色素上皮衍生因子在眼部疾病中的研究進(jìn)展

陳 玲,譚 薇

0 引言

1989年Tombran-Tink等首次在人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中分離出色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor,PEDF)蛋白,被認(rèn)為是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,能夠誘導(dǎo)Y79視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤神經(jīng)元分化和成熟[1]。PEDF是分子量為50kDa的一種分泌型糖蛋白,其屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族,但具有不抑制蛋白酶活性的特質(zhì)[2]。編碼PEDF的基因serpinf1位于人類17p13染色體上[3],其34-mer短肽具有抗血管生成特性,44-mer短肽具有神經(jīng)營養(yǎng)特性[4]。PEDF廣泛分布于全身多種組織器官中,在眼部組織中PEDF通過與多種受體結(jié)合啟動(dòng)廣泛的細(xì)胞反應(yīng),從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生成、抗炎、抗氧化應(yīng)激和神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)作用[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)PEDF廣泛參與多種眼部疾病的發(fā)生發(fā)展,本文對近年來PEDF在干眼、角膜損傷、年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究進(jìn)展進(jìn)行重點(diǎn)綜述,為進(jìn)一步研究PEDF在診治眼部疾病方面提供幫助。

1 PEDF與干眼

干眼(dry eye,DE)是一種多因素導(dǎo)致的眼表疾病,以淚膜失去穩(wěn)態(tài)并伴有眼部癥狀為特征,其中淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲、眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常發(fā)揮病因作用[6]。干眼可能會(huì)引起多種眼部癥狀,如干燥、灼熱和視物模糊,甚至導(dǎo)致角膜并發(fā)癥而造成永久性視力喪失[7]。諸多研究證明免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在干眼的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,其中角膜上皮細(xì)胞分泌的PEDF可抑制免疫反應(yīng),具有維持眼表免疫穩(wěn)態(tài)的作用[8]。

Singh等[9]在干眼小鼠模型中檢測到PEDF在角膜上皮細(xì)胞中表達(dá)增加,并作為一種免疫調(diào)節(jié)因子對抗樹突狀細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的免疫反應(yīng),從而降低結(jié)膜促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。Th17細(xì)胞是介導(dǎo)DE中眼表自身免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[10],而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)能夠減輕Th17細(xì)胞的效應(yīng)作用。Singh等[11]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)干眼小鼠中的Tregs對Th17細(xì)胞的抑制效應(yīng)減弱,但通過在DE小鼠的Tregs培養(yǎng)基中添加重組PEDF后,發(fā)現(xiàn)PEDF對Tregs具有保護(hù)作用,證實(shí)PEDF可以減輕Tregs的功能障礙來降低DE的嚴(yán)重程度。Ma等[12]發(fā)現(xiàn)DE患者淚液中的PEDF濃度增加,并進(jìn)一步在DE小鼠模型中證實(shí)PEDF通過抑制MAPK p38和JNK信號(hào)通路來抑制促炎細(xì)胞因子在角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá),從而減輕角膜上皮損傷。除此外,PEDF對瞼板腺功能障礙的治療也具有一定作用,正常瞼板腺可分泌瞼脂從而形成防止淚膜蒸發(fā)的屏障,而瞼板腺功能障礙將導(dǎo)致瞼脂分泌異?；虿蛔?致使淚膜蒸發(fā)過快而發(fā)生DE[13]。Fan等[14]在老年小鼠結(jié)膜下注射合成的PEDF的衍生29-mer短肽,注射后發(fā)現(xiàn)其可以有效刺激瞼板腺泡基底細(xì)胞增殖,擴(kuò)大瞼板腺泡,改善小鼠淚膜破裂時(shí)間。以上研究顯示PEDF在DE中起著抗炎和改善瞼板腺功能障礙的作用,在DE的治療方面具有巨大潛力。

2 PEDF與角膜損傷

角膜是圓頂形的透明組織,位于虹膜和瞳孔的正前方,是眼球的屈光介質(zhì)之一。角膜與人體中的大多數(shù)組織不同,其不含血管,由淚液、瞼板腺、房水和支配它的三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維提供營養(yǎng)。炎癥、氧化應(yīng)激、病毒感染和創(chuàng)傷等會(huì)對角膜的正常結(jié)構(gòu)和生理功能造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷,近年來諸多的研究發(fā)現(xiàn)PEDF在維持角膜正常結(jié)構(gòu)和組織功能方面具有重要作用。Shang等[15]在PEDF基因缺失的小鼠中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性PEDF的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠角膜神經(jīng)生長中斷、敏感性降低及上皮損傷。除此外,還檢測出小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少及淚液量補(bǔ)償性增加。

