任棚， 呂曉桂， 石磊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，呼和浩特 010018）

冷等離子體種子處理技術(shù)是一種刺激種子萌發(fā)、提高作物產(chǎn)量的現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)技術(shù)，具有環(huán)保經(jīng)濟(jì)、方便快捷的特點(diǎn)[1?2]；相比于輻射育種，冷等離子體處理能夠在種子不發(fā)生基因突變的情況下激發(fā)其活力，所以不存在遺傳風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，關(guān)于冷等離子體種子處理技術(shù)已經(jīng)有了大量的研究，這些研究均證實(shí)了冷等離子體種子處理技術(shù)能夠提高種子發(fā)芽率、改善作物生長(zhǎng)、提升作物抗逆性以及增加產(chǎn)量[4-8]。

裸燕麥不僅是重要的糧食作物，也是優(yōu)質(zhì)飼料的來(lái)源之一[9?10]，研究表明燕麥具有預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤等藥用功效[11?12]。但是，由于微生物污染、環(huán)境脅迫、種子品質(zhì)低等因素的影響，目前燕麥種子萌發(fā)率普遍較低且產(chǎn)量不高[7]。因此，尋找合適的處理手段來(lái)解決以上問題就顯得很有必要?？紤]到冷等離子體處理技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)燕麥種子進(jìn)行冷等離子體處理，并探究冷等離子體對(duì)其萌發(fā)的影響規(guī)律具有重要意義。本試驗(yàn)探究大氣壓冷等離子體持續(xù)與間隔處理對(duì)燕麥種子萌發(fā)的影響規(guī)律，在前期試驗(yàn)選定合適處理電壓的基礎(chǔ)上，在總處理時(shí)間不變的條件下，分別對(duì)燕麥種子進(jìn)行了單組持續(xù)處理和多組間隔處理，比較了二者對(duì)種子萌發(fā)的影響，并對(duì)機(jī)理進(jìn)行了討論，為下一步研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用自制的大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體射流裝置（圖1），該裝置包括等離子體發(fā)生、傳送、檢測(cè)3 部分。等離子體發(fā)生部分由高壓交流電源、高壓電極（包裹于扁口狀石英管外壁的鋁箔，其中石英管管口規(guī)格為50 mm×5 mm）、陰極（銅片）、99.999%的高純氬氣、LZB 轉(zhuǎn)子流量計(jì)組成。上下電極間距9 mm，流量計(jì)控制不同流量的氬氣由石英管側(cè)壁的進(jìn)氣口進(jìn)入石英管，在高壓電極附近被電離形成等離子體，等離子體在氣流作用下噴向石英管開口附近區(qū)域，形成等離子體射流區(qū)。傳送部分由可調(diào)速動(dòng)力裝置、絕緣膠皮傳送履帶組成，低壓電極置于2 層絕緣履帶之間并與大地相連，試驗(yàn)時(shí)將種子平鋪于履帶上層，通過改變傳送速度來(lái)控制種子經(jīng)過等離子體射流區(qū)的時(shí)間。檢測(cè)部分主要由高壓探頭和數(shù)字示波器組成，用來(lái)檢測(cè)放電電壓。

圖1 等離子體射流裝置Fig.1 Plasma jet device

1.2 種子處理

供試燕麥品種為‘壩莜一號(hào)’，種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)燕麥產(chǎn)業(yè)研究中心提供。將種子用自來(lái)水沖洗20 min，蒸餾水沖洗2 遍后，濾紙吸凈種子表面水分，然后在35 ℃下烘24 h，使種子含水量一致，最后進(jìn)行等離子體處理。各組等離子體處理參數(shù)如表1 所示，其中以不進(jìn)行處理為對(duì)照組（CK），設(shè)40和60 s共2個(gè)處理總時(shí)間，在2個(gè)處理總時(shí)間內(nèi)又設(shè)間隔處理和持續(xù)處理，即40 s處理總時(shí)間內(nèi)分別設(shè)40 s 處理1 次（A1）、20 s 處理2 次（A2）、10 s 處理4 次（A3）；60 s 處理總時(shí)間內(nèi)分別設(shè)60 s處理1次（B1）、30 s處理2次（B2）、20 s處理3 次（B3）和10 s 處理6 次（B4）。處理時(shí)氣流量為150 L·h-1、電壓為4 kV，每2 次處理間隔時(shí)間為2 min。

