呂學(xué)霞,王亞喜,王長松

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八九醫(yī)院 病理科,河南 洛陽 471031)

自噬是一種保守的、無所不在的、非常重要的細(xì)胞降解蛋白質(zhì)聚集物或破壞胞漿內(nèi)容物、依賴溶酶體的保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的分解代謝活動。自噬可被多種刺激因素所激發(fā),如氧化應(yīng)激、饑餓和糖缺乏等,自噬小體的產(chǎn)生及LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ是自噬的2個經(jīng)典標(biāo)志。自噬失控后可產(chǎn)生多種傳染性和非傳染性疾病,自噬相關(guān)性非傳染性疾病包括腫瘤性和非腫瘤性疾病,如心血管疾病[1]、神經(jīng)退變性疾病[2]以及皮膚病[3],自噬失控相關(guān)的惡性腫瘤包括結(jié)直腸癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、白血病和淋巴瘤[8]、卵巢癌[9]以及其他癌癥[10]。

自噬在腫瘤發(fā)生和治療中的反應(yīng)十分復(fù)雜,具有腫瘤環(huán)境依賴性,在癌癥發(fā)展的不同階段作用也有所不同。在癌癥的初始階段,自噬因其分解代謝的角色,降解和/或再利用某些細(xì)胞成分,如損壞的細(xì)胞器和錯誤折疊的蛋白等而起保護作用,抑制腫瘤的發(fā)生。自噬還可以通過癌癥關(guān)聯(lián)突變而阻滯瘤細(xì)胞的增殖,從而限制突變細(xì)胞的播散,甚至通過促進基因突變細(xì)胞的老化而抑制腫瘤的形成。然而,一旦腫瘤已經(jīng)形成且開始進展,癌細(xì)胞會利用自噬機制為其提供營養(yǎng)并提供保護,如自噬能夠增加瘤細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力,進而引起基因的不穩(wěn)定和惡性轉(zhuǎn)化。癌細(xì)胞利用自噬在代謝和治療過程中的應(yīng)激狀態(tài)而長期存活。自噬能夠為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)而促進瘤細(xì)胞的生長,同時也能清除無用的細(xì)胞內(nèi)生物大分子對癌細(xì)胞產(chǎn)生的損傷而促進腫瘤的進展。自噬對于避免有害物質(zhì)的沉積如蛋白質(zhì)沉淀、有害的細(xì)胞有機物沉積以及對細(xì)胞有損害的致癌物質(zhì)的聚集十分重要。不能有效地清除這些必需的、老舊的或毒性物質(zhì)將會誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng),最終產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),導(dǎo)致細(xì)胞退變、凋亡或癌變。因此,自噬在惡性腫瘤的起始環(huán)節(jié)、進展、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中可能起著“雙刃劍”的作用,尤其在乳腺癌(breast cancer,BC)中[11]。

BC年發(fā)病率和病死率居全球女性惡性腫瘤年的第一位,2019年就有4萬例以上的BC患者死亡。盡管生活方式、遺傳因素、環(huán)境因素及生物變異等均是BC發(fā)生的危險因素,但BC的發(fā)生機制還未完全明了。BC的治療較為復(fù)雜,盡管綜合運用多種治療方法,如手術(shù)切除、化療、放療、靶向治療等諸多手段,但目前的治療方式還不夠充足,治療效果不夠滿意。更為困難的是BC患者常面臨化療抵抗、放療抵抗、激素治療抵抗以及靶向治療抵抗等問題。因此,有必要探索BC發(fā)病的新機制,同時依托新的BC發(fā)生機制研發(fā)新型的抗BC物或新輔助治療藥物。