PEDF在促進(jìn)角膜受損神經(jīng)的修復(fù)和抑制角膜新生血管方面具有一定療效。有研究表明,在小鼠角膜損傷的治療中應(yīng)用PEDF聯(lián)合二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)可增強(qiáng)角膜的修復(fù)作用。DHA是一種多不飽和脂肪酸,在大腦和視覺器官的發(fā)育中發(fā)揮重要作用,具有調(diào)節(jié)能量代謝、生長發(fā)育、免疫防御、抗炎癥、抗氧化等作用[16-17]。Pham等[18]應(yīng)用PEDF+DHA局部治療角膜基質(zhì)神經(jīng)受損的小鼠,證實(shí)PEDF可通過結(jié)合其受體激活角膜——三叉神經(jīng)軸,從而促進(jìn)角膜神經(jīng)再生,這種作用在PEDF+DHA聯(lián)合治療時(shí)增強(qiáng)。隨后該團(tuán)隊(duì)在糖尿病小鼠角膜損傷模型中證實(shí),PEDF+DHA可以促進(jìn)糖尿病小鼠的角膜神經(jīng)再生和加速傷口愈合,同時(shí)增強(qiáng)角膜敏感性和增加淚液產(chǎn)生量,并調(diào)節(jié)糖尿病小鼠角膜的炎癥反應(yīng)[19]。PEDF在糖尿病小鼠角膜損傷中的作用得到了更進(jìn)一步研究,Liu等[20]局部外用PEDF治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠角膜病變,發(fā)現(xiàn)PEDF不僅改善糖尿病小鼠角膜上皮損傷、增加角膜敏感性和淚液量,還降低晚期糖基化終產(chǎn)物的含量以減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的糖尿病小鼠角膜損傷。除PEDF外,PEDF的衍生短肽也具有抑制小鼠角膜新生血管和促進(jìn)角膜神經(jīng)修復(fù)的作用,Tian等[21]在單純皰疹病毒性角膜炎小鼠模型中予結(jié)膜下分別注射PEDF、PEDF的44-mer和34-mer短肽,研究發(fā)現(xiàn)注射完整的PEDF能更有效地減弱角膜神經(jīng)退行性變和新生血管。Yeh等[22]建立兔的角膜神經(jīng)損傷模型,分別在結(jié)膜下和角膜基質(zhì)內(nèi)注射PEDF的44-mer短肽,發(fā)現(xiàn)兔的角膜基底神經(jīng)末梢再生,角膜觸覺逐漸恢復(fù),但這種作用僅在基質(zhì)內(nèi)注射44-mer短肽后觀察到,且具有劑量依賴性。Ho等[23]合成PEDF衍生短肽7-mer,證實(shí)其可以阻止角膜新生血管形成。Mahmoudzadeh等[24]局部應(yīng)用PEDF與貝伐單抗治療兔角膜新生血管實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜容^其療效,發(fā)現(xiàn)兩者減少新生血管的長度和面積并沒有顯著差異,表明PEDF是一種較為安全有效的短期治療方案,但其長期影響有待研究。

綜上所述,PEDF是角膜神經(jīng)生長發(fā)育和維持眼表健康的重要分子,通過外源性的PEDF給藥對治療角膜損傷起著積極作用,但不同給藥方式及不同PEDF衍生短肽的治療效果不同,具體機(jī)制還有待研究。

3 PEDF與年齡相關(guān)性黃斑變性

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種由氧化應(yīng)激、炎癥等多因素導(dǎo)致的視網(wǎng)膜疾病,主要影響視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域,導(dǎo)致中央視力進(jìn)行性喪失。ARMD主要有兩種形式:干性黃斑變性,主要與RPE細(xì)胞的退化相關(guān);滲出性或濕性黃斑變性,與脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)相關(guān)[25]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可促進(jìn)CNV生成和增加血管通透性,在濕性ARMD的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[26]。有臨床研究表明,ARMD中Bruch膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體中PEDF水平降低,并且PEDF和VEGF之間存在臨界平衡,PEDF的減少可能會(huì)破壞平衡從而利于CNV的形成[27]。Oszajca等[28]觀察到ARMD患者的外周循環(huán)中PEDF含量明顯降低,尤其在滲出型ARMD患者中PEDF降低更為顯著;并且在疾病的進(jìn)展過程中,PEDF和VEGF水平呈負(fù)相關(guān),證實(shí)了它們的拮抗作用。Farnoodian等[29]在PEDF基因缺失的小鼠中分離出脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞,他們發(fā)現(xiàn)PEDF缺失的脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力更強(qiáng),其炎癥介質(zhì)骨橋蛋白和VEGF的表達(dá)水平增加,并且氧化應(yīng)激反應(yīng)也相應(yīng)增強(qiáng)。Nadal-Nicolas等[30]建立RPE細(xì)胞慢性氧化應(yīng)激損傷的體外模型,通過不同濃度的PEDF作用后測定其細(xì)胞毒性和活力。結(jié)果顯示,隨著PEDF濃度的增加,RPE細(xì)胞的氧化損傷明顯減少。

