不同土壤環(huán)境冬蓀覆土層微生物多樣性

王萬坤,康 超,曾維軍,鄭 旋,楊 玲,劉忠玄,王 芳,王 晶

(貴州省生物研究所,貴陽 550009)

【研究意義】冬蓀別名竹下菌、竹菌和無裙蓀等,屬鬼筆目(Phallales)鬼筆科(Phallaceae)鬼筆屬(Phallus)真菌,是一種珍稀食藥用菌,其子實體具有活血止痛、祛風除濕及抗癌等功效[1-2]。冬蓀是可食用鬼筆屬真菌統稱,常包括白鬼筆(P.inpudicus)、冬蓀(P.dongsun)、香筆菌(P.fragrans)、重脈鬼筆(P.costatus)等[3]。冬蓀作為貴州地理標志產品,是貴州特色食用菌的重要支柱,栽培面積最多為白鬼筆和冬蓀。作為典型覆土食用菌,其生長受土壤類型、土壤環(huán)境、栽培模式等影響,探究不同土壤環(huán)境及栽培周期內覆土層土壤微生物群落特征,對實現其保產增產、提質增效具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】土壤微生物作為生態(tài)系統的重要組成,直接或間接地參與土壤物質循環(huán)、能量轉換等過程[4]。土壤微生物的代謝功能受土壤微生物種群、土壤動植物以及周圍土壤環(huán)境影響[5],對土壤理化性質、酶活、維護生態(tài)平衡發(fā)揮了巨大作用[4]。覆土食用菌的生長受土壤微生物、理化性質、酶活等影響,土壤微生物對食用菌原基的形成具有重要作用[6]。熊川等[7]研究認為,羊肚菌菌塘土壤細菌群落結構的豐富性有利于羊肚菌生長,羊肚菌生長需土壤中相關微生物或某些特殊物質的刺激。王琳等[8]研究表明,在覆土層中添加惡臭假單胞菌,可促進雙孢蘑菇菌絲的生長和扭結,產量提高24.9%。土壤微生物種類、數量與覆土食用菌之間必須保持動態(tài)平衡,才有利于雙方的生長。吳紅萍等[9]認為,熟料作為竹蓀栽培料,可相對減少覆土層土壤微生物多樣性和土壤微生物對營養(yǎng)、水分和空間的競爭,為菌絲生長、繁殖提供更多的營養(yǎng)和適宜的土壤微環(huán)境。蘇德偉等[10]研究表明,覆土食用菌生長能改變覆土層土壤微生物群落多樣性,竹蓀栽培不同時期土壤中的細菌、真菌、放線菌的數量依次增加,其中細菌占比達99.75%,同時也改變了土壤pH、氮、磷、鉀等含量及土壤酶活性和肥力等。詹穎馨等[11]對卵孢長根菇覆土層微生物群落結構進行研究表明,覆土層真菌物種數量在采收期達最大值,細菌物種數量則隨著卵孢長根菇的生長不斷下降,而病害的發(fā)生則造成土壤微生物種類和豐度降低,土壤營養(yǎng)元素消耗,pH降低。連作障礙普遍存在于各類作物中,也是導致土壤微生物多樣性變化的原因之一,呂楊蘭[12]研究表明,竹蓀連作導致土壤微生物數量、脲酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、蛋白酶等發(fā)生變化,從而影響竹蓀正常生長和產品質量?！颈狙芯壳腥朦c】土壤微生物、理化性質對覆土食用菌的生長及子實體形成有明顯作用,但未見貴州冬蓀覆土微生物多樣性的相關研究?！緮M解決的關鍵問題】采集貴州冬蓀主要種植地區(qū)不同土壤環(huán)境和不同生長期土壤樣品,采用高通量測序技術,分析不同土壤環(huán)境冬蓀覆土層土壤微生物群落組成、多樣性等結構特征和土壤理化性質變化,研究覆土層微生態(tài)各因素間相互關系,探究冬蓀整個生長期微生物變化規(guī)律,為冬蓀高效栽培提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 冬蓀(P.dongsun)為貴州當地品種,由貴州省生物研究所提供。

