曾偉蘭 汪艷

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)。根據(jù)組織學(xué)特征,NAFLD分為非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH),部分可進(jìn)展為肝硬化、肝癌。NAFLD是一種復(fù)雜的多因素疾病,涉及遺傳、表觀遺傳和環(huán)境等多種因素,其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。

肝細(xì)胞富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。ER是真核細(xì)胞內(nèi)區(qū)間體積最大的細(xì)胞器之一。蛋白翻譯折疊、鈣離子穩(wěn)態(tài)、類固醇和脂質(zhì)生物合成、囊泡運(yùn)輸?shù)纫幌盗猩飳W(xué)過(guò)程在ER發(fā)生。生理性或病理性刺激,如B細(xì)胞成熟、葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌、營(yíng)養(yǎng)素剝奪、氧化應(yīng)激、缺氧,以及遺傳突變等都可能影響ER穩(wěn)態(tài),引起ER應(yīng)激。一旦發(fā)生ER應(yīng)激,細(xì)胞將啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài)或執(zhí)行細(xì)胞死亡。UPR可分為兩種類型:當(dāng)發(fā)生輕度或中度ER應(yīng)激時(shí),UPR清除未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白,恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài),該過(guò)程稱為“適應(yīng)性”或“細(xì)胞保護(hù)性”UPR;當(dāng)發(fā)生強(qiáng)烈或持續(xù)ER應(yīng)激時(shí),UPR過(guò)度激活,細(xì)胞內(nèi)部凋亡機(jī)制啟動(dòng),該過(guò)程稱為“適應(yīng)不良的/不受限的/終末的”UPR。此外,經(jīng)典UPR是未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白形成所引起3種UPR感受器活化。盡管游離飽和脂肪酸等刺激對(duì)蛋白折疊反應(yīng)沒(méi)有直接影響,但也可激活UPR感受器,這種情況稱為非經(jīng)典UPR[1]。

肝臟脂質(zhì)異常累積為NAFLD主要起因。肝脂質(zhì)累積通常與胰島素抵抗(IR)同時(shí)發(fā)生,與肝細(xì)胞中ER相關(guān)的蛋白平衡紊亂有關(guān)。ER應(yīng)激是NAFLD的主要觸發(fā)因素之一。研究表明,ER功能障礙可以激活I(lǐng)R和炎癥反應(yīng)等一系列細(xì)胞內(nèi)在應(yīng)激途徑,引起肝損傷或肝細(xì)胞死亡。因此,了解ER應(yīng)激和UPR在NAFLD疾病發(fā)生中的作用將有助于發(fā)現(xiàn)NAFLD的新治療策略。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞UPR由3種信號(hào)通路[也稱為UPR分支(UPR branches)或UPR感受器)]組成,包括肌醇需要酶1(IRE1)、蛋白激酶R(PKR)樣ER激酶(PERK)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78,也稱為BiP)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量控制和降解的分子伴侶。在生理狀態(tài)下,3種UPR感受器與GRP78結(jié)合而處于非活性狀態(tài);當(dāng)ER腔內(nèi)聚集未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白時(shí),這些異常蛋白會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GRP78,將其從UPR感受器分子結(jié)構(gòu)域上解離,引起這些感受器分子活化并級(jí)聯(lián)激活下游信號(hào)通路。另外,ER腔內(nèi)聚集的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白也會(huì)直接與UPR感受器結(jié)合,引起UPR感受器活化[1-2]。

