基于高通量測序分析土層與間伐強度對遼東山區(qū)紅松人工林真菌群落的影響

劉 晴,徐 陽,張 妍,李虹諭,潘丕克

(1.遼寧省森林經(jīng)營研究所,遼寧 丹東 118002;2.遼寧遼東半島森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站,遼寧 丹東 118002)

【研究意義】我國人工林位居世界首位,其中紅松(Pinuskoraiensis)是我國東北部東部林區(qū)主要的人工造林樹種之一,具有較高的經(jīng)濟和生態(tài)價值。遼寧省森林經(jīng)營研究所實驗林場擁有自1949年營造的新中國第一處紅松人工林,迄今林齡達73年,具有代表性的紅松人工林[1]。間伐是人工林的主要撫育措施和提高生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的重要手段[2],對人工林的結構影響較大。而相對于天然林,人工林結構單一,抵抗力穩(wěn)定性差,因此分析人工林撫育間伐措施效益,對人工林森林培育有著重要意義。土壤是森林的重要組成成分,土壤微生物以其作為活動場所完成全部或部分生活史。其中,土壤真菌可以作為評價土壤生態(tài)狀況的重要生物指標,植物物種及其根系分泌物均可影響真菌群落結構[3-5]。部分土壤真菌在維持植物生長方面發(fā)揮作用,同時也可提高植物的抗逆性[6-8]。了解土壤真菌群落結構對評價人工林生態(tài)系統(tǒng)功能、探尋植物繁育機制、防治病害和維護生態(tài)系統(tǒng)多樣性及穩(wěn)定性等尤為重要[9]。在土壤微生物多樣性研究中,傳統(tǒng)分離鑒定土壤微生物的方法只能區(qū)分微生物種類中的0.1%～10.0%[10],而高通量測序技術具有準確性高、靈敏度好、樣本量大等優(yōu)點,被認為是研究土壤微生物多樣性較好的方法[11-12],廣泛運用于土壤微生物多樣性研究。【前人研究進展】眾多學者將高通量測序運用在林地微生物研究中,周玉杰等[13]運用高通量測序方法全面分析了海南大豐農(nóng)場橡膠林土壤真菌群落狀況,浦滇等[14]通過探究不同樹齡茶樹土壤細菌多樣性,得出高通量絕對定量能夠研究不同樣本微生物群落的結論。許姍姍[15]分析云南昭通不同栽培模式蘋果園根際土壤微生物種群的特征發(fā)現(xiàn),不同栽培模式影響根際土壤微生物種群,汪其同等[16]運用高通量測序方法分析了楊樹人工林根際土壤真菌群落結構。莊靜靜等[17]分析發(fā)現(xiàn),刺槐-栓皮櫟混交林的土壤微生物量優(yōu)于刺槐純林,建議人工林種植過程中加大混交林的種植面積,陳艷芳等[18]采用高通量測序發(fā)現(xiàn),隨著連栽代數(shù)的增加,杉木林土壤AMF的豐富度逐漸增大,韓冬雪[19]運用高通量測序分析了長白山紅松林土壤微生物群落結構和功能多樣性,趙愛花等[20]運用該方法測定了寶天曼落葉闊葉林土壤細菌多樣性,劉曉華等[21]分析了黃土高原退耕還林區(qū)土壤細菌群落特征,喬沙沙等[22]探究了關帝山針葉林土壤細菌群落結構特征?！颈狙芯壳腥朦c】通過對不同間伐強度的遼東山區(qū)紅松人工林林下土壤真菌進行Illumina-Miseq高通量測序,分析表層和亞表層及5種間伐強度對大徑材培育目標下紅松人工林土壤真菌的短期影響?！緮M解決的關鍵問題】旨在了解不同土層和間伐強度土壤真菌的結構特征,進而對營林措施加以評價,以期為遼東山區(qū)紅松人工林土壤肥力維護、大徑材人工林經(jīng)營和森林多功能效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點位于遼寧省本溪市本溪滿族自治縣草河口鎮(zhèn)的實驗林場(40°53′ N,123°51′ E),屬于大陸性季風氣候,年均降水量926.3 mm,土壤為山地棕色森林土,pH 5.3～6.3,保水性差,平均海拔645 m,年均氣溫6.5 ℃。植被以紅松人工林為主,其下植物稀疏,僅有少量鐵線蓮(ClematisfloridaThunb)、大葉樟[Cinnamomumparthenoxylon(Jack) Nees]、天南星[Arisaemaerubescens(Wall) Schott]等[23]。

撫育間伐強度以保留株數(shù)為指標劃分弱度區(qū)1、中度區(qū)2、強度區(qū)3、極強度區(qū)4及對照0(不間伐)5個處理,各處理面積均為0.1 hm2,分別在1959年、1967年、1987年、1994年、2005年、2012年進行6次撫育間伐。2019年調(diào)查平均胸徑。采樣地基本特征如表1所示[1]。