1.1.2 試劑 FastDNA?Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒(MP Biomedicals,美國),agArose瓊脂糖(biowest,西班牙),FastPfu Polymerase(TransGen,中國),AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen,美國),NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒(Bioo Scientific,美國),MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒(Illumina,美國),土壤基本營養(yǎng)指標檢測的相關試劑(分析純)均購置于成都金山化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 Eppendorf 5424R型高速冷凍離心機(Eppendorf,德國),NanoDrop2000型超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific,美國),BioTek?ELx800型酶標儀(Biotek,美國),TL-48R型粉碎研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司,中國),FastPrep-24 5G型MP研磨儀(MP,美國),iCETM3500 AAS 原子吸收光譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國),Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀(FOSS,丹麥)QuantusTMFluorometer型微型熒光計(Promega,美國),ABI GeneAmp?9700型PCR儀(ABI,美國),Miseq測序儀(Illumina,美國)。

1.2 試驗地概況

試驗在貴州省大方縣進行,試驗地及土壤類型分別為林下壤土、耕地壤土和耕地沙質土。林下壤土試驗地海拔1766 m,種植前土壤堿解氮含量123.89 mg/kg,有效磷含量4.3 mg/kg,速效鉀含量61 mg/kg,有機質含量122.23 g/kg,pH 4.78;耕地壤土試驗地海拔1259 m,種植前土壤堿解氮含量76.35 mg/kg,有效磷含量31.46 mg/kg,速效鉀含量217 mg/kg,有機質含量107.54 g/kg,pH 7.27;耕地沙質土試驗地為冬蓀連作第2年土壤,海拔1254 m,種植前土壤堿解氮60.50 mg/kg,有效磷97 mg/kg,速效鉀148 mg/kg,有機質103.51 g/kg,pH 8.28。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤樣品采集 2021年3月,參考肖艷等[13]的方法將冬蓀種植于林下壤土、耕地壤土和耕地沙質土中,試驗地面積均為0.67 hm2。土壤樣品采集于2021年4月(即冬蓀栽培前期,E)、6月(菌絲生長期,M)、9月(菌蕾生長期,B)、11月(子實體生長期,F)和12月(子實體衰敗期,D),每個樣點隨機設置20 m×20 m樣方,5點取樣法取樣,去除表層土(5 cm左右),鉆取冬蓀菌絲覆土層土壤(5 cm土層)并混合,將土樣過2 mm篩網去雜質,分別保存于4和-80 ℃冰箱中,用于土壤理化性質和土壤DNA測定分析。

1.3.2 土壤基礎營養(yǎng)指標測定 土壤全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、有機質、pH分別按NY/T 53—1987、GB/T 9837—1988、NY/T 87—1988、NY/T 1121.7—2014、NY/T 1849—2010、NY/T1121.6—2006、NY/T 1241—1999中的相應方法進行測定;土壤堿解氮按《土壤學實驗》中的堿解擴散法進行測定[14]。

1.3.3 DNA提取和PCR擴增 根據FastDNA?Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒(MP Biomedicals,美國)說明書逐步進行土樣微生物群落總DNA抽提,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量,使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度。以提取的總DNA為模板,用細菌通用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT) 對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增,用真菌通用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)對ITS1基因進行擴增。擴增程序:95 ℃預變性3 min,35個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后10 ℃進行保存(PCR儀:ABIGeneAmp?9700型)。338F-806R引物PCR反應體系為:5×FastPfu Buffer緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,FastPfu Polymerase DNA聚合酶0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,ddH2O補足至20 μL。ITS1F-ITS2R引物PCR反應體系為:10×Buffer緩沖液2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,rTaq聚合酶0.2 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,ddH2O補足至20 μL。

1.3.4 Illumina Miseq測序 將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,美國)純化回收產物,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer(Promega,美國)對回收產物進行檢測定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific,美國)建庫:①接頭鏈接;②使用磁珠篩選去除接頭自連片段;③利用PCR擴增進行文庫模板的富集;④磁珠回收PCR產物得到最終的文庫,將DNA樣品委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

