葉廣彬 張忠偉 李艷麗 高麗 黃偉 凌博

國家癌癥中心發(fā)布的最新一期的全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌是我國男性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺腺癌是肺癌中常見的類型之一（占31.5%），同時(shí)也是非小細(xì)胞肺癌的重要亞型（占50%）[1,2]。最新的流行病理學(xué)研究[3]表明，非小細(xì)胞肺癌的兩個(gè)主流亞型中，肺腺癌的發(fā)病率逐年增高，而肺鱗癌的發(fā)病率則呈現(xiàn)下降趨勢。肺腺癌具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，其核心原因是早期篩查和預(yù)后指標(biāo)不明確導(dǎo)致其高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率[4,5]。臨床中肺腺癌組織病理學(xué)檢測指標(biāo)，諸如細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7, CK7）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor 1, TTF1）、天冬氨酸蛋白酶A（novel aspartie proteinase A, Napsin A）等，在病理診斷的準(zhǔn)確性和特異性中仍然存在一定的局限性[6,7]。我們前期的研究[8]證實(shí)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D（myocyte enhancer factor 2D, MEF2D）可促進(jìn)NUSAP1的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和H1299的增殖和轉(zhuǎn)移能力。MEF2D是非小細(xì)胞肺癌化療中的協(xié)同效應(yīng)分子，MEF2D干擾后可增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的敏感性，其核心機(jī)制源于MEF2D對(duì)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的調(diào)控作用[9]。盡管明確了MEF2D在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)程中的調(diào)控作用，但肺腺癌患者中MEF2D的表達(dá)規(guī)律和預(yù)后特點(diǎn)仍然不清楚。因此，深入分析MEF2D在肺腺癌中的表達(dá)，并闡明其與臨床指標(biāo)和預(yù)后規(guī)律之間的相關(guān)性，或可為肺腺癌的早期篩查和預(yù)后診斷提供潛在性的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、重慶市人民醫(yī)院收治的肺腺癌患者（2010至2016年）199例。患者均通過影像學(xué)和病理檢測進(jìn)行確診，且均接受了手術(shù)治療，切除的肺腺癌組織和癌旁組織均進(jìn)行石蠟包埋處理。在入組的患者中，手術(shù)前均未進(jìn)行放化療，均未出現(xiàn)多原發(fā)癌，圍手術(shù)期內(nèi)均未出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，影像學(xué)確定分期情況，所有患者的病例資料齊全且經(jīng)過嚴(yán)格的隨訪，隨訪時(shí)間到2020年8月。本研究經(jīng)過了右江民族醫(yī)學(xué)院（批準(zhǔn)號(hào)：2019102001）和重慶市人民醫(yī)院（批準(zhǔn)號(hào)：2015082104）的批準(zhǔn)，并獲得了患者及家屬的知情同意。

所有入組患者中男性86例，女性113例；≥50歲174例，<50歲25例；依據(jù)腫瘤原發(fā)部位分組，肺上葉80例，肺下葉100例，肺中葉10例，不明位置9例；腫瘤偏側(cè)性分組，左側(cè)80例，右側(cè)119例；腫瘤分化程度分組，高分化97例，中分化75例，低分化27例；參照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer, AJCC）分期2010年第10版進(jìn)行腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-nodemetastasis, TNM）分期，T分期中T1期81例，T2期53例，T3期41例，T4期24例；M分期中M0期152例，M1期47例；N分期中N0期135例，N1期15例，N2期37例，N3期12例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色檢測MEF2D的表達(dá)

1.2.1 試劑耗材 抗體：一抗為小鼠單克隆抗體MEF2D（H-11，貨號(hào)sc-271153，Santa Cruz Biotechnology），二抗為抗小鼠IgG二抗（貨號(hào)sc-533670，Santa Cruz Biotechnology）。SP免疫組化檢測試劑采購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB顯影液采購于Invitrogen公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 將包埋好的組織樣本蠟塊切片后，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟見參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.3 檢測結(jié)果判讀 免疫組化染色評(píng)分方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[10,11]，依據(jù)免疫組化染色評(píng)分分為MEF2D高表達(dá)組（≥6分）和MEF2D低表達(dá)組（<6分）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用Mean±SD表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，各組樣本的比較采用卡方檢驗(yàn)。Kaplan-Meier制作生存曲線并用Log-rank檢驗(yàn)其差異性。Cox多因素分析肺腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌患者組織樣本中MEF2D的表達(dá) 收集肺腺癌患者組織樣本，共得到199例肺腺癌的癌組織樣本和188例肺腺癌的癌旁組織樣本（其中11例癌旁樣本切片不完整故而排除）。MEF2D的表達(dá)主要分布在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中。在肺腺癌的癌組織樣本中，MEF2D高表達(dá)患者126例，MEF2D低表達(dá)患者73例。在肺腺癌的癌旁組織樣本中，MEF2D高表達(dá)患者89例，MEF2D低表達(dá)患者99例。肺腺癌患者中，癌組織MEF2D高表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P<0.05）。見圖1。

圖1 免疫組化染色檢測肺腺癌組織中MEF2D的表達(dá)（×200）。A：陰性表達(dá)（-）；B：弱陽性表達(dá)（+）；C：中陽性表達(dá)（++）；D：強(qiáng)陽性表達(dá)（+++）。Fig 1 Expression of MEF2D in lung adenocarcinoma tissues detected by immunohistochemical staining (×200).A: Negative expression (-); B:Weakly positive expression (+); C: Moderately positive expression (++); D: Strongly positive expression (+++).MEF2D: myocyte enhancer factor 2D.

