腦性癱瘓生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

劉 宇，宋福祥

（1.佳木斯大學(xué) a 康復(fù)醫(yī)學(xué)院* 護(hù)理學(xué)院 b 兒童神經(jīng)康復(fù)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007 ；2.深圳市龍華區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000）

腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）簡(jiǎn)稱(chēng)腦癱，是由大腦發(fā)育不成熟、先天性發(fā)育缺陷或損傷等非進(jìn)行性腦損傷引起的一組持續(xù)存在的中樞性運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)發(fā)育障礙、活動(dòng)受限的癥候群[1]。我國(guó)目前1 ～6歲兒童腦癱的患病率為2.46‰[2]，國(guó)外的患病率為1.4‰～3.2‰[3-5]。目前，已有很多證據(jù)表明早期干預(yù)可以有效改善腦癱患兒的預(yù)后。但當(dāng)前的早期診斷主要是基于神經(jīng)系統(tǒng)檢查以及運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估。為了能夠更準(zhǔn)確、更早地診斷腦癱，越來(lái)越多的研究人員關(guān)注到生物標(biāo)志物的篩查。通過(guò)生物標(biāo)志物檢測(cè)進(jìn)行早期診斷，并給予腦癱患兒早期干預(yù)和治療，可改善其預(yù)后。生物標(biāo)志物是指具有“一種可客觀檢測(cè)和評(píng)價(jià)的特性，可作為正常生物學(xué)過(guò)程、病理過(guò)程或治療干預(yù)藥理學(xué)反應(yīng)的指示因子”。尋找和發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的生物標(biāo)志物已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生物標(biāo)志物對(duì)疾病的早期診斷及干預(yù)策略的制定至關(guān)重要。本文總結(jié)了目前腦癱生物標(biāo)志物以及針對(duì)這些生物標(biāo)志物發(fā)展的檢測(cè)技術(shù)，以期為腦癱的提早發(fā)現(xiàn)及早期干預(yù)提供指導(dǎo)。

1 生物標(biāo)志物

1.1 遺傳基因

目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，10% ～30% 的腦癱兒童可以確定潛在的遺傳病因[6]。腦癱低風(fēng)險(xiǎn)嬰兒也應(yīng)該進(jìn)行遺傳病理學(xué)篩查，如沒(méi)有先天性出生缺陷的足月兒[7]。通過(guò)全外顯子組測(cè)序（Whole Exome Sequencing，WES）[8]，研究者報(bào)道了三個(gè)先前確定的 腦 癱 基 因（TUBA1A、SCN8A 和KDM5C）及 六個(gè)新的候選腦癱基因（AGAP1、JHDM1D、MAST1、NAA35、RFX2 和WIPI2）可能對(duì)腦癱具有潛在的致病性。最終，在14% 的腦癱病例中發(fā)現(xiàn)了新發(fā)和遺傳性單核苷酸變異，其中一半在候選基因中，同時(shí)確定了5 個(gè)基因的變異可能會(huì)導(dǎo)致腦癱的出現(xiàn)，分別為KDM5C、SCN8A、TUBA1A、L1CAM 和PAK3。遺傳的異質(zhì)性突出了遺傳對(duì)腦癱影響的復(fù)雜性，需要進(jìn)一步研究來(lái)確定這些假定致病性腦癱基因的致病作用。這些研究突出了下一代測(cè)序可提供精確的分子診斷作用，加深了對(duì)疾病病理學(xué)的理解，為完善遺傳機(jī)制和預(yù)后咨詢(xún)提供了機(jī)會(huì)。另外，當(dāng)前此方法運(yùn)用越來(lái)越多，操作也越來(lái)越便捷，希望未來(lái)在預(yù)測(cè)腦癱方面得到更多的重視。