表1 各組燕麥種子等離子體處理參數(shù)Table 1 Plasma treatment parameters of each group oat seeds

1.3 發(fā)芽試驗(yàn)

等離子體處理后的種子在2% NaClO 溶液中浸種消毒5 min，用蒸餾水沖洗干凈并浸泡6 h 催芽。在發(fā)芽盒內(nèi)鋪2 層芽紙作為芽床，浸種后種子腹溝向下均勻擺放在濕潤(rùn)的芽床上，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100 粒種子。將發(fā)芽盒放置于人工氣候箱中，晝24 ℃/夜18 ℃、晝16 h/夜8 h 進(jìn)行培養(yǎng)，每天噴灑適量蒸餾水使芽紙保持濕潤(rùn)。從培養(yǎng)第2 天開始，每24 h 統(tǒng)計(jì)1 次發(fā)芽種子數(shù)，以芽長(zhǎng)不短于種子長(zhǎng)的50%作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 表面接觸角和吸水率試驗(yàn)

使用Kino 光學(xué)法接觸角儀（型號(hào)SL150E，美國(guó)科諾工業(yè)有限公司）測(cè)量種子表面接觸角。吸水率測(cè)量使用Roy 等[13]的方法，將種子置于純水中，在25 ℃環(huán)境中靜置，每隔60 min測(cè)定1次種子重量直至恒重為止。每組3次重復(fù)。

1.5 幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量

在培養(yǎng)的第8 天，每組隨機(jī)挑選15 棵幼苗（3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 棵），從根結(jié)處分離。用毫米尺直接測(cè)量幼苗根結(jié)至葉尖的長(zhǎng)度記作芽長(zhǎng)，根結(jié)至根尖的長(zhǎng)度記作根長(zhǎng)。將幼苗放置在65 ℃下烘干，用電子天平每隔2 h分別測(cè)量1次芽和根的重量，直至恒重。

1.6 可溶性蛋白含量和α-淀粉酶活性測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定可溶性蛋白含量，3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定α-淀粉酶活性[14]。分別測(cè)定第3、第5、第7天的可溶性蛋白含量和α-淀粉酶活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（Duncan’s test、P<0.05），圖表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下表面接觸角和種子吸水率的變化

一般而言，種子表面接觸角越小，其親水性越高。不同處理下種子表面接觸角和吸水率的變化如圖2 所示，與CK 相比，各處理組種子表面接觸角均變小，表明親水性均顯著增加（P<0.05）。吸水率變化方面，除了B1 處理略有增加外，其他處理組均有所降低，其中B4處理下降最顯著。間隔處理的種子與持續(xù)處理相比，在親水性變化上，A2、A3 處理組的親水性較A1 顯著增加，其中A3處理變化最大，與A1相比提高約39.07%；與B1相比，B2、B4 處理組親水性有所下降，而B3 有所上升，但變化均不顯著。在吸水率變化方面，種子吸水率隨著間隔處理次數(shù)的增加而降低，A1、A2、A3處理組之間差異不明顯，但是B3、B4組與B1組相比吸水率顯著下降。2 種處理方式對(duì)親水性和吸水率的影響差異可能與總處理時(shí)間的不同有關(guān)，當(dāng)總處理時(shí)間為40 s 時(shí)，間隔處理對(duì)親水性影響較大；當(dāng)總處理時(shí)間延長(zhǎng)為60 s時(shí)，間隔處理對(duì)親水性影響變小，對(duì)吸水率的影響變大。

2.2 不同處理下種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的變化

不同處理對(duì)燕麥種子發(fā)芽勢(shì)的影響如圖3 所示，除了A1 外，處理組種子發(fā)芽勢(shì)均高于CK。隨著間隔處理次數(shù)的增加，種子發(fā)芽勢(shì)逐漸提高，當(dāng)總處理時(shí)間為40 s 時(shí)，與持續(xù)處理的A1 相比，間隔處理的A2 和A3 組種子發(fā)芽勢(shì)依次提高，并且A3 增加顯著（P<0.05），與A1 相比提高約27.16%。同樣，當(dāng)總處理時(shí)間為60 s 時(shí)，間隔處理的B2、B3、B4 組種子發(fā)芽勢(shì)不但比持續(xù)處理的B1 有所提升，而且與CK 相比顯著提升。發(fā)芽率方面，與持續(xù)處理相比間隔處理提高了種子發(fā)芽率，但不具有顯著性。由此說(shuō)明，間隔處理對(duì)燕麥種子的發(fā)芽勢(shì)促進(jìn)作用更強(qiáng)，對(duì)于發(fā)芽率暫未發(fā)現(xiàn)明顯影響。