研究表明在NASH患者肝活檢樣本、遺傳和飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型中,均發(fā)現(xiàn)NAFLD發(fā)生與3種UPR感受器激活有關(guān)[3-5]。IRE1是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白,同時(shí)具有蛋白激酶活性與核糖核酸內(nèi)切酶(RNase)活性。在哺乳動(dòng)物基因組中具有IRE1a和IRE1β兩種亞型。IRE1a表達(dá)廣泛,IRE1β僅在腸上皮細(xì)胞表達(dá)[6]。ER應(yīng)激時(shí),BiP從IRE1a脫離后,IRE1a發(fā)生寡聚化和自磷酸化(p-IRE1α)。p-IRE1α經(jīng)自身RNase結(jié)構(gòu)域的催化作用,使X-box 結(jié)合蛋白-1(XBP1)mRNA發(fā)生剪切作用,生成短XBP1 mRNA,短XBP1 mRNA翻譯為有活性的XBP1s蛋白。XBP1s蛋白進(jìn)入胞核激活一系列基因轉(zhuǎn)錄[如ER分子伴侶、ER分泌基因和ER相關(guān)蛋白降解系統(tǒng)(ERAD)作用的分子等)],促進(jìn)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白運(yùn)出ER,從而維持ER穩(wěn)態(tài)。另外,IRE1a的RNase還可通過(guò)一個(gè)被稱為RIDD(regulated IRE1-dependent decay)的過(guò)程降解特定的microRNA(miRNA)和mRNA,參與細(xì)胞的代謝、生存和死亡等過(guò)程[7-8]。

IRE1α-XBP1信號(hào)軸在NAFLD進(jìn)程中激活,促進(jìn)肝脂肪變性和炎癥反應(yīng)發(fā)生。Bax抑制劑-1(BI-1)是一種保守的ER駐留蛋白,可以抑制細(xì)胞死亡。有研究發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠在BI-1基因敲除后,可通過(guò)激活I(lǐng)RE1α RNase活性來(lái)促進(jìn)肝脂肪變性,并且這一作用可被IRE1α核酸內(nèi)切酶抑制劑STF-083010阻斷[3]。在肥胖和糖尿病小鼠模型中,肝臟中BI-1 mRNA表達(dá)降低40%以上,而IRE1α的表達(dá)水平和IRE1α介導(dǎo)的XBP1剪切活性增加。使用腺病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)特異性恢復(fù)BI-1基因敲除的肥胖和糖尿病小鼠肝臟的BI-1水平,發(fā)現(xiàn)BI-1可與IRE1α形成復(fù)合物并嚴(yán)重鈍化XBP1 mRNA的剪切活性,顯著改善小鼠的葡萄糖耐受不良[9]。此外,活化的IRE1α可通過(guò)XBP1促進(jìn)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶基因(SPT)的轉(zhuǎn)錄,刺激肝細(xì)胞釋放富含神經(jīng)酰胺的炎性細(xì)胞外囊泡(EVs),增加肝臟中巨噬細(xì)胞的募集,EVs將肝細(xì)胞ER應(yīng)激傳遞給巨噬細(xì)胞,進(jìn)一步加重高脂肪、高果糖和高膽固醇(FFC)飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)和肝損傷。相反,抑制肝細(xì)胞IRE1α表達(dá),可減少FFC誘導(dǎo)NASH小鼠EVs釋放和巨噬細(xì)胞聚集,減輕炎癥和肝損傷[10]。這些結(jié)果提示,開(kāi)發(fā)阻斷IRE1α信號(hào)通路的抑制劑或靶向抑制EVs釋放也許是NASH的潛在治療策略。

然而,有研究發(fā)現(xiàn),雖然肥胖小鼠肝臟中IRE1α磷酸化水平、c-Jun N端激酶(JNK)活性和UPR靶基因表達(dá)均增加,但是XBP1剪切活性仍然受損。Yang等[11]發(fā)現(xiàn),一氧化氮合酶(iNOS)刺激瘦素缺陷型(ob/ob)肥胖小鼠和HFD飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠肝組織IRE1α發(fā)生S-亞硝基化(S-Nitrosylation)引起IRE1α RNase活性下降,導(dǎo)致IRE1a介導(dǎo)的XBP1剪接活性降低,并促進(jìn)JNK活性增加。相反,通過(guò)抑制IRE1α的S-亞硝基化可以重新恢復(fù)肝臟中IRE1α表達(dá)以及XBP1剪接活性,降低JNK活性,改善NAFLD小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。這提示NAFLD疾病進(jìn)程中,UPR感受器上游信號(hào)分子(如iNOS)激活也會(huì)影響IRE1α活性,可能導(dǎo)致ER功能受損和ER應(yīng)激延長(zhǎng)。