1.2 DNA 甲基化

DNA 甲基化是一類(lèi)發(fā)生在胞嘧啶5 號(hào)位碳原子上，可以通過(guò)改變基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來(lái)穩(wěn)定遺傳的表觀修飾。表觀遺傳學(xué)在改變基因表達(dá)以應(yīng)對(duì)細(xì)胞壓力或疾病方面具有關(guān)鍵作用[9]。Mohandas 等[10]研究指出，同卵雙胞胎之間腦癱患病率的差異可能與DNA 甲基化改變有關(guān)，通過(guò)研究共鑒定出190 個(gè)差異甲基化基因，其中腦癱組37 個(gè)基因高甲基化，其余153 個(gè)基因低甲基化。另一項(xiàng)研究檢測(cè)了同卵雙胞胎新生兒期血液中的DNA 甲基化，發(fā)現(xiàn)與腦癱有關(guān)的多個(gè)基因胞嘧啶的CpG 位點(diǎn)有甲基化變化。差異甲基化的關(guān)鍵CpG 位點(diǎn)是HNRNPL、RASSF5、CD3D 和KALRN。Bahado-Singh 等[11]為評(píng)估腦癱兒童血液樣本中的DNA 甲基化，以及研究潛在的表觀遺傳生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)腦癱，進(jìn)行了全基因組DNA 甲基化分析，使用人工智能平臺(tái)分析了23 名腦癱病例和21 名正常兒童的新生兒期血液DNA 甲基化情況，發(fā)現(xiàn)258個(gè)基因中有230 個(gè)顯著差異的甲基CpG 位點(diǎn)，對(duì)新生兒腦癱的預(yù)測(cè)具有95% 的敏感性和94.4% 的特異性。說(shuō)明使用人工智能平臺(tái)技術(shù)分析血液表觀遺傳變化似乎可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腦癱，缺點(diǎn)是樣本量不足?，F(xiàn)階段，有關(guān)DNA 甲基化的研究仍有局限性，如難以獲得早期血液樣本、樣本來(lái)源者的年齡較大、樣本量較小，以及一些研究的重點(diǎn)是痙攣型腦癱等。未來(lái)的研究目標(biāo)之一是開(kāi)發(fā)系統(tǒng)的方法和數(shù)學(xué)模型，在出生時(shí)篩選受試者。此外，需要對(duì)更廣泛的腦癱分型以及來(lái)自其他神經(jīng)運(yùn)動(dòng)和發(fā)育狀況受試者的樣本進(jìn)行分析。

1.3 miRNAs

microRNAs（miRNAs）是 一 種 微 小 的 內(nèi) 源 性非編碼調(diào)控RNA，其功能是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能表達(dá)中發(fā)揮重要作用。Chapman 等[12]研究miRNAs 作為腦癱的潛在生物標(biāo)志物，證實(shí)了通過(guò)檢測(cè)血漿miRNAs 譜預(yù)測(cè)腦癱兒童的可能性和潛力。Li 等[13]對(duì)腦癱兒童進(jìn)行血漿miRNAs 檢測(cè)，通過(guò)qRT-PCR 確定miR-124 的表達(dá)，并用熒光素酶試驗(yàn)和Western 印跡法來(lái)確認(rèn)miR-124 對(duì)靶基因的調(diào)控，結(jié)果表明，成熟miR-124 的表達(dá)水平在體外被C-T 變異下調(diào)了，并且C-T 變異導(dǎo)致的miR-124 減少使得靶基因ITGB1、LAMC1 和BECN1 的抑制效率降低，而這些基因可能在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，miR-124 表達(dá)的減少也與氧化應(yīng)激下細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子的核轉(zhuǎn)位增加有關(guān)，從而誘發(fā)更多的細(xì)胞凋亡。最終結(jié)果表明，pri-miR-124-1 的一個(gè)功能多態(tài)性可能通過(guò)干擾miR-124 的產(chǎn)生而導(dǎo)致兒童腦癱的遺傳易感性，進(jìn)而干擾miR-124 靶基因的表達(dá)和功能。相關(guān)研究證明了miRNA 編碼區(qū)的核苷酸變異與兒童腦癱易感性之間的關(guān)系，顯示出miRNAs 作為生物標(biāo)志物在預(yù)測(cè)腦癱方面的潛力。在過(guò)去的幾年中，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)于miRNAs 在大腦中的作用發(fā)表了大量的研究，作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miRNAs 在大腦發(fā)育過(guò)程中無(wú)疑扮演著至關(guān)重要的角色，然而界定它們對(duì)發(fā)育和受傷大腦影響的研究仍處于初級(jí)階段。鑒于特定的miRNAs 在發(fā)育過(guò)程中可以表現(xiàn)出不同的功能作用，并且可以發(fā)揮協(xié)同作用，因此很難確定它們的精確功能和作用，這是在考慮將特定的miRNAs 作為生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)腦癱時(shí)需要注意的問(wèn)題。

