張 露,尹麗明,付文金 綜述,陳甘海 審校

東莞市厚街醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.重癥醫(yī)學(xué)科,廣東東莞 523000

顱腦損傷(TBI)是導(dǎo)致死亡和后天致殘的主要原因之一。由于TBI的醫(yī)療成本高,給患者及家庭乃至社會都帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。TBI是指外部機(jī)械力對腦實(shí)質(zhì)造成的損傷,包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷即在最初的沖擊之下立即引起組織變形、剪切應(yīng)力變化和周圍血管的損傷,隨后破壞血腦屏障同時伴隨神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致組織損傷、水腫、炎癥和神經(jīng)功能障礙等繼發(fā)性損傷[1]。

目前,普遍采用格拉斯哥昏迷指數(shù)(GCS)評估患者損傷嚴(yán)重程度,然而神經(jīng)癥狀可能會在整個TBI過程中持續(xù)存在,從而降低GCS的準(zhǔn)確率。影像學(xué)技術(shù)如計算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振(MRI)盡管應(yīng)用廣泛,但也存在明顯異質(zhì)性,即影像學(xué)結(jié)果相似,但患者預(yù)后差異較大。臨床指南中關(guān)于TBI診斷和預(yù)測預(yù)后可使用的生物標(biāo)志物有限。有研究表明,外泌體可在腦組織內(nèi)發(fā)出短程和遠(yuǎn)程信號,通過腦脊液循環(huán)將信號傳達(dá)至整個大腦,從而調(diào)控多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。深入研究外泌體在繼發(fā)性TBI中發(fā)揮的作用可以為TBI的診斷及治療提供新的途徑。

1 外泌體的產(chǎn)生與基本生物學(xué)特性

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)溶酶體內(nèi)陷形成多囊泡體,當(dāng)多囊泡體再次與質(zhì)膜融合,釋放到細(xì)胞外直徑在30～120 nm的脂質(zhì)囊泡。在研究綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞發(fā)育為成熟紅細(xì)胞的機(jī)制時外泌體首次被發(fā)現(xiàn),并于1987年被正式命名。起初,外泌體和血小板一樣,被認(rèn)為是細(xì)胞釋放的“垃圾”,隨著研究的深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞均可分泌外泌體,且外泌體廣泛存在于各種體液中。其特征性的蛋白包括跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Rab-GTPase)及熱休克蛋白(HSP60、HSP70)等。外泌體富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、信使RNA、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA等信號分子,通過直接融合、內(nèi)吞作用、特異性受體結(jié)合,將所包含的信息傳遞到靶細(xì)胞,從而調(diào)節(jié)多種生理和病理過程,在細(xì)胞通信中發(fā)揮著重要的作用。

2 TBI的繼發(fā)性損傷機(jī)制

2.1血腦屏障損傷導(dǎo)致腦水腫 有研究發(fā)現(xiàn),TBI急性期會出現(xiàn)廣泛的血腦屏障破壞,可持續(xù)存在數(shù)十年[3-4]。血腦屏障功能障礙導(dǎo)致其通透性增加,大分子物質(zhì)和血清蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)增加[5-6]。而清蛋白外滲導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)降解基底膜,進(jìn)一步提高了血腦屏障的通透性,從而引起腦水腫[7]。腦血管周圍積液累積可導(dǎo)致腦血流量變化和顱內(nèi)壓升高,若不及時控制該變化可導(dǎo)致不可逆的組織損傷和細(xì)胞死亡,這是導(dǎo)致重型TBI患者的高病死率的原因之一[8-9]。

2.2神經(jīng)炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變與神經(jīng)細(xì)胞死亡 早期炎癥反應(yīng)發(fā)揮著保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及修復(fù)受損細(xì)胞的作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中長期處于激活狀態(tài)時,一方面釋放炎癥因子誘導(dǎo)整合素聚集,招募淋巴細(xì)胞到損傷部位,與神經(jīng)元細(xì)胞、促炎癥細(xì)胞因子共同參與了炎癥反應(yīng)[10];另一方面介導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ的表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致神經(jīng)退行性變。此外,TBI發(fā)生后谷氨酸釋放增加,誘導(dǎo)神經(jīng)元去極化,引起Ca2+內(nèi)流,線粒體受損,導(dǎo)致毒性活性氧(ROS)生成增加。ROS消耗細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑,進(jìn)一步破壞細(xì)胞和細(xì)胞器,從而介導(dǎo)其他繼發(fā)性細(xì)胞死亡機(jī)制(凋亡或壞死)[11]。因此,炎癥反應(yīng)和ROS生成被認(rèn)為是TBI急性期后最重要的繼發(fā)性損傷過程。

3 外泌體可雙向調(diào)控繼發(fā)性TBI

外泌體在TBI后24 h釋放增加[12]。CHEN等[13]在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論,其還發(fā)現(xiàn),TBI后外泌體釋放增加依賴于縫隙連接蛋白43的磷酸化。