此外,在慢性ER應(yīng)激中IRE1α可能對(duì)NAFLD疾病具有保護(hù)作用。Wang等[12]發(fā)現(xiàn),HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠和肝脂肪變性患者的肝組織中IRE1α發(fā)生S-亞硝基化誘導(dǎo)IRE1α RNase活性失活,同時(shí)參與肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵miRNA亞群水平上調(diào),特別是miR-34和miR-200家族降解減少。與野生型HFD組小鼠相比,在肝細(xì)胞特異性敲除IRE1a基因(IRE1a-/-)的NAFLD小鼠肝組織,以及油酸或棕櫚酸刺激的由IRE1a-/-小鼠分離的原代肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞缺乏IRE1α可顯著增加miR-34和miR-200家族的豐度,并且積累更多的中性脂質(zhì)。因此猜測(cè)NAFLD時(shí)IRE1α RNase活性受損可能是由于S-亞硝基化的修飾。miRNA豐度的增加可能是IRE1α的RNase活性受損導(dǎo)致對(duì)miRNA降解減少。因此,IRE1α在NASH中的作用差異可能與IRE1α的RNase活性調(diào)節(jié)XBP1剪接水平和RIDD過(guò)程二者之間的平衡有關(guān),但也不排除存在類似于BI-1等其他分子參與調(diào)控的可能性。值得注意的是,在營(yíng)養(yǎng)限制或補(bǔ)充氧化劑的代謝飲食,如蛋氨酸和膽堿缺乏飲食(MCD),和致動(dòng)脈粥樣硬化飲食誘導(dǎo)小鼠的肝組織發(fā)生的急性ER應(yīng)激,可能激活經(jīng)典IRE1α-XBP1 UPR途徑。相反,長(zhǎng)期HFD飲食誘導(dǎo)的慢性ER應(yīng)激可能導(dǎo)致NAFLD疾病小鼠肝組織發(fā)生IRE1α亞硝基化并抑制IRE1α RNase活性[12]。

PERK是真核翻譯起始因子2α(eIF2α)激酶家族的成員之一。在ER應(yīng)激中,PERK激活使eIF2α的Ser51位點(diǎn)發(fā)生磷酸化并降低蛋白翻譯速度,限制新生蛋白向ER腔內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),減少ER蛋白折疊負(fù)荷,起到保護(hù)細(xì)胞的作用。同時(shí),PERK介導(dǎo)的eIF2α磷酸化可選擇性允許某些mRNA(如激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4))翻譯。ATF4可通過(guò)激活編碼抗氧化反應(yīng)、氨基酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)必需的蛋白質(zhì)等過(guò)程的UPR靶基因來(lái)促進(jìn)細(xì)胞對(duì)ER應(yīng)激的適應(yīng)能力,導(dǎo)致細(xì)胞的死亡或生存。此外,CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP,也被稱為DDIT3)可被ATF4轉(zhuǎn)錄激活,在ER應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路調(diào)節(jié)NAFLD肝脂肪變性。Novoa等[13]發(fā)現(xiàn),DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(GADD34,eIF2α特異性磷酸酶)可與蛋白磷酸酶1催化亞基結(jié)合,導(dǎo)致eIF2α去磷酸化,使DDIT3和ATF4水平降低,抑制UPR。Li等發(fā)現(xiàn)HFD誘導(dǎo)NAFLD小鼠、油酸刺激的HepG2細(xì)胞或妥布霉素(ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑)處理的3T3-L1細(xì)胞,在分別給予Salubrinal(eIF2α去磷酸化的選擇性抑制劑)后,可以通過(guò)增加p-eIF2α和ATF4的表達(dá),降低CHOP水平,抑制ER應(yīng)激,同時(shí)增加LC3II/I(自噬標(biāo)志物)和抑制p62(自噬底物)表達(dá)來(lái)促進(jìn)自噬,最終起到緩解NAFLD肝脂肪變性的作用。然而在該研究中,ATF4水平升高的同時(shí),CHOP表達(dá)卻受到抑制[4],提示CHOP在NASH中作用的復(fù)雜性。與正常飲食野生型小鼠相比,Chop-/-小鼠在HFD飲食16周和MCD飲食3周的NASH模型中均出現(xiàn)更嚴(yán)重的肝損傷、炎癥和脂肪變性。并且HFD組Chop-/-小鼠導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡數(shù)量和巨噬細(xì)胞活化數(shù)量顯著增加[14]。由此推測(cè),在脂毒性期間,CHOP可能依賴于促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡來(lái)減輕NASH小鼠的肝損傷。