1.4 營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路NTRK2（trkB）和FGFR1 的轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄分析能幫助我們了解細(xì)胞或生物體基因組的功能，同時(shí)揭示細(xì)胞或組織的分子成分，用于了解兒童發(fā)育和疾病。轉(zhuǎn)錄組由基因組產(chǎn)生的一整套R(shí)NA轉(zhuǎn)錄本組成，這使我們能夠?qū)⑵渑c功能蛋白質(zhì)的表達(dá)聯(lián)系起來(lái)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)現(xiàn)已被用于研究廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，調(diào)查疾病的病因生理學(xué)和潛在的生物標(biāo)志物，包括阿爾茨海默氏病、孤獨(dú)癥譜系障礙和腦癱[14]等。目前，關(guān)于轉(zhuǎn)錄組與腦癱的研究還較少。Van 等[14]對(duì)182 名腦癱兒童的大規(guī)模分析發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄失調(diào)是腦癱的主要擾動(dòng)之一，特別強(qiáng)調(diào)NTRK2（trkB）和FGFR1 的下調(diào)。他們將這些與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)通路以及炎癥標(biāo)志物的上調(diào)聯(lián)系起來(lái)，認(rèn)為這是導(dǎo)致腦癱中神經(jīng)元保護(hù)能力下降的原因。同時(shí)有另一種解釋是，營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路的下調(diào)可能是由子宮內(nèi)或產(chǎn)后早期的慢性壓力造成的。識(shí)別這種分子異常的環(huán)境和遺傳觸發(fā)因素，將是理解腦癱和其他神經(jīng)發(fā)育障礙的病因以及預(yù)測(cè)那些風(fēng)險(xiǎn)更大疾病的重要一步。但這項(xiàng)研究存在一定的局限性，其使用的細(xì)胞系來(lái)自外周血，不能像在大腦中觀察到的那樣概括所有的變化，但仍能為腦癱潛在的神經(jīng)化學(xué)研究提供寶貴的見(jiàn)解。通過(guò)對(duì)腦癱的轉(zhuǎn)錄變化進(jìn)行了大規(guī)模的分析研究，證明了臨床不同腦癱中存在趨同分子異常，為未來(lái)基因組和功能分析中進(jìn)一步研究基因的優(yōu)先排序提供了基礎(chǔ)。

1.5 白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）

當(dāng)感染引發(fā)下游代謝途徑時(shí)，會(huì)釋放各種炎癥生物標(biāo)志物，如細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素（IL）和其他分子。炎癥過(guò)程的生物標(biāo)志物與有害的神經(jīng)學(xué)結(jié)果有關(guān)，如孤獨(dú)癥譜系障礙和神經(jīng)發(fā)育障礙[15]。研究表明，炎癥生物標(biāo)志物與腦癱的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)。在小鼠模型中，當(dāng)胎兒暴露在細(xì)菌內(nèi)毒素中導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)時(shí)，其對(duì)缺氧損傷的易感性增加[16]。據(jù)報(bào)道，母親的宮內(nèi)炎癥與嬰兒的腦癱風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[17]。Gomez 等[18]測(cè)量了早產(chǎn)或胎膜早破新生兒胎兒時(shí)期羊水和血漿中IL-6 的濃度，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)嚴(yán)重新生兒疾病的新生兒（包括腦癱前兆室周白斑）其胎兒時(shí)期血漿IL-6 的濃度高于未出現(xiàn)嚴(yán)重新生兒疾病的新生兒。有學(xué)者研究證實(shí)，IL-6、IL-8 水平升高和組織學(xué)胃底炎的證據(jù)與3歲時(shí)發(fā)生腦癱的概率增加呈獨(dú)立相關(guān)。這項(xiàng)研究表明，由于羊膜腔內(nèi)感染而出現(xiàn)的胎兒全身炎癥與腦癱有很強(qiáng)的相關(guān)性。據(jù)報(bào)道，患有新生兒腦病的嬰兒腦脊液和血漿細(xì)胞因子水平升高[19]，包括那些后來(lái)出現(xiàn)神經(jīng)預(yù)后不良的嬰兒。進(jìn)一步的研究顯示，在圍產(chǎn)期窒息或新生兒腦病的嬰兒中發(fā)現(xiàn)臍帶血IL-6 水平升高[20]。與此相反，早產(chǎn)兒臍帶血IL-8、IL-1β 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平與腦癱患兒的預(yù)后沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)[21]。此外，腦癱風(fēng)險(xiǎn)或長(zhǎng)期神經(jīng)發(fā)育結(jié)果不良與臍帶血中中樞神經(jīng)特異性蛋白（S100β）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶的濃度沒(méi)有顯著相關(guān)性[22]。最近的一項(xiàng)系統(tǒng)綜述提出了腦癱兒童的神經(jīng)發(fā)育結(jié)果與全血、血漿、血清、腦脊液或尿液中的炎癥生物標(biāo)志物之間的關(guān)聯(lián)證據(jù)[23]。大多數(shù)研究報(bào)告了最初幾年的神經(jīng)系統(tǒng)損傷與外周炎癥之間的關(guān)系。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常與較高的細(xì)胞因子循環(huán)水平有關(guān)，包括IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α[24]，增加了腦癱的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。極端早產(chǎn)兒產(chǎn)后2 周內(nèi)TNF-α、TNF-α 受體-1、IL-8 和細(xì)胞間黏附分子-1 的反復(fù)升高也與腦癱發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)[25]。此外，內(nèi)源性紅細(xì)胞生成素也與極端早產(chǎn)兒腦癱的發(fā)生有關(guān)[26]。在兒童出生時(shí)通過(guò)檢測(cè)血液、尿液或腦脊液中的炎癥生物標(biāo)志物，可能有助于早期診斷和干預(yù)腦癱。目前，生物標(biāo)志物檢測(cè)被認(rèn)為是準(zhǔn)確及早期診斷腦癱的關(guān)鍵，但仍缺乏能夠一致識(shí)別腦癱兒童的生物標(biāo)志物，故現(xiàn)階段對(duì)于生物標(biāo)志物的尋找還在進(jìn)行中。