3.1 非病毒載體編碼PEDF基因的治療早期的動(dòng)物研究中已經(jīng)證實(shí),使用腺病毒或慢病毒載體將編碼PEDF的基因治療新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(nvARMD)具有良好效果[31-32]。然而使用病毒載體傳遞遺傳信息在效率和安全性方面仍然存在局限性,如腺病毒載體可能會(huì)影響療效甚至誘發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng);慢病毒載體傾向于將轉(zhuǎn)錄基因整合到宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性基因組區(qū)域,增加相關(guān)插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。有研究發(fā)現(xiàn),非病毒睡美人(sleeping beauty,SB)轉(zhuǎn)座子,特別是它的超活性形式(SB100X),可以避免與病毒載體相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn),提供高效、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)[33]。基于SB100X在傳遞遺傳信息方面的優(yōu)勢,Thumann等[34]開發(fā)無抗生素標(biāo)記的PFAR質(zhì)粒結(jié)合SB100X轉(zhuǎn)座子傳遞PEDF基因,其可以在原代牛虹膜色素上皮細(xì)胞和人RPE細(xì)胞中穩(wěn)定、長期保持基因表達(dá)和蛋白分泌。Pastor等[35]進(jìn)一步證實(shí)SB100X介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中,使原代人RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)染至重組PEDF蛋白的分泌量增加2.4倍且能保持8mo。Johnen等[36]使用SB100X轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PEDF至RPE細(xì)胞的基因組,結(jié)果顯示PEDF基因穩(wěn)定整合到RPE細(xì)胞的基因組中,且能持續(xù)高分泌PEDF。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)是一種神經(jīng)保護(hù)蛋白,Bascuas等[37-38]使用SB100X轉(zhuǎn)染PEDF+GM-CSF基因至人的RPE細(xì)胞,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組顯示出顯著的抗氧化細(xì)胞保護(hù)作用,并且同時(shí)過表達(dá)PFDE和GM-CSF基因的作用強(qiáng)于表達(dá)單一基因的作用。

3.2 非病毒載體編碼PEDF基因與RPE移植治療通過移植RPE來治療早期ARMD是一種有前景的治療方法[39]。最近的研究發(fā)現(xiàn),移植經(jīng)過修飾的高表達(dá)PEDF的RPE細(xì)胞和虹膜色素上皮細(xì)胞在治療ARMD方面有不錯(cuò)的療效。Garcia-Garcia等[40]應(yīng)用SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將編碼PEDF基因轉(zhuǎn)染至大鼠RPE細(xì)胞,先通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜和虹膜色素上皮細(xì)胞能分泌高水平的PEDF,再進(jìn)一步將該基因工程細(xì)胞移植到CNV大鼠模型的視網(wǎng)膜下,研究顯示該細(xì)胞能穩(wěn)定存活且持續(xù)高分泌PEDF達(dá)4mo以上,可減少50%的新生血管的形成。Hernandez等[41]將轉(zhuǎn)基因的RPE細(xì)胞和虹膜色素上皮細(xì)胞注入由激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型視網(wǎng)膜下腔,檢測注射后第7、14d大鼠脈絡(luò)膜血管滲漏面積及新生血管面積明顯減少,且PEDF/VEGF比值顯著增加。此外研究發(fā)現(xiàn),相比于RPE細(xì)胞懸浮液移植,RPE組織移植已經(jīng)被證明在形態(tài)、生理和存活方面更優(yōu)越,因?yàn)槠涮峁┘?xì)胞間連接和內(nèi)源性細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境,然而傳統(tǒng)的RPE組織移植需要應(yīng)用支架支撐這些微妙的結(jié)構(gòu),這種方法需要外科手術(shù)的侵入,為此Al-Ani等[42]開發(fā)無支架RPE微組織(RPE-μts),RPE-μts可以使用超細(xì)針頭視網(wǎng)膜下注射輸送,并且RPE-μts保留了關(guān)鍵的RPE分子標(biāo)記,與傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)相比PEDF的轉(zhuǎn)錄和分泌顯著增加。綜上所述,在動(dòng)物研究中通過SB100X系統(tǒng)編碼PEDF基因聯(lián)合RPE細(xì)胞懸浮液治療ARMD已有顯著成效,然而是否可以通過上述SB100X系統(tǒng)編碼PEDF基因聯(lián)合RPE組織移植的方式更有效地治療ARMD還有待研究。