2.2 肺腺癌中MEF2D與患者臨床特征的相關(guān)性 根據(jù)肺腺癌的癌組織中MEF2D的免疫組化染色結(jié)果和患者的臨床資料進(jìn)行分析，肺腺癌患者的癌組織中MEF2D表達(dá)水平與腫瘤分化程度、N分期、M分期和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性（P<0.05）；與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、偏側(cè)性、T分期、骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P>0.05）。中低分化、N1、N2、N3、M1和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者易出現(xiàn)癌組織中MEF2D的高表達(dá)。見表1。

表1 MEF2D表達(dá)高低水平與肺腺癌臨床特征之間的相關(guān)性分析[n (%)]Tab 1 Correlation analysis between high and low levels of MEF2D expression and clinical features of lung adenocarcinoma [n (%)]

2.3 MEF2D表達(dá)水平對(duì)肺腺癌預(yù)后的影響Kaplan-Meier分析得出，肺腺癌患者中MEF2D低表達(dá)的預(yù)后效果顯著優(yōu)于MEF2D高表達(dá)（P<0.05）（圖2）。對(duì)患者的生存率和生存時(shí)間進(jìn)行分析可以得出（表2，表3），MEF2D高表達(dá)肺腺癌患者的1、3、5年生存率和平均生存時(shí)間均顯著低于MEF2D低表達(dá)患者（P<0.05）。

表2 MEF2D表達(dá)與總生存期中的生存率、生存時(shí)間的相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis of MEF2D expression with survival rate and survival time in overall survival

表3 MEF2D表達(dá)與腫瘤特異性生存期中的生存率、生存時(shí)間的相關(guān)性分析Tab 3 Correlation analysis of MEF2D expression with survival rate and survival time in cancer-specific survival

圖2 肺腺癌患者組織中MEF2D表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性分析。A：總生存期的比較；B：腫瘤特異性生存期的比較。Fig 2 Correlation analysis between MEF2D expression level and prognosis in tissues of patients with lung adenocarcinoma.A: Overall survival; B:Cancer-specific survival.

2.4Cox多因素分析MEF2D與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性 納入患者的臨床資料和MEF2D水平進(jìn)行Cox多因素分析得出，MEF2D表達(dá)水平、M分期、N分期和骨轉(zhuǎn)移是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。MEF2D高表達(dá)、M1期、N1期和骨轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者的預(yù)后效果較差，見表4。值得注意的是，肺腺癌中分化患者較低分化患者預(yù)后差，以及腫瘤原發(fā)偏側(cè)性結(jié)果存在爭議，故剔除。

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，肺腺癌的臨床治療手段也取得了一定的進(jìn)步，手術(shù)、放化療、分子靶向藥物和免疫治療等多種方法的應(yīng)用，均取得了良好的臨床療效，并提升了患者的預(yù)后效果[12]。然而，高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍然是制約肺腺癌臨床的重要難題。在腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中，腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和腫瘤血管新生是核心環(huán)節(jié)之一[13]。轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，也是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力獲得的核心調(diào)控因子，如Snail、Zeb和Twist等轉(zhuǎn)錄因子通過靶向調(diào)控E-cadherin、N-cadherin等基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)[14]。然而，鑒于肺腺癌轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)的復(fù)雜性和單一轉(zhuǎn)錄因子功能的局限性，開發(fā)新的腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子具有很強(qiáng)的理論意義和臨床價(jià)值。

轉(zhuǎn)錄因子MEF2D被認(rèn)為是潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。在卵巢癌的研究[15]中，利用MEF2D siRNA載體干擾SKOV3細(xì)胞后，可降低SKOV3細(xì)胞增殖和裸鼠成瘤能力。在結(jié)直腸癌的研究[16]中，MEF2D可提升腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT表型的形成。同時(shí)也有觀點(diǎn)[17]指出，MEF2D與腫瘤血管新生關(guān)系密切，MEF2D可直接誘導(dǎo)血管新生靶點(diǎn)蛋白缺氧誘導(dǎo)因子1α的高表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的血管新生。在肝癌的研究[18]中，MEF2D持續(xù)的高表達(dá)將激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）信號(hào)通路，同時(shí)與Twist結(jié)合從而發(fā)揮其促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，繼而提升肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。而在肝癌免疫逃逸的研究[19]中，MEF2D所誘導(dǎo)的腫瘤血管新生是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸的重要因素之一。我們前期研究[8]證實(shí)MEF2D參與了非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控，然而僅局限在腫瘤細(xì)胞功能水平。本研究以MEF2D在臨床樣本中的表達(dá)為切入點(diǎn)，整理臨床指標(biāo)和隨訪資料，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析挖掘肺腺癌中MEF2D的表達(dá)規(guī)律和預(yù)后特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)MEF2D高表達(dá)與腫瘤分期（N/M）、分化水平和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。TNM分期中，N分期可以用于評(píng)價(jià)腫瘤是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；M分期用于評(píng)價(jià)腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移[20]，由此可以得出MEF2D高表達(dá)與肺腺癌患者高轉(zhuǎn)移率具有正相關(guān)性。

本研究進(jìn)一步分析了肺腺癌中不同的MEF2D表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。Kaplan-Meier分析證實(shí)肺腺癌患者（MEF2D高表達(dá)）的1、3、5年生存率和平均生存時(shí)間均顯著低于MEF2D低表達(dá)。Cox多因素回歸分析證實(shí)MEF2D表達(dá)水平是肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。以上結(jié)果提示MEF2D可作為肺腺癌早期篩查和預(yù)后分析的潛在靶點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量驗(yàn)證和深入挖掘其作用機(jī)制。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Ye GB, Huang W and Ling B conceived and designed the study.Zhang ZW, Li YL and Gao L performed the experiments.Ye GB and Ling B analyzed the data.Huang W and Ling B contributed analysis tools.Ye GB, Huang W and Ling B provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.