不同產(chǎn)地白術(shù)飲片HPLC指紋圖譜研究

侯曉杰 鄭 英 李 瑋 張建鋒

1．貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 5500025；2．貴州威利德制藥有限公司，貴州 貴陽 550016

白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖。臨床上白術(shù)炮制品主要有麩炒白術(shù)、土炒白術(shù)和焦白術(shù)等飲片，麩炒白術(shù)表面焦黃色或黃棕色，偶見焦斑，略有焦香氣，具有緩和燥性、健脾消脹之功效，用于脾胃不和、運化失常、倦怠乏力和表虛自汗等癥狀[2-4]；土炒白術(shù)表面杏黃土色，附有細(xì)土末，有土香氣，具有補(bǔ)脾止瀉之功效，用于脾虛食少、泄瀉便溏、胎動不安等癥狀[5-7]；焦白術(shù)不規(guī)則厚片，表面焦褐色，斷面焦黃色，質(zhì)松脆，略有焦香氣，焦白術(shù)具有補(bǔ)氣健脾、澀腸止瀉的作用，主要用于慢性寒性腹瀉[8-10]。因此，課題對不同區(qū)域白術(shù)飲片開展研究，建立指紋圖譜共有模式，用于白術(shù)飲片質(zhì)量控制，為白術(shù)質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀(賽默飛)；JT5003千分之一電子天平(余姚市金諾天平儀器公司)；ME204E萬分之一電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，AUW220D十萬分之一電子分析天平(蘇州島津儀器有限公司)；LDP-150高速萬能粉碎機(jī)(浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司)；DZ-2BC真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 材料 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品(批號：111975-201501)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌?批號：111976-201501)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品(批號：111978-201501)均購于中國食品藥品檢定研究院，以上對照品均供含量檢測用。甲醇(色譜純，天津科密歐公司)；乙腈(色譜純，天津科密歐公司)；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

收集不同產(chǎn)地的白術(shù)飲片，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室魏升華教授鑒定為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.經(jīng)加工制成的飲片。

表1 12批不同產(chǎn)地白術(shù)飲片來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈-水，梯度洗脫(0～10 min，50%-70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A)，流速為1.0 mL.min-1，柱溫為25 ℃，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ檢測波長為220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ檢測波長為276 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品適量，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度濃度分別為1.20 μg/mL、4.40 μg/mL、2.22 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱定白術(shù)飲片粉末(過3號篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)40 min，取出，放置至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取白術(shù)藥材粉末依照“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，以2號峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和峰面積，其結(jié)果分別為1.3%和1.9%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取白術(shù)藥材粉末6份，并依照“2.2.2”項下方法制備供試品平行溶液，按“2.1”項色譜條件下分別進(jìn)樣測定，以2號峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和峰面積，其結(jié)果分別為1.7%和2.2%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取白術(shù)藥材粉末依照“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，以2號峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和峰面積，其結(jié)果分別為1.6%和2.1%，表明24 h內(nèi)樣品溶液的成分穩(wěn)定。

2.4 白術(shù)HPLC指紋圖譜的建立及技術(shù)參數(shù)

2.4.1 白術(shù)HPLC指紋圖譜的比較和分析 采集于我國不同地區(qū)的12批白術(shù)飲片，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，記錄HPLC指紋圖譜，然后將12批飲片的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)2012版(國家藥典委員會)。進(jìn)行色譜峰匹配，并生成對照指紋圖譜，以建立的共有模式為參照圖譜計算1～12批樣品的相似度。

2.4.2 色譜峰指認(rèn) 對不同的供試品色譜圖的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，本試驗標(biāo)定了12個指紋圖譜中的共有峰，如圖1所示，與混合對照品的指紋圖譜進(jìn)行比對，確認(rèn)了2號峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、5號峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、8號峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。從相似度數(shù)據(jù)(表2)和圖2中可以看出不同地區(qū)的白術(shù)飲片相似度在0.963～0.999之間，均大于0.9，說明不同產(chǎn)地的白術(shù)所含化學(xué)成分大致相同。

圖1 白術(shù)飲片HPLC對照指紋圖譜

圖2 12批白術(shù)飲片HPLC指紋圖譜

表2 12批白術(shù)飲片指紋圖譜相似度分析結(jié)果情況表

2.4.3 白術(shù)參照峰的標(biāo)定 通過對12批不同產(chǎn)地白術(shù)飲片指紋圖譜的測定結(jié)果進(jìn)行比較，確定了12個色譜峰為共有峰，并選擇了2號峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰。在白術(shù)藥材指紋圖譜中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ保留時間適宜，峰形較穩(wěn)定，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ也是白術(shù)藥材的主要成分之一，并且在所有白術(shù)飲片中為共有峰，因此選定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為參照峰。