1 自噬與乳腺發(fā)育

正常乳腺組織的發(fā)育過程中,自噬在腺體結(jié)構(gòu)發(fā)育和分化中起著十分關(guān)鍵的作用,同時還能保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。乳腺腺體細(xì)胞在發(fā)育過程中存在自噬現(xiàn)象,在此過程中,自噬相關(guān)基因(autophagerelated gene,ATG)發(fā)揮著重要作用,如ATG5和ATG7在乳腺非腫瘤性上皮細(xì)胞株MCF10A中的表達缺失導(dǎo)致凋亡前體caspase-3的增加及克隆形成能力的降低。當(dāng)過表達的抗凋亡蛋白Bcl-2阻斷凋亡后,失黏附細(xì)胞中自噬的缺失將導(dǎo)致細(xì)胞克隆活性降低。因此,失黏附介導(dǎo)的自噬可保護細(xì)胞免于發(fā)生凋亡。更有甚者在出生以后的乳腺腺體發(fā)育過程中,ATG7在乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育階段的缺失會阻斷自噬進而影響能量代謝反應(yīng),這種失調(diào)歸因于線粒體自噬的缺乏、線粒體中ROS的聚集、由ROS誘導(dǎo)基因產(chǎn)生的ROS過多所致。在晚期階段通過應(yīng)用BafA1或氯喹抑制自噬將導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞分化的完全終止,提示在乳腺上皮細(xì)胞分化過程中自噬、線粒體自噬和能量代謝之間保持平衡十分必要。保持自噬各要素間的平衡對于乳腺功能和腺體分化十分必要,因為腺腔細(xì)胞自噬的增加將會減少細(xì)胞的凋亡,這些細(xì)胞的死亡有利于促進乳腺導(dǎo)管中空腺腔的形成。

2 自噬抑制BC的發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移

通常自噬機制有助于保護正常細(xì)胞免于在遭受各種內(nèi)在、外在應(yīng)激時導(dǎo)致的DNA不穩(wěn)定和基因突變,避免受損細(xì)胞發(fā)生腫瘤前改變和異常增殖。促瘤性應(yīng)激因素還可以通過自噬通路而得到化解,如蛋白質(zhì)聚集、產(chǎn)生癌蛋白、線粒體失能產(chǎn)生ROS等。自噬還具有免疫保護功能,因為其參與了癌基因所致的病原控制、炎癥調(diào)控,參與抑制細(xì)胞惡變、免疫反應(yīng)提升,如支持抗原遞呈等過程。自噬對于保持細(xì)胞的完整性和保護細(xì)胞免于發(fā)生癌變非常重要。在癌癥的起始階段,自噬因其細(xì)胞保護的角色而被認(rèn)為具有腫瘤抑制效應(yīng),證據(jù)是在正常乳腺中觀察到自噬相關(guān)基因標(biāo)志物的增加,而在BC進展過程中逐漸減少,乃至丟失。

Beclin 1是Ⅲ型 PI3K復(fù)合體的成分之一,參與了自噬的核裂解環(huán)節(jié),是首個發(fā)現(xiàn)的ATG蛋白,其缺失后和BC的發(fā)生有關(guān)。增加Beclin 1的活性可以減少其與凋亡抑制因子Bcl-2的結(jié)合活性,自噬誘導(dǎo)多肽Tat-Beclin 1的產(chǎn)生會抑制HER2陽性BC細(xì)胞異種移植的進展[12]。與Beclin 1+/-小鼠相比,在前驅(qū)癌基因WNT1驅(qū)動的BC模型中Beclin 1+/+小鼠的成瘤能力顯著增強[13]。在單等位基因Beclin1缺失的情況下乳腺細(xì)胞出現(xiàn)調(diào)節(jié)失控,產(chǎn)生更具侵襲性的基底樣和三陰性乳腺癌(triple negative breast cancers,TNBC)樣BC,這在WNT1驅(qū)動的BC模型中得到了證實。自噬還參與癌基因信號通路的調(diào)節(jié),如通過降解癌基因Notch1的胞內(nèi)區(qū),靜默Beclin1基因降低TNBC細(xì)胞株的克隆形成能力與錨定生長能力。自噬和Beclin 1蛋白的活性有助于保持轉(zhuǎn)化細(xì)胞的癌基因信號通路,BC中大多數(shù)自噬的腫瘤抑制作用歸功于Beclin1基因。Beclin1甚至通過E-cadherin的胞漿、胞膜轉(zhuǎn)位抑制BC細(xì)胞MCF-7的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[14]。

叉頭框O(forkhead Box O,FOXO)轉(zhuǎn)錄因子具有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)定性、穩(wěn)定干細(xì)胞以及延緩衰老等功能,這些功能都和自噬的啟動有關(guān)。研究顯示FOXO3表達增加會誘導(dǎo)參與自噬啟動復(fù)合體的ATG蛋白的增加,以及自噬小體形成蛋白如ATG5、ATG10、ATG14和GABARAP的增加;同樣FOXO3的丟失將減少許多ATG的表達,導(dǎo)致自噬活性的減低。FOXO3的表達缺失將誘導(dǎo)乳腺腫瘤的形成,提示削減FOXO3介導(dǎo)的自噬將導(dǎo)致BC的形成[15]。