1.4 數據處理

數據采用SPSS Version 22進行統計分析。使用Uparse 7.0.1090進行OTU分析和Pan分析,聚類方式采用USEARCH7-uparse算法,OTU序列相似度為0.97,物種分類數據庫為unite 8.0/its_fungi,分類置信度為0.7。使用mothur v.1.30.2計算Shannon指數,并對組間Shannon指數差異進行t檢驗。使用R語言3.3.1制作物種Venn圖、群落柱形圖、相關性Heatmap圖,使OriginPro 2021軟件繪制折線圖和柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境的理化性質

從圖1看出,全氮、堿解氮含量耕地壤土和沙質土呈先升后降趨勢,林地壤土則呈先升后降再升的趨勢,3種土壤環(huán)境中的全氮、堿解氮含量最高值均處于菌絲生長期(M)和菌蕾生長期(B),并以林地壤土含量最高;不同土壤環(huán)境的全鉀含量在整個生長周期變化不明顯,速效鉀與全鉀含量變化趨勢無一致性,耕地壤土、林地壤土均呈先升后降趨勢,耕地沙質土則呈先升后降再升趨勢,整個過程中林地壤土全鉀及速效鉀含量最低;不同土壤環(huán)境全磷含量均呈先升后降趨勢,整個栽培周期內耕地沙質土全磷和有效磷最高,林地壤土最低;土壤有機質含量耕地壤土和沙質土均呈先升后降趨勢,林地壤土則呈先升后降再升趨勢,林地壤土和耕地壤土變化明顯,以菌絲生長期(M)和菌蕾生長期(B)最高;土壤pH耕地壤土呈下降趨勢,耕地沙質土呈先降后升再微降趨勢,林地壤土呈先降后升再降趨勢,其中,林地壤土pH偏酸性,耕地壤土中性偏酸,耕地沙質土中性偏堿性。表明,在冬蓀菌絲生長期和菌蕾生長期,土壤中全氮、全磷、堿解氮,速效鉀、有效磷、有機質均明顯增加并達最大值,全鉀則降低,pH在整個栽培周期均呈下降趨勢。

圖1 不同土壤環(huán)境及冬蓀菌絲生長期內土壤的理化性質Fig.1 Soil physiochemical properties under different soil environment and during mycelial growth state of P.dongsun

2.2 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境中細菌和真菌物種的多樣性

對土樣中細菌和真菌進行DNA抽取,高通量分析后獲得9367個細菌物種OTU,屬于43個門1024個屬,總序列數831 316條,各樣本序列數范圍為55 229～78 458條,序列平均長度為415 bp;獲得5851個真菌物種OTU,屬于16個門891個屬,總序列數2012 901條,各樣本序列數范圍為53 244～124 196條,序列平均長度為231 bp。由圖2可知,耕地壤土、耕地沙質土的土壤細菌Shannon指數顯著高于林地壤土(P<0.05),耕地壤土與耕地沙質土之間土壤細菌Shannon指數差異不顯著,表明冬蓀栽培地內耕地壤土和耕地沙質土細菌多樣性高于林地壤土;3種土壤間的土壤真菌Shannon指數差異不顯著,表明不同土壤環(huán)境土壤真菌多樣性在栽培期內無明顯差異。綜合比較,同一土壤環(huán)境中細菌多樣性高于真菌多樣性。

圖2 屬分類水平下不同土壤環(huán)境細菌和真菌的Shannon指數Fig.2 Shannon index of soil bacterial community and fungal community under different soil environments at genus level

2.3 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境中細菌和真菌物種的組成

2.3.1 門水平下物種的相對豐度 由圖3可知,在細菌門水平下,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)和綠彎菌門(Chloroflexi)為冬蓀栽培地覆土層的優(yōu)勢門類,其相對豐度總和在林地壤土、耕地壤土、耕地沙質土中分別達83.80%、84.44%、80.13%。在真菌門水平下,子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)為冬蓀栽培地覆土層土壤優(yōu)勢門類,其相對豐度總和在林地壤土、耕地壤土、耕地沙質土中分別達85.49%、91.79%和94.96%。

