基于線粒體COI基因?qū)赝莛B(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析

張燕萍 章海鑫 習(xí)宏斌 吳子君 廖再生

文章編號(hào)：1006-3188（2023）04-001-05

摘要：為研究江西省棘胸蛙的遺傳多樣性，利用線粒體COI分子標(biāo)記對(duì)采自江西省內(nèi)峽江、靖安、金溪、明月山、于都5個(gè)棘胸蛙養(yǎng)殖群體144個(gè)樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示：144條棘胸蛙線粒體COI長(zhǎng)度為990bp，共檢測(cè)出變異位點(diǎn)270個(gè)，包括簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)250個(gè)，單突變位點(diǎn)20個(gè)，2個(gè)缺失和插入；共檢測(cè)到35個(gè)不同的單倍型，單倍型多樣性為0.927；核苷酸多樣性為0.0405，平均核苷酸差異數(shù)（K）為40.018。養(yǎng)殖群體除峽江和于都群體的遺傳多樣性較高，其余3個(gè)群體均較低；群體內(nèi)發(fā)生了極大的分化，群體變異主要來(lái)源于群體內(nèi)（78.08%）。

關(guān)鍵詞：棘胸蛙；COI；養(yǎng)殖群體；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：Q959.53；S966.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）又名石蛙、石雞等，屬脊椎動(dòng)物門、兩棲綱、無(wú)尾目、叉舌蛙科、棘胸蛙屬［1］，具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味道甘美、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，而且具有較高的經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值，所以受到越來(lái)越多的人關(guān)注。為了滿足市場(chǎng)需求及保護(hù)野生資源，江西20世紀(jì)80年代初開始人工養(yǎng)殖棘胸蛙，人工養(yǎng)殖過程中近親繁殖，導(dǎo)致我省棘胸蛙出現(xiàn)生長(zhǎng)速度慢、抗病力差、個(gè)頭小等問題，缺乏對(duì)養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。

細(xì)胞色素氧化酶亞基I（Cytochrome coxidase subunit I，COI）是線粒體中13個(gè)蛋白編碼基因之一，該基因功能比較保守，同時(shí)又有一定的進(jìn)化速率，包含的遺傳進(jìn)化信息量較大，在物種內(nèi)變異較小，種間變異較大，很少存在插入和缺失，且容易被通用引物所擴(kuò)增，所以在水生生物種群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)發(fā)育等發(fā)面得到了廣泛應(yīng)用［2-3］。

本研究基于線粒體DNACOI，對(duì)江西省內(nèi)5個(gè)棘胸蛙養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析，旨在為解決棘胸蛙人工養(yǎng)殖過程中由于遺傳多樣性下降而導(dǎo)致養(yǎng)殖效益降低的現(xiàn)狀，同時(shí)為我省棘胸蛙的品種選育與改良工作提供理論基礎(chǔ)，為棘胸蛙種質(zhì)資源恢復(fù)與可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

棘胸蛙采自江西省吉安地區(qū)峽江群體（XJ）22尾、宜春地區(qū)明月山群體30尾、宜春地區(qū)靖安群體32尾、贛州地區(qū)于都群體30尾、撫州地區(qū)金溪群體30尾。共計(jì)144尾，剪肌肉用95%乙醇保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取少量棘胸蛙的肌肉，利用生工生物工程（上海）有限公司提供的動(dòng)物基因組提取試劑盒提取。提取后的DNA利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增

用于線粒體COI通用引物，引物序列為F（5′–GAAAGACGGGCCTTGATCCC–3′）和R（5′–GCCATTGAGAGGAGTACAGGG–3′），送至上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為：10×buffer（MgCl2）2.5μL，dNTP（mix）（10mmol/L）1μL，引物（10mmol/L）各1μL，模板DNA（50ng/L）2μL，Taq DNA Polymerase（5U/μL）0.2μL，加超純水至25μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸 30 s，10個(gè)循環(huán)；95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)和測(cè)序