通過抑制RAS基因而誘導(dǎo)自噬,進而抑制BC的增生及血管生成[16]。在PyMT誘導(dǎo)的BC小鼠模型中,通過靜默MAP1LC3或Beclin1抑制自噬則可以減少cyclin D1、integrin-β1和磷酸化原癌基因酪氨酸蛋白激酶的表達,后者通過減少細(xì)胞進入G1期而保持細(xì)胞周期,從而促進BC的發(fā)生和進展[17]。

將小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞株工程化,使其失去自噬能力,然后注入大鼠體內(nèi),通過滅活自噬基因ATG5或ATG12使其失去自噬能力,結(jié)果表明自噬缺陷BC細(xì)胞形成顯著的、更大的、含有更多增殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶,而自噬功能完整的細(xì)胞則不會如此。和原發(fā)腫瘤相比,自噬缺陷BC細(xì)胞也可以形成更大的轉(zhuǎn)移灶,提示自噬可以抑制BC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[18]。自噬是如何抑制轉(zhuǎn)移灶生長的呢?自噬缺陷細(xì)胞顯示一種更不成熟的信號,這和其較強的轉(zhuǎn)移潛能和侵襲能力有關(guān)。進一步研究顯示自噬缺陷轉(zhuǎn)移灶的瘤細(xì)胞表達基底樣細(xì)胞標(biāo)志物CK14,說明瘤細(xì)胞處于一種更原始的狀態(tài)。而原發(fā)的自噬缺陷腫瘤也顯示CK14陽性的基底樣細(xì)胞表型,伴隨著較高的增殖活性,類似于轉(zhuǎn)移灶。自噬缺陷原發(fā)瘤細(xì)胞如果CK14陰性則增殖活性較低,提示自噬會影響B(tài)C瘤細(xì)胞的增殖。自噬是如何抑制瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的呢?研究顯示關(guān)閉自噬后導(dǎo)致自噬負(fù)荷受體的聚集,后者通過扮演信號支架的角色而改變細(xì)胞的命運[19]。Marsh等[18]的研究進一步顯示自噬缺陷細(xì)胞中自噬負(fù)荷受體NBR1和P62聚集將影響瘤細(xì)胞對轉(zhuǎn)移部位的選擇,NBR1表達缺失將完全消除自噬缺陷對轉(zhuǎn)移部位和表達CK14的基底樣細(xì)胞的影響,提示自噬抑制瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能是通過抑制NBR1的聚集所致。某些吡咯衍生物通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而抑制BC的發(fā)生。類泛素修飾子活化酶5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5,UBA5)在BC細(xì)胞中上調(diào),體外實驗顯示UBA5能夠阻斷BC細(xì)胞株MDA-MB-231的細(xì)胞周期,誘導(dǎo)自噬及胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激,進而抑制BC細(xì)胞的進展和增殖[20]。

通過活化RIP1介導(dǎo)的AKT/mTOR信號通路促進自噬小體形成,抑制自噬小體的降解,從而在體外抑制BC細(xì)胞的增殖,進而抑制BC細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的作用[21]。外源性BMP9通過cMyc/SNHG3/mTOR信號軸促進自噬的產(chǎn)生進而抑制MDA-MB-231BC細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。

3 自噬促進BC的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移

自噬過強將會對BC細(xì)胞造成損害,因為自噬是一種分解代謝的細(xì)胞過程,最終會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。誘導(dǎo)自噬可作為促進BC細(xì)胞死亡的策略之一,類似于化療和激素治療。自噬在BC轉(zhuǎn)移和進展過程中的作用,是通過解附細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合,支撐腫瘤細(xì)胞存活而促進BC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,這是BC細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷徙的第一步。