圖3 門水平下不同土壤環(huán)境中細菌和真菌物種群落的相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial phyla and fungal phyla under different soil environment at phylum level

2.3.2 屬水平下物種的相對豐度 從圖4看出,細菌屬水平下相對豐度>1%的共有40個屬,林地壤土樣地中熱酸菌屬(Acidothermus)和norank_f_norank_o_Subgroup_2相對豐度較高,分別占該組物種總數7.60%和7.32%;耕地壤土和耕地沙質土樣地中,norank_f_norank_o_Vicinamibacterales和norank_f_Vicinamibacteraceae屬豐度占比較高,分別占該組物種總數5.22%、3.87%和3.37%、3.62%。表明,冬蓀栽培地覆土層林地土壤和耕作土壤(包括壤土和沙質土)細菌高豐度物種存在明顯差異。真菌屬水平下相對豐度>1%的共有38個屬,其中林地壤土樣地相對豐度居前5的分別為被孢霉屬(Mortierella)、unclassified_c_Archaeorhizomycetes、沙蜥屬(Saitozyma)、unclassified_k_Fungi和Archaeorhizomyces,分別占該組物種總數的10.42%、25.41%、11.36%、9.37%和9.97%;在耕地壤土分組中相對豐度居前3的物種分別是被孢霉屬(Mortierella)、沙蜥屬(Saitozyma)和鬼筆屬(Phallus),分別占該組物種總數14.24%、7.18%和7.37%;在耕地沙質土分組相對豐度居前3的物種分別是被孢霉屬(Mortierella)、籃狀菌屬(Talaromyces)和鬼筆屬(Phallus),分別占該組物種總數13.61%、5.23%和5.58%。

圖4 屬水平下不同土壤環(huán)境中細菌和真菌物種的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial and fungal species under different soil environment at genus level

2.3.3 真菌和細菌的非度量多維尺度(NMDS)分析 從圖5可知,各個土壤環(huán)境中真菌和細菌樣本基本匯聚在一起,表明不同土壤環(huán)境之間物種組成差異較大,而同一樣地不同時期采集土樣也未集中,彼此之間距離較大,表明不同時期內樣本細菌物種差異較大。細菌分組樣品之間彼此無交集,表明彼此之間無相似物種,NMDS分析的脅強系數stress<0.05,說明NMDS分析對細菌分組土樣具有很好代表性。真菌分組樣品之間同一樣地不同時期采集土樣僅林地壤土樣地相對集中,耕地壤土和耕地沙質土組內物種差異較大,且耕地壤土與耕地沙質土部分交叉,表明兩組間樣地真菌物種存在相似性;NMDS分析的脅強系數stress<0.1,說明NMDS分析對真菌分組土樣具有較好代表性。

圖5 不同土壤環(huán)境中細菌和真菌屬分類水平的非度量多維尺度分析Fig.5 NMDS analysis of bacterial genus and fungal genus under different soil environment

2.3.4 主要真菌和細菌物種的差異性 細菌。對林地壤土、耕地壤土、耕地沙質土土壤細菌優(yōu)勢屬進行組間差異分析,前10個屬的物種豐度在不同分組處理之間呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異(Kruskal-Wallis秩和檢驗)(圖6-a)。在前10個屬中,除熱酸菌屬(Acidothermus)和慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)外,其他種類暫無明確分類地位,因此考察這2個屬在3個分組之間的差異性。從圖6-b看出,林地壤土中熱酸菌屬(Acidothermus)豐度明顯高于耕地壤土和耕地沙質土(P<0.01),耕地壤土與耕地沙質土之間差異不明顯;從圖6-c看出,林地壤土中慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)豐度明顯高于耕地沙質土(P<0.01)和耕地壤土(P<0.05),耕地壤土與耕地沙質土之間物種差異極顯著(P<0.01)。

*和**分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01),下同。* and * * indicate significant difference and extremely significant difference at P< 0.05 and P< 0.01 level, respectively.The same as below.圖6 不同土壤環(huán)境中細菌屬主要物種的差異顯著性Fig.6 Significant difference of main species of soil bacterial under different soil environment