PCR產(chǎn)物取5μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和濃度合格后，將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）有限公司純化與雙向測(cè)序，測(cè)序引物同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)得的上下游序列利用DNA序列用SeqMan軟件進(jìn)行拼接并手工校對(duì)。Clustal W（1.83）軟件［4］分析比對(duì)；利用DNAsp 5.0［5］軟統(tǒng)計(jì)單倍型及變異位點(diǎn)（S）、計(jì)算單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異（K）等多樣性參數(shù)。用MEGA（version 6.0）軟件［6］中的Kimura雙參數(shù)法計(jì)算各單倍型間的遺傳距離；采用NJ（Neighbor-joining）法，Bootstrap置信值估算重復(fù)次數(shù)1000次，對(duì)基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析。用Ariequin3.11［7］軟件計(jì)算兩兩群體間的分化指數(shù)（Fst），進(jìn)行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘胸蛙COI基因序列PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見圖1。由圖1可知，棘胸蛙COI序列條帶電泳圖譜條帶清晰、明亮，線粒體COI序的片段大于1000bp。這可說(shuō)明提取的棘胸蛙肌肉DNA質(zhì)量較高，能夠用于后期的群體遺傳學(xué)研究（見圖1）。

2.2 棘胸蛙線粒粒體COI序列特征

序列經(jīng)比對(duì)后，獲得的棘胸蛙樣品的線粒體COI序列長(zhǎng)度為990bp，檢測(cè)到插入和缺失位點(diǎn)2個(gè)，檢測(cè)到變異位點(diǎn)270個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)250個(gè)，單突變位點(diǎn)20個(gè)（圖2）。堿基平均含量：A（27.1%）、T（31.3%）、G（16.8%）和C（24.8%），A+T含量（58.4%）顯著高于G+C含量（41.6%），表現(xiàn)為明顯的堿基組成偏倚性，與一般脊椎動(dòng)物線粒體DNA序列特征基本一致。

2.3 單倍型分析

基于5個(gè)棘胸蛙養(yǎng)殖群體144條COI序列，共界定出35種單倍型，結(jié)果見表1，各群體包含單倍型類型差異較大，于都群體分布的單倍型最多（13種）、金溪群體分布的單倍型最少（9種）。分布最廣泛的Hap_5、Hap_6以及Hap_9單倍型分別出現(xiàn)為15次、29次和13次，其中Hap_6為共有單倍型。

2.3 遺傳多樣性分析

群體內(nèi)的遺傳多樣性可以通過單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)等數(shù)據(jù)來(lái)體現(xiàn)。通過DnaSP5軟件計(jì)算各群體的遺傳多樣性參數(shù)見表2。144個(gè)樣本合計(jì)，單倍型多態(tài)性（Hd）為0.927，核苷酸多樣性（Pi）為0.04050，5個(gè)養(yǎng)殖群體的Pi值均超過0.01，說(shuō)明這五個(gè)養(yǎng)殖群體的變異程度均較大；平均核苷酸差異數(shù)（K）為40.018，各群體平均核苷酸差異在21.060～39.391。

2.4 遺傳結(jié)構(gòu)

通過利用MEGA 4.0軟件中的Kimura 2-parameter模型，計(jì)算出5個(gè)棘胸蛙群體之間以及群體內(nèi)部的遺傳距離（D），結(jié)果如表3所示。5個(gè)棘胸蛙養(yǎng)殖群體內(nèi)的遺傳距離在0.025～0.049之間分布，內(nèi)部平均遺傳距離為0.045。在5個(gè)養(yǎng)殖群體中，遺傳距離最近的為于都群體和金溪群體，遺傳距離最遠(yuǎn)的為明月山群體和靖安群體。

2.5 遺傳差異及遺傳分化

通過運(yùn)用Arequin 3.5軟件計(jì)算5個(gè)棘胸蛙養(yǎng)殖群體的遺傳分化，結(jié)果見表4。結(jié)果表明棘胸蛙兩兩群體間遺傳分化系數(shù)（FST）值在0.00382～0.40090之間，其中宜春地區(qū)的明月山群體（MY）與宜春地區(qū)靖安群體（JA）發(fā)生的遺傳分化最大，而與撫州地區(qū)金溪群體（JX）發(fā)生的遺傳分化最小，YD、MY、JA群體間，JA與JX群體間，XJ與JA群體間均發(fā)生極大的分化（FST>0.25，P<0.001），但XJ與YD及JX群體間遺傳分化處于中等水平（0.1