瘤細(xì)胞擴散是BC轉(zhuǎn)移的前提,BC主要轉(zhuǎn)移至骨、肺、腦和肝臟等器官,是造成BC患者死亡的主要原因。在腫瘤的遷移過程中,細(xì)胞移動性的失調(diào)如遷移和侵襲能力的增加是導(dǎo)致其擴散的主要原因。轉(zhuǎn)移機制包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),在此過程中上皮細(xì)胞啟動一系列分子改變,造成細(xì)胞間失連接、細(xì)胞極性喪失,最后引起間質(zhì)表型改變,瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力增強[23]。BC EMT中重要的調(diào)節(jié)因子是趨化因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6),它在乳腺組織中表達較為豐富,IL-6通過JAK激酶(Janus kinase,JAK)/STAT信號通路、MAPK信號通路誘導(dǎo)EMT,造成瘤細(xì)胞朝向間質(zhì)表型的分子重新編程,減少E-cadherin的表達及EMT相關(guān)因子如TWIST、SNAIL、N-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達。自噬可以強烈調(diào)節(jié)IL-6的分泌,提示BC細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境細(xì)胞中的自噬活性可以通過IL6/STAT和IL6/MAPK信號通路調(diào)節(jié)EMT,從而促進BC的轉(zhuǎn)移、侵襲[24]。

細(xì)胞黏附與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)也是BC細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵步驟,局灶黏附復(fù)合體包含細(xì)胞骨架和信號蛋白如連接素、樁蛋白、vinculin和局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)。局灶黏附復(fù)合體具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,能夠調(diào)節(jié)瘤細(xì)胞的動力、結(jié)構(gòu)和命運。瘤細(xì)胞遷徙過程中觀察到自噬小體與局灶黏附復(fù)合體的局部解離,提示自噬參與了局灶黏附復(fù)合體的解體。研究顯示在BC中自噬通過靜默ATG7或ATG12導(dǎo)致局灶黏附復(fù)合體的體積增大,瘤細(xì)胞遷移速度下降,提示自噬也可以通過穩(wěn)定局灶黏附復(fù)合體而減少癌細(xì)胞的遷徙。靜默ATG5或ATG7導(dǎo)致樁蛋白的聚集抑制了自噬,同時增加了瘤細(xì)胞的運動能力。通過靜默MAP1LC3或Beclin1通路抑制自噬造成整合素β1信號通路的不穩(wěn)定阻斷了SRC激酶的活性及尿激酶型纖溶酶原激活劑表面受體-尿激酶型纖溶酶原激活劑系統(tǒng),這是細(xì)胞遷移和侵襲的重要通路,據(jù)此自噬通過促進Hippo信號通路的癌基因效應(yīng)因子的核轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)TNBC癌細(xì)胞的遷移和侵襲[25]。

自噬還可以誘導(dǎo)BC細(xì)胞產(chǎn)生化療藥物抗性而促進BC的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、侵襲,體內(nèi)外研究顯示通過抑制自噬將使BC細(xì)胞重新獲得對化療藥物的敏感性,這主要是通過激活A(yù)KT/mTOR信號通路和TAK1/MAPK信號通路而實現(xiàn)[26]。

在MCF7 BC細(xì)胞中,含蛋白質(zhì)的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effector domain containing protein,DEDD)能夠抑制自噬,導(dǎo)致SNAIL和TWIST的聚集,進而促進EMT,促進BC細(xì)胞的遷移。而在高侵襲性BC細(xì)胞株MDA-MB-231中異位表達DEDD則誘導(dǎo)自噬依賴的SNAIL和TWIST基因降解及EMT過程的減弱。在BC細(xì)胞中早期自噬激酶(Unc-51樣自噬激活激酶1)的下調(diào)能夠減少線粒體自噬,導(dǎo)致線粒體失能而產(chǎn)生過多的ROS,引起ROS介導(dǎo)的炎癥小體增加,引起破骨細(xì)胞中細(xì)胞因子的釋放,造成更廣泛的骨轉(zhuǎn)移[27]。雌激素受體β(estrogen receptors,ERβ)通過直接活化CLDN6誘導(dǎo)CLDN6介導(dǎo)的自噬,抑制BC細(xì)胞的遷移和侵襲,作為BC的抑制基因,CLDN6在體內(nèi)外通過自噬通路能夠抑制BC的轉(zhuǎn)移[28]。3-MA抑制自噬將增加BC細(xì)胞的遷移和侵襲,而通過增加LC3和Beclin 1的表達可以逆轉(zhuǎn)此過程[29]。

總之,自噬在涉及EMT和局部粘附斑逆轉(zhuǎn)的遷移過程中作用關(guān)鍵,然而自噬是促進還是抑制BC細(xì)胞遷移取決于瘤組織的周圍環(huán)境。同時自噬作為一個分解代謝過程對保持細(xì)胞穩(wěn)定和完整性是必需的,在健康的乳腺細(xì)胞中它的大部分功能是腫瘤抑制,而在腫瘤形成后則可以促進腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移。針對自噬采取靶向治療能夠改善BC患者的預(yù)后。