1.6 代謝組學(xué)生物標(biāo)志物

代謝組學(xué)的研究重點(diǎn)是生物系統(tǒng)中的代謝途徑，重點(diǎn)是代謝物[27]。由于腦癱發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，目前文獻(xiàn)中關(guān)于腦癱代謝標(biāo)志物的研究資料較少。通常研究對(duì)象為圍產(chǎn)期窒息和缺氧缺血性腦?。╤ypoxicischemic encephalopathy，HIE）新生兒，以確定反應(yīng)預(yù)后的生物標(biāo)志物。一維核磁共振波譜成像顯示，與對(duì)照組相比，圍產(chǎn)期窒息和HIE 嬰兒臍血中與能量相關(guān)的代謝物發(fā)生了顯著變化[28]。嚴(yán)重HIE 病例的代謝物中琥珀酸和甘油增加，酮類(lèi)、丙酮和3- 羥基丁酸減少。酮類(lèi)的減少和琥珀酸的增加可能意味著新生兒能量的不斷消耗和向無(wú)氧代謝的轉(zhuǎn)變。高危新生兒臍帶血的代謝組分析顯示，與對(duì)照組新生兒相比，高危新生兒臍帶血中膽堿、脯氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、葡萄糖的水平較低，苯丙氨酸和瓜氨酸的水平較高[29]。同樣，在低出生體重的新生兒中，通過(guò)檢測(cè)臍帶血中苯丙氨酸和色氨酸等必需氨基酸的水平能夠準(zhǔn)確區(qū)分胎兒生長(zhǎng)受限和正常生長(zhǎng)的胎兒[30]。HIE 的病理生理機(jī)制是多因素且十分復(fù)雜的，代謝組學(xué)是對(duì)代謝物的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，提供了其相互作用的證據(jù)。由于缺氧會(huì)抑制有氧能量代謝，而有氧能量代謝是全身代謝的核心，因此代謝組學(xué)為發(fā)現(xiàn)HIE 的生物標(biāo)志物和疾病的發(fā)病機(jī)制提供了強(qiáng)大的系統(tǒng)生物學(xué)方法。近些年的幾項(xiàng)研究已經(jīng)使用代謝組學(xué)來(lái)評(píng)估動(dòng)物模型的圍產(chǎn)期窒息，但缺乏將代謝圖譜與圍產(chǎn)期窒息和HIE 的分子病理學(xué)知識(shí)結(jié)合起來(lái)的人體研究。當(dāng)前，對(duì)代謝組學(xué)生物標(biāo)志物的研究有助于進(jìn)一步深入了解腦癱的復(fù)雜病理生理學(xué)，同時(shí)確定腦癱的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。

2 小結(jié)

腦癱是我國(guó)兒童肢體殘疾的主要致病因素之一。大量研究已經(jīng)表明通過(guò)早期干預(yù)及治療能夠改善腦癱兒童及腦癱高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)兒童的預(yù)后，因此腦癱的早期診斷和干預(yù)至關(guān)重要。生物標(biāo)志物檢測(cè)是臨床診斷早期腦癱的方法之一，但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)生物標(biāo)志物的研究較少，尤其是腦癱領(lǐng)域用于早期預(yù)測(cè)/ 診斷的生物標(biāo)志物仍有待研究和明確。在國(guó)外，關(guān)于腦癱生物標(biāo)志物的研究逐漸成為熱點(diǎn)，陸續(xù)有相關(guān)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。但現(xiàn)在由于研究尚在試驗(yàn)進(jìn)展階段，同時(shí)缺乏大樣本量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以及臨床手段的局限等，目前可用于臨床實(shí)踐的生物標(biāo)志物很少。隨著對(duì)腦癱和相關(guān)生物標(biāo)志物的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，相信未來(lái)會(huì)出現(xiàn)更多、更大樣本量的試驗(yàn)，使腦癱生物標(biāo)志物真正應(yīng)用于臨床。本文總結(jié)了目前已有的關(guān)于腦癱生物標(biāo)志物的知識(shí)和文獻(xiàn)，希望未來(lái)在研究人員的持續(xù)努力下，我們能對(duì)這種復(fù)雜的疾病有更多的了解，給予腦癱兒童及腦癱高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)兒童早期診斷和干預(yù)，充分利用生物標(biāo)志物的作用，使患兒獲得更好的預(yù)后，為患兒、患兒家庭乃至社會(huì)帶去更多的福音。