表3 12批白術(shù)HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間統(tǒng)計表

表4 12批白術(shù)HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積統(tǒng)計表

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本試驗利用紫外-可見分光光度計對白術(shù)樣品溶液進(jìn)行全波長掃描，經(jīng)波長掃描發(fā)現(xiàn)白術(shù)樣品溶液分別在243 nm，292 nm，376 nm 3個波長處有吸收。并利用高效液相色譜液對各波長進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長為243 nm時，基線較穩(wěn)定，呈現(xiàn)的吸收峰較多，峰面積相對較大，分離度好，峰形對稱。本試驗通過全波長掃描得到，樣品在3個波長下有吸收，分別對3個波長進(jìn)行比較，最終選擇243 nm作為白術(shù)指紋圖譜檢測波長。

3.2 洗脫方式的選擇 在實驗過程中，選擇等度洗脫和梯度洗脫兩種方式進(jìn)行研究，當(dāng)使用等度洗脫，色譜峰在分離過程中分離度不理想，所以考慮使用梯度洗脫，以色譜峰的分離度和保留時間為指標(biāo)，確定最終洗脫方式為梯度洗脫。

3.3 提取溶劑的選擇 取白術(shù)粉末約1.0 g，精密稱定，分別以甲醇和乙醇進(jìn)行超聲提取。以考察甲醇、乙醇作為提取的溶劑對白術(shù)樣品溶液的指紋圖譜，結(jié)果兩種提取溶劑對白術(shù)樣品差異不明顯，且乙醇毒性較小，故本試驗選擇用乙醇進(jìn)行提取。

3.4 提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 本試驗分別以100%、80%、60%乙醇作為溶劑考察對白術(shù)指紋圖譜的影響。顯示用100%乙醇作提取溶劑時，峰分離度較好，吸收較大，信息量大，故本試驗選擇用100%乙醇進(jìn)行提取。

3.5 料液比的選擇 本試驗對比不同料液比的提取溶劑對白術(shù)進(jìn)行提取，分別考察料液比為1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10對白術(shù)樣品指紋圖譜的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比為1∶20時，峰分離度較好，吸收較大，信息量大，故選擇1∶20為最佳料液比。

3.6 提取時間的選擇 為了得到較好的提取效果，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料[7-8]，本試驗分別考察超聲提取60 min、40 min、20 min對白術(shù)樣品的影響，當(dāng)提取時間為40 min時峰分離度較好，吸收較大，信息量大，本試驗以超聲40 min來進(jìn)行提取。

3.7 提取方法的選擇 以文獻(xiàn)中查閱的方法為依據(jù)[9-10]，分別進(jìn)行回流提取、超聲提取兩種方法考察，分別比較兩種提取方法下指紋圖譜，結(jié)果顯示，兩種提取方法對白術(shù)指紋圖譜色譜圖無明顯差異，為了操作方便，節(jié)約時間故選擇超聲提取。在研究白術(shù)指紋圖譜提取方法時，分別從樣品提取方法、提取溶劑、溶劑比例、提取時間進(jìn)行了考察，通過試驗結(jié)果，最終確定提取方法為加入100%乙醇20 mL超聲40 min。

3.8 指紋圖譜結(jié)果分析 通過建立白術(shù)飲片指紋圖譜，對12批白術(shù)飲片指紋圖譜進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)白術(shù)飲片HPLC共有峰的相對峰面積和共有保留時間具有較好穩(wěn)定性，12批飲片相似度均大于0.90，說明雖然產(chǎn)地不同，生長環(huán)境多樣化，但是白術(shù)的質(zhì)量相對穩(wěn)定。

綜上，研究根據(jù)市場調(diào)研情況，對全國白術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)分別采集樣品進(jìn)行研究，確保研究樣品具有道地性、真實性和代表性，全面系統(tǒng)考察了檢測波長、洗脫方式、提取溶劑、提取時間和料液比等條件，保證建立的方法較好的適用性和科學(xué)性。通過HPLC法對全國不同區(qū)域白術(shù)飲片進(jìn)行研究，建立白術(shù)飲片指紋圖譜研究方法，采用指紋圖譜軟件標(biāo)定12個共有峰，并選擇2號峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄12批次白術(shù)飲片的HPLC圖譜，其相似度均大于0.90，說明該方法具有較好的專屬性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和可控性，可作為白術(shù)種質(zhì)資源、開發(fā)應(yīng)用、加工方法和飲片標(biāo)準(zhǔn)等研究提供研究基礎(chǔ)和技術(shù)方法，并能更加系統(tǒng)全面為白術(shù)相關(guān)的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。