真菌。從圖7-a看出,林地壤土、耕地壤土、耕地沙質土真菌優(yōu)勢屬前10個屬物種豐度在不同分組處理之間有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。前10個屬物種中,除沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、鐮刀菌屬(Fusarium)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、Gibellulopsis、和赤霉菌屬(Gibberella)外,其他種類暫無明確分類地位,研究主要考察冬蓀栽培與覆土層微生物多樣性之間的關系,因此主要分析沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、鐮刀菌屬(Fusarium)及鬼筆屬(Phallus)在3個分組之間的物種豐度差異。從圖7-b看出,林地壤土與耕地沙質土間沙蜥屬(Saitozyma)豐度差異顯著(P<0.05),耕地壤土與耕地沙質土之間差異不顯著;從圖7-c看出,林地壤土中Archaeorhizomyces豐度明顯高于耕地壤土、耕地沙質土(P<0.01),耕地壤土與耕地沙質土之間差異不明顯;從圖7-d看出,耕地沙質土中鐮刀菌屬(Fusarium)豐度顯著高于林地壤土,耕地壤土(P<0.05)、林地壤土與耕地壤土差異不明顯,耕地壤土與耕地沙質土之間鐮刀菌屬(Fusarium)豐度差異顯著,從圖7-e看出,3個土壤環(huán)境覆土層鬼筆屬(Phallus)豐度差異不明顯。

圖7 不同組處理土壤真菌屬主要物種差異顯著性Fig.7 Significant difference of main species of soil fungal under different treatments

2.4 不同生長期內微生物物種的多樣性變化

2.4.1 土壤微生物物種Shannon指數 由圖8可知,冬蓀栽培地中,不同土壤環(huán)境中細菌Shannon指數高于真菌Shannon指數,表明土壤中細菌多樣性高于真菌多樣性。從不同生長期看,不同土壤環(huán)境中真菌Shannon指數均呈先降后升的趨勢,但各自變化趨勢有差異;細菌Shannon指數耕地壤土和耕地沙質土呈先升后降趨勢,林地壤土呈先降后升的趨勢。表明,冬蓀菌絲不同生長期內林地壤土微生物多樣性變化明顯,微生物多樣性低于耕地壤土和耕地沙質土。

圖8 不同冬蓀生長期土壤細菌和真菌物種Shannon指數Fig.8 The Shannon index of soil bacterial species and fungal species in different growth periods of P.dongsun

2.4.2 土壤微生物共有物種的豐度差異 從圖9看出,冬蓀栽培不同生長期內土壤環(huán)境中細菌和真菌共有物種前10屬豐度有明顯差異。林地壤土細菌菌絲生長期(M)熱酸菌屬(Acidothermus)物種豐度最高,占組內10.07%;耕地壤土細菌norank_f_norank_o_Vicinamibacterales物種豐度占比相對較高,以栽培前期(E)物種豐度最高;耕地沙質土細菌子實體衰敗期(D)norank_f_norank_o_Vicinamibacterales物種豐度最高,占組內的9.3%。林地壤土真菌菌蕾生長期(B)以unclassified_c_Archaeorhizomycetes物種豐度最高,占組內的48.05%,其次是菌絲生長期(M),物種豐度達25.4%;鬼筆屬(Phallus)隨著栽培時間的增加,物種濃度逐漸增加,子實體采收期(F)物種豐度占組內2.78%;耕地壤土真菌子實體生長期(F)鬼筆屬(Phallus)物種豐度最高,占組內的28.54%,其次是子實體衰敗期(D),物種豐度達18.4%,從整個生長周期看,鬼筆屬(Phallus)物種豐度呈先升后降趨勢;耕地沙質土真菌子實體生長期(F)籃狀菌屬(Talaromyces)物種豐度最大,達30.85%,被孢霉屬(Mortierella)物種豐度在整個生長周期中占比相對較高,分別為24.82%(E)、17.14%(M)、9.85%(B)、2.36%(F)、13.76%(D);從整個生長周期看,鬼筆屬(Phallus)物種豐度呈先升后降趨勢,菌蕾生長期(B)物種豐度最大,占11.18%。