ATF6是具有胞質(zhì)bZIP(basic-leucine zipper)轉(zhuǎn)錄因子二聚化結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。在哺乳動(dòng)物中具有ATF6a和ATF6β兩種剪切體。在生理?xiàng)l件下,BiP與ATF6a結(jié)合并在ER駐留;當(dāng)ER應(yīng)激發(fā)生時(shí),ATF6a從ER釋放轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體,并被高爾基體兩種常駐加工酶(MBTP/S1P和MBTP/S2P)切割成具有轉(zhuǎn)錄活性片段的ATF6p50;ATF6p50再進(jìn)入胞核激活UPR靶基因(如ER伴侶和其它參與蛋白質(zhì)折疊的基因),增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)ER應(yīng)激的耐受能力和對(duì)未折疊蛋白的處理能力。ATF6p50還可與XBP1s結(jié)合形成異二聚體,促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解過(guò)程(ERAD)基因的上調(diào)。

ATF6α信號(hào)通路激活可能對(duì)NAFLD肝脂肪變性具有保護(hù)作用。ATF6p50可通過(guò)促進(jìn)CHOP對(duì)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPα)的負(fù)調(diào)控,來(lái)抑制脂質(zhì)生成相關(guān)基因的表達(dá),最終減少脂肪酸氧化和脂蛋白分泌。同時(shí),ATF6p50過(guò)表達(dá)可抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)的蛋白裂解[1]。有研究報(bào)道使用妥布霉素刺激小鼠(48 h)發(fā)生ER應(yīng)激,發(fā)現(xiàn)野生型小鼠肝損傷能夠自動(dòng)恢復(fù)正常,ATF6α基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯肝功能障礙和肝脂肪變性;并且顯著抑制編碼β-氧化(Cpt1a,Acadm)、過(guò)氧化物酶體(Acox1,Ppara)和微粒體氧化(Cyp4a10)關(guān)鍵步驟基因的表達(dá)[15]。ATF6α在NASH小鼠肝臟過(guò)表達(dá)可促進(jìn)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[16]。然而,ATF6在妥布霉素誘導(dǎo)急性或慢性ER應(yīng)激的NAFLD斑馬魚(yú)模型中作用有相反表現(xiàn)。當(dāng)斑馬魚(yú)發(fā)生慢性ER應(yīng)激時(shí),ATF6可促進(jìn)肝脂肪變性;相反,在急性ER應(yīng)激時(shí),ATF6可降低斑馬魚(yú)的脂肪變性[5]。因此,ATF6α在NAFLD肝脂肪變性的保護(hù)作用可能與ER應(yīng)激的時(shí)長(zhǎng)有關(guān)。