表1 樣地基本特征

1.2 樣品采集

土壤樣品采集時間為2021年10月。選擇間伐強度為不間伐(對照組)、弱度區(qū)、中度區(qū)、強度區(qū)和極強度區(qū)的土壤進行不同間伐強度土壤真菌群落分析,選用中度間伐的表層(0～10 cm)及亞表層(10～20 cm)進行不同土層真菌群落分析。在標準地內(nèi)隨機選擇靠近紅松根系、具有穩(wěn)定土壤發(fā)育條件的空地,利用五點取樣法選取土樣混合均勻,用滅菌錫紙將新鮮土樣保存于液氮中,送回實驗室去除腐殖質(zhì)、植物根系等雜質(zhì),放置-80 ℃冰箱中,用于微生物多樣性高通量測序。

1.3 DNA提取及高通量測序分析

利用OMEGA試劑盒提取土壤真菌基因組DNA(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit),通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,Qubit定量檢測DNA樣本濃度。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量后進行PCR擴增,擴增引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)[24],ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[25]擴增片段長度為300 bp。通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小,使用Qubit3.0熒光定量儀(Invitrogen公司)進行文庫濃度測定。土壤樣品委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA提取和高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

進行Miseq文庫構建、拼接質(zhì)控、OTU聚類、數(shù)據(jù)分析與信息挖掘[26]。真菌群落多樣性均采用SPSS 17.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 土壤真菌群落稀釋曲線分析

由圖1可知,樣品稀釋曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢,說明結果存在較高的客觀土壤環(huán)境真菌群落構成置信度,能科學體現(xiàn)樣品各自真菌群落。雖存在少量部分未發(fā)現(xiàn)微生物的可能性,但測序結果仍可反應樣品絕大多數(shù)真菌信息。

圖1 土壤真菌群落稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of fungi under different plantation forests

2.2 不同間伐強度土層土壤真菌多樣性分析

通過Illumina-Miseq高通量測序共獲得572 932條高質(zhì)量ITS序列,在97%序列相似性基礎上可劃分為9329個OTUs。各土壤樣品真菌覆蓋度指數(shù)介于99.60%～99.92%,說明測序數(shù)據(jù)量合理,測序基本覆蓋了紅松人工林土壤中所有真菌類群,能夠體現(xiàn)真實的紅松人工林真菌特征。

從表2可知,不同土層土壤真菌群落Ace指數(shù)變化范圍為770.16～1213.04,Chao指數(shù)變化范圍為775.38～1207.68,Shannon指數(shù)變化范圍為3.29～4.82,Simpson指數(shù)變化范圍為0.03～0.11。不同土層ITS序列數(shù)、OTUs、Ace、Chao和Shannnon指數(shù)均表現(xiàn)為表層>亞表層;Simpson指數(shù)表現(xiàn)為表層<亞表層。表明,與亞表層土壤相比,表層土壤真菌更豐富。但方差結果顯示,二者各指數(shù)間的差異不顯著(P>0.05,下同),即二者真菌多樣性相近。

表2 表層與亞表層土壤真菌序列統(tǒng)計及多樣性指數(shù)

從表3可知,不同間伐強度土壤真菌群落Ace指數(shù)變化范圍為907.68～1087.78,Chao指數(shù)變化范圍為910.53～1087.74,Shannon指數(shù)變化范圍為3.75～4.50,Simpson指數(shù)變化范圍為0.04～0.10。不同間伐強度ITS序列數(shù)表現(xiàn)為0>4>2>1>3;OTUs、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannnon指數(shù)表現(xiàn)為4>1>0>3>2;Simpson指數(shù)表現(xiàn)為2>3>0>1>4。表明在不同間伐強度的土壤中,極強度區(qū)真菌種群最豐富,而中度區(qū)土壤真菌豐富度最低。方差結果顯示,不同間伐強度間各指數(shù)差異不顯著。

表3 不同間伐強度土壤真菌序列統(tǒng)計及多樣性指數(shù)

2.3 不同土層土壤優(yōu)勢真菌群落結構組成特征

2.3.1 不同土層土壤優(yōu)勢真菌群落在門水平上的豐富度分析 選第2組中度間伐強度的表層(0～10 cm)、亞表層(10～20 cm)土層進行差異分析。利用統(tǒng)計學分析方法,得到樣本在不同分類水平上的群落結構特征,主要以門和屬分類水平進行分析,樣本中豐度占比均大于一定比例(1%)的物種作為優(yōu)勢物種。