3.1外泌體促進(jìn)繼發(fā)性TBI 外泌體在調(diào)節(jié)血腦屏障完整性中發(fā)揮著重要作用。經(jīng)白細(xì)胞介素(IL)-1β刺激的巨噬細(xì)胞可分泌外泌體miR-21,激活了核因子(NF)-κB的信號通路及誘導(dǎo)MMP-1、MMP-3和MMP-9的釋放,降解了細(xì)胞緊密連接蛋白(TJPs),進(jìn)而破壞血腦屏障通透性及促進(jìn)神經(jīng)炎癥,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1可以抑制外周血中外泌體miR-21進(jìn)入大腦,促進(jìn)MMP蛋白水解,限制TJPs降解,從而保護(hù)血腦屏障完整性[14]。這提示巨噬細(xì)胞來源的外泌體通過破壞血腦屏障完整性加重了TBI反應(yīng),而人參皂苷Rg1可抑制外泌體miR-21釋放改善腦血管內(nèi)皮損傷從而減弱TBI反應(yīng)。

小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞來源的微囊泡在TBI后24 h內(nèi)釋放增加(P<0.05)[15]。將這些攜帶著miR-155、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1等促炎分子的微囊泡注射到未受傷的小鼠體內(nèi)后,未受傷的小鼠體內(nèi)也出現(xiàn)了創(chuàng)傷后神經(jīng)炎癥表現(xiàn)(P<0.05)[15],提示小膠質(zhì)細(xì)胞來源的微囊泡通過傳遞神經(jīng)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)繼發(fā)性TBI,而有效抑制微囊泡的產(chǎn)生則是治療TBI潛在的靶點(diǎn)。

3.2外泌體抑制繼發(fā)性TBI 星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可保護(hù)海馬神經(jīng)元。星形膠質(zhì)細(xì)胞是人腦中數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,其數(shù)量是神經(jīng)元的5倍,在調(diào)節(jié)血流量、維持血腦屏障穩(wěn)定、為神經(jīng)組織提供代謝支持及各種損傷后的腦修復(fù)中發(fā)揮著不可或缺的作用[16]。miR-873a-5p是活化后星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體的主要成分之一。LONG等[17]發(fā)現(xiàn),miR-873a-5p通過降低細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK和NF-κB p65的磷酸化顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型轉(zhuǎn)化和隨后的炎癥反應(yīng)(P<0.01)。另有研究發(fā)現(xiàn),TBI發(fā)生后星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體(AS-exosomes)通過抑制線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡發(fā)揮保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用[18]?？赡艿脑蚴茿S-exosomes通過激活TBI動物模型中的Nrf2/HO-1信號傳導(dǎo),增強(qiáng)了海馬神經(jīng)元中的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的活性,顯著降低了氧化應(yīng)激和線粒體H2O2水平,從而改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài),抑制神經(jīng)元萎縮與凋亡,有效地緩解了神經(jīng)行為缺陷、認(rèn)知障礙和腦水腫等癥狀。反之,敲除了TBI小鼠大腦中特異性Nrf2后,AS-exosomes的神經(jīng)保護(hù)作用也隨之消失。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體抑制炎癥反應(yīng)。有研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過提高IL-10的表達(dá)并降低NF-κB、IL-6、IL-1的水平,活化M2型小膠質(zhì)細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)[19]。CHEN等[20]為了確定人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(hADSC-exosomes)對TBI誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞持續(xù)激活及海馬神經(jīng)再生的影響,檢測TBI后炎癥因子水平、病變邊界區(qū)域的凋亡神經(jīng)元數(shù)量,以及腦冠狀切面處新生成的神經(jīng)元。與對照組比較,hADSC-exosomes組炎癥因子水平與神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均更低(P<0.01),病灶邊界區(qū)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞明顯減少(P<0.01),而海馬齒狀回新生神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P<0.05)。這表明hADSC-exosomes能抑制TBI后急性炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制慢性小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化,減少神經(jīng)元凋亡。

總之,不同來源的外泌體通過多種不同的途徑來調(diào)控血腦屏障的完整性、抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)等,從而緩解TBI的繼發(fā)性損傷。因此,星形膠質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可作為評估TBI嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物標(biāo)志物。

4 外泌體在TBI診斷與治療中的研究進(jìn)展

4.1TBI診斷的方法學(xué)比較 目前,對TBI的診斷主要通過詢問病史、神經(jīng)系統(tǒng)檢查和影像學(xué)方法。CT作為診斷TBI的首選方法,可以準(zhǔn)確診斷顱內(nèi)病變且靈敏度高,在評估患者預(yù)后方面也有較好的效能[21]。但其檢測存在不足,比如出現(xiàn)彌漫性腦損傷時,則需要MRI進(jìn)一步診斷。且由于動態(tài)增強(qiáng)CT使用碘造影劑,可能會導(dǎo)致不良反應(yīng)[22]。MRI是一種敏感、無創(chuàng)的方法,通過評價高強(qiáng)度急性再灌注標(biāo)志物判斷血腦屏障的功能完整性,但是MRI價格昂貴、耗時、需要造影劑、存在部分禁忌證。

檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展逐步彌補(bǔ)了現(xiàn)有TBI診斷技術(shù)的不足。大量研究證實(shí),外泌體在TBI的診斷[23]及治療(基因和藥物輸送)[24-25]中具有優(yōu)勢。一方面外泌體是一種靈敏度高和特異度均較高的生物標(biāo)志物,循環(huán)半衰期長,易于在體液中檢測(外泌體在TBI后24 h釋放增加),具有取樣無創(chuàng)、含量豐富、可動態(tài)監(jiān)測疾病等特點(diǎn);另一方面外泌體具有直徑小,免疫原性低,可避免被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬,其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)使其可透過血腦屏障的特點(diǎn)[26],可作為藥物載體進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

4.2外泌體在TBI輔助診斷中的研究 有研究表明,外泌體可作為診斷TBI的標(biāo)志物,在TBI后的急性期,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會釋放外泌體介導(dǎo)神經(jīng)元死亡,阻礙神經(jīng)突生長和突觸恢復(fù)[27]。ZYA等[28]發(fā)現(xiàn),TBI后神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-21-5p水平升高。接著通過共培養(yǎng)PC12細(xì)胞和BV2細(xì)胞模擬神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中的相互作用,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PC12來源的外泌體miR-21-5p被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬并誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞極化。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞極化促進(jìn)神經(jīng)炎癥因子的釋放,抑制神經(jīng)突生長,使磷酸化的微管蛋白P-tau積累。而該蛋白反過來促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡,提示外泌體miR-21-5p通過調(diào)控炎癥反應(yīng)促進(jìn)了TBI發(fā)展,可作為生物標(biāo)志物輔助評估TBI的嚴(yán)重程度。

4.3外泌體在TBI治療中的研究 外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有潛在的應(yīng)用價值。SHARMA等[29]將健康的DIV9嚙齒動物的原代神經(jīng)培養(yǎng)物中獲得的外泌體注射到P4小鼠的側(cè)腦室中,觀察到小鼠神經(jīng)元,特別是齒狀回區(qū)域(該區(qū)域與小鼠的學(xué)習(xí)和記憶有關(guān))增殖增加。此外,該研究還顯示,外泌體能夠逆轉(zhuǎn)X連鎖甲基-CpG結(jié)合蛋白2突變體神經(jīng)元中觀察到的一些病理表型。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體可轉(zhuǎn)運(yùn)miR-124至神經(jīng)元細(xì)胞,靶向負(fù)調(diào)控去泛素化酶14從而減輕缺血性腦損傷并減少神經(jīng)元凋亡。提示M2型小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可能是治療缺血性腦卒中的潛在治療靶點(diǎn)[30]。另有研究發(fā)現(xiàn),早期單劑量間充質(zhì)干細(xì)胞MSC-exosomes給藥可改善血腦屏障完整性[31]。其可能的原因是MSC-exosomes給藥組動物腦腫脹明顯減輕,病灶體積更小,顱內(nèi)壓降低和腦灌注壓增加。此外,MSC-exosomes給藥組動物清蛋白外滲減少,血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白水平顯著降低(P<0.05),而層黏連蛋白、緊密連接蛋白5、胞質(zhì)緊密黏連蛋白水平顯著升高(P<0.05)[31]?？傊?這些研究結(jié)果證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等來源的外泌體對神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用,是TBI潛在的治療靶點(diǎn),也是監(jiān)測療效的標(biāo)志物。

5 小 結(jié)

盡管對TBI的病理生理學(xué)認(rèn)識進(jìn)展迅速,但由于中、重度創(chuàng)傷性TBI患者仍存在長期的神經(jīng)功能缺損,對TBI的診斷主要依賴于自我認(rèn)知報告、主觀癥狀和影像學(xué)檢查,這些方法均有各自的局限性。外泌體作為一種新型生物標(biāo)志物廣泛存在于各種體液中,如尿液、血液、血清、母乳、羊水、腦脊液等,其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)使其具有透過生物屏障的能力,且參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展過程。

雖然已有大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[28]和動物實(shí)驗(yàn)[27,29-31]證實(shí)外泌體可作為評估TBI嚴(yán)重程度的標(biāo)志物及治療靶點(diǎn),但缺乏相關(guān)的臨床研究,基礎(chǔ)研究向臨床研究的轉(zhuǎn)化還面臨諸多挑戰(zhàn)。首先,目前對外泌體的具體合成機(jī)制、功能了解并不是十分清楚;其次,幾乎所有細(xì)胞均能分泌外泌體,且外泌體的釋放還受到各種刺激甚至是生活習(xí)慣的影響。那么如何提高外泌體診斷疾病的靈敏度和特異度是必須要解決的問題;再次,現(xiàn)在缺乏經(jīng)濟(jì)、有效的外泌體分離技術(shù),外泌體的提取沒有建立統(tǒng)一的規(guī)范化操作且外泌體的提取成本較高,因此,不適合在臨床大規(guī)模使用;最后,要實(shí)現(xiàn)外泌體的臨床治療,還需突破外泌體的藥物遞送系統(tǒng)的技術(shù)以及大量臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)支持。