圖9 不同冬蓀生長期土壤微生物共有物種屬水平下的特種豐度Fig.9 The abundance of soil microbes from shared species of P.dongsun at genus level

2.5 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境微生物群落和物種與土壤營養(yǎng)的相關性

2.5.1 土壤微生物群落與土壤營養(yǎng)的相關性 考察土壤理化性質與土壤中微生物群落結構關系,為確定共線性較小的環(huán)境因子,分別對細菌物種和真菌物種進行VIF方差膨脹因子分析,基于篩選出的主要土壤營養(yǎng)因子進行RDA/CCA分析。RDA分析(圖10-a)表明,pH、TP、TK與耕地沙質土細菌群落組成呈正相關,AK、TK與耕地壤土細菌群落組成呈正相關,OM與林地壤土細菌群落多樣性呈正相關;TP、TK、AK、AP、pH間呈正相關,與OM之間呈負相關,pH對耕地沙質土細菌群落組成影響最大。CCA分析結果(圖10-b)表明,TK與耕地壤土真菌群落組成呈正相關,AP、TP、AK與耕地沙質土真菌群落組成呈正相關,OM與林地壤土真菌群落組成呈正相關;AP、TP、AK、TK間呈正相關,與OM之間呈負相關,TK對耕地壤土真菌群落組成影響最大;環(huán)境因子對土壤中鬼筆屬物種豐度的影響以土壤全鉀最大,且呈正相關。

2.5.2 土壤微生物物種與土壤營養(yǎng)的相關性 由圖11-a可知,不同土壤環(huán)境中的理化性質指標均與相對基因豐度排名前10的細菌屬有相關性,其中有機質與黃桿菌科(Xanthobacteraceae)中無分類屬呈正相關(P<0.05),相關系數為57.86%;與芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae中無分類的屬呈負相關(P<0.05);pH、TP、AP與慢生根瘤菌屬(Rhizobium)、黃桿菌科(Xanthobacteraceae)、熱酸菌屬(Acidothermus)及IMCC2625目、AD3綱、Subgroup_2目、Elsterales目中無分類的屬呈負相關(P<0.01),相關系數65.36～98.21%;pH、TP、AP、TK、AK與Vicinamibacteraceae中無分類屬呈正相關(P<0.05)。從圖11-b可知,OM與子囊菌門中不能注釋屬呈正相關(P<0.05),相關系數54.64%;TP、AP與沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces及古根菌綱、真菌界中不能注釋屬呈正相關(P<0.01),相關系數69.90%～91.10%;5個土壤理化因子與鬼筆屬物種豐度有一定正相關向,但不顯著,表明理化因子對鬼筆屬(Phallus)影響不明顯。

圖11 不同土壤環(huán)境微生物物種與土壤營養(yǎng)的相關性HeatmapFig.11 Heatmap of the correlation between soil microbes and soil nutrients under different soil environment

3 討 論

土壤微生物多樣性與一系列生態(tài)系統功能(如養(yǎng)分循環(huán)、分解和植物生產力)變化呈正相關,是土壤微生物種群、土壤動植物以及周圍土壤環(huán)境生態(tài)相互作用的結果[5],土壤中微生物多樣性的變化影響土壤環(huán)境中其他微生物群落結構、自身理化性質及相關酶活性變化[4]。本研究中,在冬蓀菌絲生長期和菌蕾生長期,土壤中堿解氮、速效磷、有機質含量明顯增加,速效養(yǎng)分含量提升,肥力提高,與白瑩等[15-16]研究結果一致;全氮、全磷、有效磷亦明顯增加,pH在整個栽培周期均呈下降趨勢,這與蘇德偉等[10]的研究一致,但本研究發(fā)現,不同土壤環(huán)境pH不同,林地壤土偏酸性,耕地壤土中性偏酸,耕地沙質土中性偏堿性,其差異應該來源土壤環(huán)境的不同。相關性分析發(fā)現,有機質與林地壤土微生物呈正相關,但與鬼筆屬物種變化呈負相關,全磷、全鉀、速效鉀則與鬼筆屬(Phallus)物種豐度呈正相關,但不顯著,表明全磷、全鉀、速效鉀對鬼筆屬(Phallus)(冬蓀)菌絲的生長有一定促進作用。