從圖2可知,在表層和亞表層2個土層中優(yōu)勢真菌群落在門水平上包括:擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、羅茨菌門(Rozellomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和分類不明確門,在表層占比分別為48.26%、26.51%、10.78%、1.15%、0.93%、0.79%、0.58%和10.57%,在亞表層占比分別為57.18%、24.88%、9.17%、0.79%、0.69%、0.36%、0.20%和6.34%。方差分析顯示,門水平上的表層和亞表層2個土層不同菌門相對豐度均無顯著差異,說明表層和亞表層2個土層的土壤真菌群落在門水平上的相對豐度無明顯區(qū)別。

圖2 不同土層土壤真菌群落門水平相對豐度Fig.2 Relative abundance of fungi community in different soil layers at phylum level

2.3.2 不同土層土壤優(yōu)勢真菌群落在屬水平上的豐富度分析 從圖3可知,在表層和亞表層2個土層中屬水平上排名前10的優(yōu)勢真菌群落包括:蠟殼耳屬(Sebacina)、被孢霉菌屬(Mortierella)、紅菇屬(Russula)、乳牛肝菌屬(Suillus)、Geminibasidium、白環(huán)蘑屬(Leucoagaricus)、角孢革菌屬(Tylospora)、鵝膏菌屬(Amanita)、Delastria和口蘑屬(Tricholoma),在表層占比分別為14.90%、10.77%、5.96%、4.55%、5.83%、0.30%、0.89%、1.93%、2.71%和0.28%,在亞表層占比分別為13.04%、9.15%、6.53%、4.81%、2.49%、7.22%、4.90%、3.84%、2.88%和0.64%。方差分析結果顯示,屬水平上,表層和亞表層2個土層土壤真菌群落在白環(huán)蘑屬和角孢革菌屬的相對豐度間均存在顯著差異(P<0.05,下同) ,其他類群菌屬相對豐度間差異不顯著。

圖3 不同土層土壤真菌群落屬水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of fungi community in different soil layers at genus level

2.4 不同間伐強度土壤真菌群落結構組成特征

2.4.1 不同間伐強度土壤優(yōu)勢真菌群落在門水平上的豐富度分析 從圖4可知,在5個間伐強度土壤中優(yōu)勢真菌群落在門水平上包括:擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、羅茨菌門(Rozellomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和分類不明確門,0組中占比分別為56.82%、29.63%、6.08%、0.88%、1.26%、0.20%、0.20%和4.55%,1組中占比分別為47.06%、31.14%、9.58%、0.52%、0.81%、0.32%、0.63%和9.65%,2組中占比分別為52.57%、21.20%、16.33%、1.33%、0.52%、0.68%、0.23%和6.83%,3組中占比分別為62.64%、20.56%、4.71%、1.28%、0.56%、0.52%、0.22%和8.96%,4組中占比分別為44.51%、25.94%、13.20%、0.86%、0.92%、1.17%、0.67%和12.40%。方差分析顯示,不同間伐強度土壤真菌群落在門水平上的相對豐度均無顯著差異,說明間伐強度未改變土壤真菌群落在門水平上的相對豐度。

2.4.2 不同間伐強度土壤優(yōu)勢真菌群落在屬水平上的豐富度分析 從圖5可知,在5個間伐強度土壤中的屬水平上排名前10的優(yōu)勢真菌群落包括:蠟殼耳屬(Sebacina)、被孢霉菌屬(Mortierella)、紅菇屬(Russula)、乳牛肝菌屬(Suillus)、Geminibasidium、白環(huán)蘑屬(Leucoagaricus)、角孢革菌屬(Tylospora)、鵝膏菌屬(Amanita)、Delastria和口蘑屬(Tricholoma),0組中占比分別為2.67%、6.07%、14.68%、9.15%、7.39%、0%、12.07%、0%、0%和0%,1組中占比分別為4.28%、9.58%、4.30%、0.82%、1.67%、18.28%、0.21%、0%、12.50%和0%,2組中占比分別為22.24%、16.24%、2.22%、5.79%、5.88%、0.05%、0.78%、0.01%、0.06%和0.24%,3組中占比分別為32.33%、4.70%、4.41%、6.70%、3.81%、0.48%、0.72%、0.45%、0.02%和0%,4組中占比分別為8.32%、13.19%、5.64%、0.94%、2.07%、0%、0.68%、13.98%、1.40%和2.06%。方差分析結果顯示,不同間伐強度土壤真菌群落在白環(huán)蘑屬、鵝膏菌屬和口蘑屬的相對豐度間均存在顯著差異。

圖5 不同間伐強度土壤真菌群落屬水平相對豐度Fig.5 Relative abundance of fungi community in different thinning intensities at genus level