圖3 不同處理對(duì)燕麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Fig.3 Effects of different treatments on germination potential and rate of oat seeds

2.3 不同處理下燕麥幼苗生長(zhǎng)情況

圖4表示不同處理對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)的影響。當(dāng)總處理時(shí)間為40 s 時(shí)，間隔處理的A2、A3 組幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根干重和芽干重與持續(xù)處理的A1相比逐漸提高，并且A3處理燕麥幼苗各項(xiàng)指標(biāo)較CK有不同程度增加，但增加不顯著。當(dāng)總處理時(shí)間為60 s 時(shí)，B2 處理根干重有所增加，雖然較B1處理增加不顯著，但是與CK 相比增加顯著；此外，與B1 相比，除了B2 處理根干重有所增加外，B2、B3、B4 組的其他各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的降低，但下降不顯著。

圖4 不同處理對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different treatments on the growth of oat seedlings

2.4 不同處理下可溶性蛋白含量的變化

可溶性蛋白含量在一定程度上反映了種子萌發(fā)時(shí)內(nèi)部各種生化反應(yīng)的快慢程度。由圖5可知，第5 天的可溶性蛋白含量明顯低于第3 和第7 天。第3 天各處理組的可溶性蛋白含量均高于CK，但差異不顯著；40 s下間隔處理的可溶性蛋白含量要低于持續(xù)處理，總處理時(shí)間為60 s時(shí)，與B1相比B2處理可溶性蛋白含量下降，B3、B4處理可溶性蛋白含量上升，與持續(xù)處理相比，間隔處理時(shí)可溶性蛋白含量均沒有顯著性變化。第5天，各處理組的可溶性蛋白含量均低于CK，其中B1、B3和B4處理下降顯著（P<0.05）；隨著間隔處理次數(shù)的增加，40 s下間隔處理時(shí)種子中可溶性蛋白含量逐漸增加，而60 s下間隔處理時(shí)可溶性蛋白含量逐漸降低，最后低于持續(xù)處理，同樣間隔處理時(shí)可溶性蛋白含量變化差異不顯著。第7 天中可溶性蛋白含量整體增加，除A2處理外其余間隔處理的各組種子可溶性蛋白含量要高于持續(xù)處理組，但差異不顯著。

圖5 不同處理對(duì)種子可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on soluble protein content of seeds

2.5 不同處理下α-淀粉酶活性的變化

α-淀粉酶活性是衡量種子發(fā)芽快慢的重要指標(biāo)之一，其變化如圖6 所示。首先，第7 天的α-淀粉酶活性要遠(yuǎn)低于第3和第5天，而且各組酶活性相當(dāng)，沒有顯著差異。第3天時(shí)，處理組的α-淀粉酶活性整體低于CK，其中A3、B3 和B4 處理顯著降低（P<0.05）；與A1 相比，A2 處理α-淀粉酶活性稍有提高，A3 處理α-淀粉酶活性降低，但差異均不顯著；與B1相比，B2、B3、B4處理的α-淀粉酶活性逐漸降低，B4 組α-淀粉酶活性顯著下降30.42%。第5 天時(shí)，只有B2 和B4 處理α-淀粉酶活性低于CK，且不具有顯著性；間隔處理時(shí)α-淀粉酶活性均低于持續(xù)處理，但差異不顯著。

圖6 不同處理對(duì)種子α-淀粉酶活性的影響Fig.6 Effects of different treatments on α-amylase activity of seeds