值得注意的是,除了每個(gè)UPR傳感器都在NAFLD起作用外,脂毒性誘導(dǎo)ER應(yīng)激反應(yīng),刺激其他下游分子的激活可加劇NAFLD脂質(zhì)累積。溶酶體膜蛋白SID1跨膜家族成員2(SIDT2)基因敲除的小鼠肝組織不僅發(fā)生脂肪變性、肝小葉和匯管區(qū)炎癥浸潤(rùn),還發(fā)生ER應(yīng)激和UPR激活,并伴有ER損傷。同時(shí)脂肪酸合成相關(guān)調(diào)控分子SREBP1蛋白和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)mRNA水平顯著升高[17]。Kim等在NASH患者和HFD飼喂MUP-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)NASH模型發(fā)現(xiàn),肝組織中ER應(yīng)激誘導(dǎo)半胱天冬酶2(Casp2)表達(dá)上調(diào),并與位點(diǎn)1蛋白酶(S1P)共定位,通過(guò)S1P的切割作用促進(jìn)SREBP1/2轉(zhuǎn)錄因子激活,導(dǎo)致肝細(xì)胞中甘油三酯和游離膽固醇的蓄積更顯著。相反,使用Casp2抑制劑(Ac-VDVAD-CHO)或基因敲除Casp2基因抑制NASH小鼠肝臟Casp2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)ER應(yīng)激誘導(dǎo)NASH的結(jié)局[18]。卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)缺乏不僅會(huì)影響脂蛋白組成和水平,而且會(huì)破壞細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)。與正常飲食小鼠相比,使用高脂高蔗糖(含36%脂肪不含膽固醇)依次誘導(dǎo)C57BL/6野生型、低密度脂蛋白(LDL)受體敲除(Ldlr-/-xLcat+/+,SKO)和LDL受體/LCAT雙重敲除(Ldlr-/-xLcat-/-,DKO)NASH小鼠模型發(fā)現(xiàn),野生型和SKO小鼠肝組織中不僅出現(xiàn)膽固醇生物合成基因,以及ER應(yīng)激標(biāo)志物CHOP和XBP1s的表達(dá)水平表達(dá)增加,還出現(xiàn)炎癥小體活化;但在DKO小鼠中均無(wú)這些變化。然而,高膽固醇(2%)喂養(yǎng)DKO小鼠可以誘導(dǎo)小鼠肝組織發(fā)生脂肪變性和炎癥小體活化[19]。這些結(jié)果提示NASH中,膽固醇的積累與ER應(yīng)激和炎癥小體激活相關(guān)。

另外,長(zhǎng)壽因子(Sirtuins)參與調(diào)控細(xì)胞壽命進(jìn)程、糖脂代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程。Shin等[20]發(fā)現(xiàn)在ER應(yīng)激發(fā)生時(shí),SIRT7特異性靶向核糖體蛋白的啟動(dòng)子,可直接抑制Myc轉(zhuǎn)錄因子活性,沉默UPR相關(guān)基因表達(dá),緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。與野生型小鼠相比,SIRT7基因敲除小鼠會(huì)加速NAFLD疾病進(jìn)程;相反,抑制ER應(yīng)激或MYC失活可減輕ER應(yīng)激并改善NAFLD小鼠肝脂肪變性[20]。這一發(fā)現(xiàn)表明,靶向SIRT7-MYC信號(hào)通路可能逆轉(zhuǎn)ER應(yīng)激,預(yù)防NAFLD疾病。

綜上所述,ER應(yīng)激和UPR在NAFLD/NASH疾病進(jìn)展中具有重要作用。ER應(yīng)激反應(yīng)并非總是朝著NASH病變方向進(jìn)行;輕度和中度ER應(yīng)激觸發(fā)“適應(yīng)性UPR”,可作為藥物靶點(diǎn)減輕NAFLD疾病病理表現(xiàn),恢復(fù)ER正常穩(wěn)態(tài);嚴(yán)重或持續(xù)的ER應(yīng)激可導(dǎo)致UPR激活超負(fù)荷,并通過(guò)炎癥、細(xì)胞死亡和EVs分泌等方式導(dǎo)致NASH肝損傷加重;但可能作為藥物靶點(diǎn)來(lái)消除NAFLD進(jìn)程中出現(xiàn)的癌變細(xì)胞。盡管目前已發(fā)現(xiàn)許多用于緩解輕度或中度ER應(yīng)激或誘導(dǎo)嚴(yán)重ER應(yīng)激的工具化合物[1],但是實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍存在一定距離。未來(lái)研究還需考慮如何基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向遞藥系統(tǒng),利用當(dāng)前的工具化合物開(kāi)發(fā)出符合NAFLD臨床安全給藥的藥物。此外,關(guān)于UPR感受器在NAFLD疾病進(jìn)程中的作用研究仍比較缺乏,尚不能完全解釋其錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)對(duì)NAFLD進(jìn)程的影響,還需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。