4 PEDF與糖尿病視網(wǎng)膜病變

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥,DR的特征是視網(wǎng)膜血管病變和神經(jīng)元損傷。已有大量研究發(fā)現(xiàn)促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡失調(diào)可導(dǎo)致DR的進(jìn)展[43]。在正常視網(wǎng)膜中,神經(jīng)組織與血管內(nèi)皮細(xì)胞密切接觸,形成神經(jīng)血管單位,合成包括PEDF在內(nèi)的多種營養(yǎng)因子,其中PEDF在神經(jīng)保護(hù)、抗通透性和抗血管生成的3個(gè)因素中作用最明顯[44],PEDF的下調(diào)可能是導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜血管病變和神經(jīng)變性的重要原因[45]。Araújo等[46]在Ins2(Akita)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)PEDF在DR的早期階段有增加的趨勢,但在DR后期逐漸下降至保持不變,而促血管因子VEGF在DR的后期增加。Chen等[47]通過高脂飲食誘導(dǎo)獼猴的DR早期模型中發(fā)現(xiàn)恒河猴視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)增加,PEDF表達(dá)降低。在尼日利亞北部的DR患者的一項(xiàng)研究中顯示,DR患者血漿VEGF和PEDF水平明顯高于無視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者,盡管血糖控制良好,DR患者和對照組中VEGF/PEDF的比率也沒有顯著差異[48];這提示糖尿病患者不僅需要嚴(yán)格控制血脂和血糖外,針對這些關(guān)鍵分子進(jìn)行輔助治療可能在預(yù)防和延緩DR的發(fā)生中具有重要作用,有待進(jìn)一步研究。

基于PEDF的治療:早期研究中已經(jīng)證實(shí)PEDF在DR中的多重保護(hù)作用,Park等[49]構(gòu)建PEDF轉(zhuǎn)基因小鼠,并在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠中證實(shí),PEDF轉(zhuǎn)基因小鼠的視網(wǎng)膜新生血管減少、血管滲漏情況改善,以及促炎因子表達(dá)水平明顯降低。Haurigot等[50]通過對小鼠玻璃體注射腺相關(guān)病毒上調(diào)PEDF表達(dá),可以顯著抑制玻璃體內(nèi)新生血管,改善視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度,進(jìn)而預(yù)防視網(wǎng)膜脫離。然而,病毒載體與免疫原性和誘變性有關(guān),促進(jìn)了非病毒載體的設(shè)計(jì)作為替代。Calado等[51]發(fā)現(xiàn)通過非病毒載體pEPito轉(zhuǎn)導(dǎo)PEDF至糖尿病小鼠中,在單次視網(wǎng)膜下注射后,PEDF可持續(xù)表達(dá)長達(dá)3mo,并且降低VEGF水平及小膠質(zhì)細(xì)胞活性,從而減少炎癥。胎盤生長因子(placental growth factor,PlGF/PGF)是VEGF家族中另一個(gè)具有促血管生成和促炎癥作用的細(xì)胞因子,但其不是生理性血管生成所必須的,卻在病理性新生血管中發(fā)揮關(guān)鍵作用[52]?；诖?Araújo等[53-54]使用pEPito載體編碼PEDF基因聯(lián)合沉默PlGF基因治療糖尿病小鼠,在單次視網(wǎng)膜下注射21d后,糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)顯著減少、新生血管的明顯消退、視網(wǎng)膜毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)和通透性降低,并且這種聯(lián)合作用的影響優(yōu)于單一多表達(dá)PEDF或沉默PlGF。此外,考慮到PEDF對視網(wǎng)膜的神經(jīng)保護(hù)作用和PlGF沉默不影響生理性血管生成的強(qiáng)大抗血管生成作用,這種潛在的治療方法可能副作用更小。

5 小結(jié)和展望

PEDF參與多種眼部疾病的發(fā)生發(fā)展,發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制新生血管以及神經(jīng)營養(yǎng)等作用,對于干眼、角膜損傷、ARMD、DR等疾病的治療具有重要的潛在價(jià)值。PEDF可通過滴用、結(jié)膜下注射、基因治療等方式使其表達(dá)增加。通過滴用或結(jié)膜下注射外源性PEDF治療干眼及角膜損傷有明顯療效;通過非病毒載體編碼PEDF基因治療ARMD和DR,可以避免病毒載體傳遞的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn),其轉(zhuǎn)染效率更高,作用更安全有效。然而,同一研究中不同給藥方式以及不同PEDF衍生短肽顯示出的治療效果存在較大差異,還需進(jìn)一步研究。目前基于PEDF的治療方法多停留在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,其在眼部疾病中的臨床療效還不確定。因此,在未來的研究中,期望大樣本的納入以確定PEDF的使用時(shí)機(jī)、給藥方式和劑量等在臨床中的療效。