4 自噬與TNBC

根據(jù)BC中ER、PR的表達、HER-2狀態(tài)及Ki-67指數(shù)可以將其分為4個分子類型,即:luminal A型,luminal B型,HER2過表達型和TNBC,每種類型的治療方法有所不同,預(yù)后也不盡相同。TNBC占所有BC的10%左右,對各種治療都不敏感,是所有BC中預(yù)后最差的分子類型。

和非腫瘤組織相比,ATG7蛋白表達水平在TNBC中較低,ATG7高表達降低了TNBC細(xì)胞的增殖和糖代謝,因此高表達ATG7的TNBC患者總體生存率較高,提示某些ATGs可能發(fā)揮抑制TNBC進展的作用[30]。糖酵解和谷氨酰胺分解的關(guān)鍵酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶2 (glutamate pyruvate transaminase 2,GPT2)在TNBC中顯著高于瘤周組織,徹底滅活該酶會導(dǎo)致TCA循環(huán)中間體的減少,引起葡萄糖碳原子的重新連接,其減少還會影響rapamycin 復(fù)合體1的活性及誘導(dǎo)自噬,異種移植瘤模型顯示GPT2水平減低誘導(dǎo)自噬增加和BC生長增速,因此自噬在TNBC進展中發(fā)揮著重要作用[31]。

也有研究顯示自噬標(biāo)志物的表達與ER、PR或HER-2的表達沒有關(guān)系,調(diào)節(jié)這些基因可能是不同的、獨立的分子通路[32]。自噬相關(guān)基因LC3B高表達和TNBC患者預(yù)后差、侵襲性強密切相關(guān)[33]。缺氧誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生進而促進BC細(xì)胞的存活及觸發(fā)化療抵抗,高表達缺氧誘導(dǎo)因子1α、miR-210和Beclin 1及低表達 Bcl-2與TNBC患者預(yù)后差、對新輔助化療反應(yīng)差密切相關(guān)[34]。

5 小結(jié)

自噬在BC中的作用是“好”還是“壞”還存在爭議,因此需要更多的研究以證實自噬對BC的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)究竟是促進還是抑制,明確自噬在BC進展中的機制也有助于優(yōu)化治療決策,采取抑制或誘導(dǎo)自噬的策略以更好的治療BC。自噬相關(guān)基因標(biāo)志物是BC患者無復(fù)發(fā)生存的獨立預(yù)后因素,聯(lián)合應(yīng)用自噬相關(guān)危險評分和臨床病理特征可以預(yù)測BC患者的3 a和5 a無復(fù)發(fā)生存率[35]。

自噬在BC中的作用因BC的不同分子亞型而不同,如依賴Beclin1基因誘導(dǎo)的自噬會抑制luminal樣BC細(xì)胞的腫瘤形成及瘤細(xì)胞增殖,而高侵襲性的TNBC常為更強的致癌基因信號通路所驅(qū)動而需要依賴/不依賴錨定通路的增殖方式。即使對于同一亞型的BC病例自噬也具有相反的或環(huán)境依賴性的作用,這也提示我們不能簡單的把自噬與BC的分子類型關(guān)聯(lián),病變的不同階段及其作用特點需要重新定義,需要重新審視自噬在BC中的真正作用。多數(shù)研究結(jié)論是在體外或小鼠模型中獲得的,更為精準(zhǔn)的、更為特異的自噬調(diào)節(jié)的臨床試驗和研究將為患者的臨床治療提供益處。同時鑒于BC的異質(zhì)性,且BC的治療是一個長期的過程,在BC產(chǎn)生、進展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、播散、治療過程中可能需要研究特定的或不定的自噬調(diào)節(jié)因子,因此需要盡最大可能去發(fā)掘自噬標(biāo)志物、去研究機體在腫瘤不同階段的自噬狀態(tài)、去研究自噬影響機體對腫瘤的免疫反應(yīng),達到聯(lián)合治療BC、預(yù)判BC預(yù)后的目的。特異的自噬調(diào)節(jié)藥物也有助于研究者和臨床腫瘤專家預(yù)測BC患者早期和晚期自噬調(diào)節(jié)藥物的個體化療效。