3 討論

3.1 冷等離子體處理對(duì)燕麥種子親水性和吸水率的影響

種子吸水是種子萌發(fā)的關(guān)鍵時(shí)期。研究表明等離子體處理能夠改變種皮結(jié)構(gòu)，增加種皮的親水性，加速水分和離子進(jìn)入種子內(nèi)部，促進(jìn)發(fā)芽[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，間隔處理時(shí)燕麥的親水性都有不同程度的增加，其中10 s 處理4 次時(shí)親水性增加最大，當(dāng)總處理時(shí)間為60 s時(shí)，親水性的變化不再顯著，這與孟祎然[15]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明適宜強(qiáng)度的等離子體處理能夠提高種皮親水性，隨著強(qiáng)度的增加種子親水性變化不再明顯。此外，本研究發(fā)現(xiàn)等離子體處理后種子的吸水率有不同程度的下降，并且間隔處理次數(shù)越多，吸水率降低越明顯，這與Li 等[7]、Roy 等[13]和Xu 等[16]發(fā)現(xiàn)等離子體處理后種子吸水率上升的結(jié)果不一致。究其原因，可能是由于等離子束對(duì)燕麥種子糊粉層造成影響，直鏈淀粉的α-1,4糖苷鍵斷裂繼而形成更多α-1,6 糖苷鍵[17]，以及蛋白質(zhì)疏水氨基酸殘基暴露[18]，使得種子內(nèi)部疏水性增加，導(dǎo)致吸水率下降。

3.2 冷等離子體處理對(duì)燕麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響

發(fā)芽勢(shì)能夠反映種子的發(fā)芽速度和整齊度，而發(fā)芽率可以反映種子生命力的強(qiáng)弱，兩者都是衡量種子發(fā)芽活力的重要指標(biāo)[19]。本研究中，與持續(xù)處理相比，間隔處理對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)的提高更為明顯，其中，10 s 處理4 次時(shí)提升最大，這與親水性的變化結(jié)果對(duì)應(yīng)，但是間隔處理并未對(duì)種子發(fā)芽率造成顯著影響。Bormashenko 等[20]對(duì)菜豆進(jìn)行冷等離子體處理，發(fā)現(xiàn)菜豆種子的親水性和發(fā)芽勢(shì)雖然有顯著增加，但是發(fā)芽率并沒有明顯改變，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。此外，本研究中對(duì)種子進(jìn)行間隔處理可能會(huì)使種子一直處于脅迫狀態(tài)，從而產(chǎn)生大量活性氧自由基，這些活性氧自由基促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而激發(fā)種子活性，提高發(fā)芽勢(shì)[13,21]。

3.3 冷等離子體處理對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)的影響

大量研究證實(shí)采用適宜參數(shù)的等離子體處理種子，對(duì)幼苗的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用[4,6?7]。Wang 等[22]發(fā)現(xiàn)，由于等離子體處理后種子的酶活性與細(xì)胞膜通透性提高，加速了新細(xì)胞的形成，促進(jìn)根和芽的分化與生長(zhǎng)，從而促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。Xu 等[16]采用多針板結(jié)構(gòu)高壓電場(chǎng)處理燕麥種子后，燕麥幼苗的高度和鮮重都顯著增加。但本研究使用介質(zhì)阻擋放電等離子體處理燕麥種子，發(fā)現(xiàn)間隔處理和持續(xù)處理對(duì)燕麥幼苗的生長(zhǎng)并沒有顯著影響，這與?erá 等[23]的結(jié)果類似。綜上，可能是由于種子對(duì)不同放電類型的反應(yīng)不同，造成了燕麥幼苗變化不明顯，具體機(jī)制還待進(jìn)一步探究。

3.4 冷等離子體處理對(duì)燕麥種子萌發(fā)前期可溶性蛋白含量和α-淀粉酶活性的影響

本研究中可溶性蛋白含量總體上隨發(fā)芽周期的變化呈現(xiàn)先下降后上升的規(guī)律，這與黃明鏡[24]的研究結(jié)果一致。與持續(xù)處理相比，間隔處理的燕麥種子在第3和第5天可溶性蛋白含量較低，但是第7 天蛋白含量提升明顯并超過持續(xù)處理的種子，說(shuō)明間隔處理對(duì)燕麥幼苗后期生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更大。種子的萌發(fā)伴隨著淀粉等貯藏物質(zhì)的分解，因此，α-淀粉酶活性能夠反映種子萌發(fā)的快慢[19,24]。本研究中α-淀粉酶活性總體上變化呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律，說(shuō)明淀粉分解主要發(fā)生在發(fā)芽中期，這與孟會(huì)峰[25]的結(jié)果一致。在發(fā)芽第3和第5天，與持續(xù)處理相比，間隔處理時(shí)種子α-淀粉酶活性降低，可能因?yàn)槎啻翁幚懋a(chǎn)生了過多活性氧自由基，對(duì)細(xì)胞抑制較大[26]，從而降低了淀粉酶的活性。