2.5 土壤微生物主成分分析

對不同樣本群落組成進行主成分分析(PCA),可表征不同處理間土壤真菌群落存在的差異[27]。坐標軸選擇能最大反映樣品間差異的2個特征值,樣本物種組成越相似表現(xiàn)為在圖中距離越相近。由圖6可知,土壤真菌群落中主成分1(PC1)和主成分2(PC2)差異解釋度分別為23.29%和19.51%。同一間伐強度下土壤表層和亞表層距離相近,說明相同間伐強度下兩層土壤間物種組成較相似。1組與4組距離相近,說明極強與弱度區(qū)物種組成相近;1組和4組與0組距離較2組和3組近,說明極強區(qū)和弱度區(qū)與對照組物種組成較中強度區(qū)更相似。

圖6 土壤真菌PCA分析Fig.6 PCA of soil fungi

3 討 論

通過對不同間伐強度遼東山區(qū)紅松人工林表層和亞表層土壤進行高通量測序結果進行分析,發(fā)現(xiàn)土壤真菌生物量和Ace指數(shù)等4個多樣性指數(shù)總體上表現(xiàn)為表層大于亞表層土壤。說明土壤真菌多樣性在表層更高,這與韓世忠[28]的研究結果一致,同時微生物和酶活之間關系密切,在同等條件下,該土層試驗結果與酶活土層試驗[1]結果一致。

在不同間伐強度土壤中,真菌多樣性表現(xiàn)為極強度區(qū)>弱度區(qū),均大于對照組,中度區(qū)<強度區(qū),均小于對照組。不同間伐強度間土壤真菌多樣性差異不顯著,也有研究顯示,在油松林土壤微生物群落中,土壤真菌群落多樣性在不同間伐處理間差異不顯著[29]。目前關于間伐對土壤微生物的影響并無一致性結論[30]。本研究中,紅松人工林中表現(xiàn)為極強度區(qū)真菌種群更豐富,這可能是由于極強度區(qū)林分郁閉度低、陽光充足,且隨著間伐強度增加,林下草本植被生物量有明顯增加的趨勢[31],進而導致真菌多樣性高。中度區(qū)土壤真菌豐富度最低,但中度區(qū)對紅松大徑材培育效益較好,這可能是由于中度區(qū)存在對紅松生長有積極影響的真菌和外生菌根真菌,在競爭者中占據(jù)主導地位,進而導致其他菌群豐富度較低。

本研究中,不同土層和間伐強度中土壤真菌在門分類水平上有擔子菌門、子囊菌綱、被孢霉門、羅茨菌門等8個門占優(yōu)勢地位,這與鄧嬌嬌等[32]研究遼東山區(qū)2種針葉人工林土壤真菌生物群組成相似。各個處理間在門水平上均無顯著差異,說明紅松人工林不同處理間在門水平豐富度上相似度較大。不同土層土壤真菌在屬分類水平上,只有白環(huán)蘑屬和角孢革菌屬相對豐度間均存在顯著差異。其中白環(huán)蘑屬可與林木形成外生菌根,馮歡[33]的接種試驗表明其可影響青楊雌、雄的鉛耐受性。高婷婷[34]在紅松外生菌根真菌群落隨時間尺度的動態(tài)變化及影響因素試驗中發(fā)現(xiàn)紅松土壤中的EcMF優(yōu)勢屬主要有角孢革菌屬。不同間伐土壤真菌在屬分類水平上,白環(huán)蘑屬、鵝膏菌屬和口蘑屬的相對豐度間均存在顯著差異。鵝膏菌屬是常見的外生菌根,物種多樣性非常豐富的同時還是一類有毒的大型真菌,且毒性價值被廣泛深入研究[35]?？谀僮鳛槊朗潮淮蠹沂熘?徐洋[36]在中國東北地區(qū)松茸棲息地土壤微生物多樣性研究中發(fā)現(xiàn),樣地B在松茸子實體發(fā)育期(HTB,8—9月)的優(yōu)勢屬—口蘑屬占比42.16%,張元霞等[37]在遼寧東部山區(qū)珍貴野生食用菌中介紹口蘑屬中的棕灰口蘑(Tricholomaterreum)產(chǎn)地為遼東山區(qū)落葉松林內(nèi)或針闊混交林中。

4 結 論

在不同間伐強度遼東山區(qū)紅松人工林土壤真菌物種的組成中發(fā)現(xiàn),極強與弱度區(qū)物種組成相近,極強和弱度區(qū)與對照組相近程度高于中度和強度區(qū)。間伐處理可使紅松人工林林下土壤真菌物種組成產(chǎn)生差異,間伐在一定程度上影響了真菌物種組成。間伐處理及不同土層可使紅松人工林林下土壤真菌在豐富度、多樣性和物種組成產(chǎn)生差異,在一定程度上影響紅松人工林下土壤真菌群落的結構。