壓力的增加、人口老齡化現(xiàn)象的加劇，ASO 的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。目前臨床針對ASO 有植入支架、藥物涂層球囊等腔內(nèi)治療手段，且隨著技術(shù)發(fā)展，腔內(nèi)治療通過結(jié)合準(zhǔn)分子激光粥樣帶切除術(shù)以及Rotarex 機(jī)械血栓切除術(shù)等方法可一定程度上降低手術(shù)并發(fā)癥，降低術(shù)后再狹窄率，但仍然無法處理陳舊血栓與內(nèi)膜增生等問題[43-45]。因此，越來越多的臨床、基礎(chǔ)研究工作者意識(shí)到早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)治療的重要性。細(xì)胞焦亡是伴隨著炎癥反應(yīng)發(fā)生的，不同于細(xì)胞凋亡的一種特殊的細(xì)胞死亡方式，與ASO 發(fā)展、形成的慢性炎癥機(jī)制具有相似之處，且研究表明焦亡相關(guān)基因的水平與斑塊面積、斑塊不穩(wěn)定性呈正相關(guān)性[46-47]。同時(shí)，亦有研究指出，miRNAs 類似物或抑制劑可作為藥物達(dá)到靶向緩解或治療ASO 的作用[48-49]。但針對miRNAs 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡在ASO 發(fā)展過程中的作用研究卻寥寥無幾。本文針對miRNAs 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在ASO 發(fā)展中的作用機(jī)制研究進(jìn)行綜述，以期為ASO 發(fā)病機(jī)制的研究及新藥研發(fā)提供新方向。