外源微生物對土壤本底微生物多樣性有明顯影響,可改變其群落結構及其生長軌跡,且與外源微生物的種類和數量呈正相關[17]。在冬蓀栽培樣地內,耕地(壤土和沙質土)細菌Shannon指數顯著高于林地壤土,真菌Shannon指數差異不顯著,但從趨勢上看,林地壤土真菌Shannon指數依然最低,表明冬蓀栽培林地壤土微生物多樣性低于耕地。從冬蓀栽培周期看,在菌絲生長期至子實體生長期,耕地土壤(壤土和沙質土)中細菌Shannon指數明顯增加,真菌Shannon指數明顯降低,與前人研究結果相似。如添加枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、伯克氏菌、氧化節(jié)桿菌、耳葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌等處理后,土壤細菌多樣性明顯提高[10, 15, 18-20],而真菌多樣性降低[21]。詹穎馨等[11]則發(fā)現,細菌物種數量隨著長根菇的生長不斷下降,推測為栽培或添加物種種類不同,導致土壤微生物多樣性變化。本研究發(fā)現,林地壤土中細菌和真菌多樣性呈先降后升的趨勢,與耕地土壤環(huán)境變化趨勢不一致,有待進一步驗證。

對不同土壤環(huán)境冬蓀覆土層微生物主要細菌物種進行分析,林地壤土細菌主要物種為熱酸菌屬(Acidothermus),耕地壤土為Vicinamibacterales目,耕地沙質土為Vicinamibacteraceae科,屬水平下真菌主要有沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、鐮刀菌屬(Fusarium)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、Gibellulopsis和赤霉菌屬(Gibberella)。針對具有明確分類地位細菌和真菌物種豐度進行差異性分析,林地壤土覆土層中熱酸菌屬(Acidothermus)、沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces豐度高,差異顯著,耕地沙質土中鐮刀菌屬豐度高,差異顯著,3種土壤環(huán)境覆土層鬼筆屬豐度差異不明顯。熱酸菌屬(Acidothermus)、Archaeorhizomyces以及慢生根瘤菌(Bradyhizobium)均與土壤有機質含量呈正相關。熱酸菌屬(Acidothermus)是分解有機質、利用碳源的細菌,占細菌總量的20%左右[22],Archaeorhizomyces是常見陸生好氣真菌[23],在土壤真菌群落中占比約30%[24],其隨水分和孔隙度變化常表現出較高的敏感度[25],慢生根瘤菌(Bradyhizobium)則具有固氮作用[26]。本研究發(fā)現,耕地沙質土中鐮刀菌屬(Fusarium)物種豐度顯著增加,而鐮刀菌被認為是一類重要植物病原菌類群,具有隨著栽植代數增加而顯著增加的趨勢[27-28],本研究結果與之一致。

4 結 論

冬蓀覆土層內變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)為優(yōu)勢細菌門,子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)為優(yōu)勢真菌門,且栽培期內細菌多樣性增加,真菌多樣性減少。在林地壤土、耕地壤土和耕地沙質土3種不同環(huán)境中,林地壤土細菌多樣性低于耕地壤土和耕地沙質土,真菌多樣性不顯著;屬水平下,熱酸菌屬、Archaeorhizomyces、慢生根瘤菌是林地壤土優(yōu)勢屬,鐮刀菌屬是耕地壤土連作優(yōu)勢屬,均與土壤有機質含量呈正相關。相關分析表明,全磷、全鉀、速效鉀與鬼筆屬(冬蓀)物種豐度呈正相關,但不顯著,全磷、全鉀、速效鉀對鬼筆屬(冬蓀)菌絲生長有促進作用。