利用AMOVA軟件進(jìn)行棘胸蛙群體間和群體內(nèi)的遺傳變異分析，分析結(jié)果如表5所示。分析結(jié)果顯示，5個(gè)棘胸蛙養(yǎng)殖群體中，群體間的變異為27.92%，群體內(nèi)的變異為72.08%，群體內(nèi)的變異明顯大于群體間的變異，表明變異主要來(lái)自棘胸蛙群體內(nèi)部。

2.6 單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于COI基因序列的棘胸蛙群體的單倍型數(shù)據(jù)，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。35個(gè)單倍型分成4個(gè)單系，獨(dú)有單倍型hap14、hap15、hap35形成一小單系，屬于明月山和金溪群體；獨(dú)有單倍型hap1、hap2、hap7、hap18、hap19、hap20、hap21、hap23、hap24、hap26、hap29和共享單倍型hap16、hap22形成一大單系，屬于于都、峽江、靖安群體。共享單倍型hap9、hap13、hap5、hap25、hap11和獨(dú)有單倍型hap34形成一單系，屬于峽江、明月山、金溪、靖安群體。其他單倍型聚為一大單系，來(lái)自所有群體。

3 討論

3.1 棘胸蛙的序列特征

本文中5個(gè)144尾棘胸蛙群體mtDNACOI基因序列中，堿基A、T、G、C的平均含量分別為27.1%、31.2%、16.8%、24.8%，5個(gè)群體中A+T堿基的平均含量（58.4%）大于G+C堿基平均含量（41.68%），在水產(chǎn)動(dòng)物中此類現(xiàn)象比較常見，符合脊椎動(dòng)物mtDNA堿基組成分布不均一的特點(diǎn)［8］。

3.2 棘胸蛙的遺傳多樣性

本試驗(yàn)中測(cè)定的棘胸蛙5個(gè)群體的COI序列中共檢測(cè)270個(gè)變異位點(diǎn)，占全部序列的27.27%，共定義了35個(gè)單倍型。本研究中單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.927、0.0405，與路慶芳［9］（2008）研究的野生群體（Hd：0.968，Pi：0.1168）相比，Hd和Pi均有下降，這一點(diǎn)與魏朝宇［10］研究的養(yǎng)殖群體（Hd：0.94568，Pi：0.0341）比野生群體低的結(jié)果一致。養(yǎng)殖群體遺傳多樣性下降，可能是因?yàn)槿斯ゐB(yǎng)殖過程中，存在近親繁殖的現(xiàn)象，導(dǎo)致養(yǎng)殖群體遺傳多樣性下降。

3.3 棘胸蛙群體的遺傳變異

根據(jù)COI序列變異得到的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示（圖3），共享單倍型hap6分布于5個(gè)群體中，所含樣本數(shù)最多29個(gè)，推測(cè)為古老單倍型?？傮w來(lái)說(shuō)，江西省各個(gè)縣區(qū)棘胸蛙養(yǎng)殖群體的單倍型呈現(xiàn)出一種混雜的分布格局，錯(cuò)綜交織。

群體間的遺傳分化指數(shù)（Fst）用來(lái)表示群體間的遺傳分化程度，F(xiàn)st值越大，表明兩個(gè)群體間的分化程度越高；反之，分化程度越低［8］。根據(jù)各群體的Fst值，判斷峽江與于都群體間、明月山與靖安群體間遺傳分化很小，可以忽略不計(jì)；峽江與明月山、金溪群體間遺傳分化處于較高水平；明月山與于都、靖安群體間，于都與靖安、金溪群體間，靖安與金溪群體間遺傳分化很大。

群體間的遺傳距離能反映群體間的親緣關(guān)系，值越大親緣關(guān)系越疏遠(yuǎn)。利用MEGA軟件計(jì)算群體間遺傳距離（表3），XJ與YD（0.034）、XJ與JX（0.035）、JX與MY（0.037）之間的遺傳距離較小，表明親緣關(guān)系較近，而MY與YD、JA 2群體間的遺傳距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明MY群體與YD群體及JA群體之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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基金項(xiàng)目：江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20192BBF60023）

作者簡(jiǎn)介：張燕萍（1979-），女，博士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖、漁業(yè)資源與漁業(yè)生態(tài)環(huán)境研究。E-mail：zhangyanpingxie@163.com.