錢思昊，潘齊超，張亞瓊，何 勇，朱 波

(1.東華大學材料科學與工程學院 纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620)

(2.上海大學材料科學與工程學院，上海 200444)

1 前 言

生物電子器件在組織工程領域以及生物醫(yī)學領域具有非常重要的作用，目前已被廣泛應用于醫(yī)學治療[1-3]，如起搏器、人工耳蝸、針對神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)退行性疾病的深部腦刺激，以及限制自身免疫疾病炎癥反應的迷走神經(jīng)刺激[4]。然而，目前生物電子器件一般工作在生物流體等復雜的生理環(huán)境中，生物分子/細胞會非特異性地吸附在器件表面。生物材料的非特異性蛋白吸附已被證實是引發(fā)炎癥的主要因素之一，并導致了細菌的粘附和增殖，極大地影響了其長期穩(wěn)定性[5，6]。對于生物電子器件來說，器件表面的絕緣封裝部分的面積遠遠大于電極點的面積，因此絕緣封裝材料對生物電子器件的組織相容性起著舉足輕重的作用。傳統(tǒng)的電絕緣材料常采用無機絕緣材料，如硅、硼和多種金屬氧化物[7]，雖然這類材料具有耐高溫、電極性能穩(wěn)定等優(yōu)點，但是其耐沖擊性能差、抗張強度低。而且此類材料質地較硬，往往會導致應力集中、錯位，并引發(fā)強烈的炎癥反應或者組織破壞。因此，柔性的絕緣封裝材料更有利于提高器件的生物相容性及長期穩(wěn)定性。

聚對二甲苯(Parylene)具有優(yōu)異的生物相容性和柔性，彈性模量比金和硅低2～3個數(shù)量級，能顯著改善應力集中并降低組織的損傷，因此成為使用最廣泛的生物絕緣材料之一[8，9]。Parylene薄膜可通過化學氣相沉積(chemical vapor deposition，CVD)的方法制備，制備的薄膜厚度均勻可控、透明致密、無微孔缺陷且不產(chǎn)生死角，可均勻涂敷于任意復雜形狀表面。然而，由于Parylene不具備抗細胞/蛋白粘附性能，該材料封裝的生物電極在長期植入后仍然會導致強烈的組織炎癥反應[10]。為改善Parylene的生物相容性，氨基葡聚糖、多肽、蛋白等[11]被用于Parylene的表面修飾。此外，為了克服絕緣材料非特異性相互作用，有研究者使用聚乙二醇對Parylene進行修飾，使得Parylene具有優(yōu)異的親水性，由此可以抵抗非特異性細胞/蛋白粘附，顯著減弱組織炎癥反應[12]。但是聚乙二醇遇氧氣或過渡金屬離子時會分解，在生理溫度下失去蛋白排斥作用，難以實現(xiàn)長期穩(wěn)定的抗炎癥效果[13]。兩性離子基團——磷酸膽堿(PC)、磺酸甜菜堿(SB)、羧酸甜菜堿(CB)，由于具有優(yōu)異的抗蛋白/細胞粘附性能且在生理環(huán)境下性能穩(wěn)定，在生物醫(yī)藥領域具有廣泛的應用前景。已有大量研究表明，兩性離子具有良好的組織相容性[14]，并且相比于聚乙二醇，具有更低的細胞毒性以及更好的抗非特異性細胞/蛋白粘附特性[15-17]。

本文在Parylene表面通過原位引發(fā)生長兩性離子分子鏈，以實現(xiàn)抗非特異性蛋白/細胞粘附，有望提高植入器件在復雜生物環(huán)境中的使用壽命。兩性離子基團通過原子轉移自由基聚合(atom transfer radical polymerization，ATRP)接枝在Parylene表面。分別采用聚甲基丙烯酸甲酯磷酸膽堿(PMPC)、聚甲基丙烯酸甲酯磺酸甜菜堿(PMSB)、聚甲基丙烯酸甲酯羧酸甜菜堿(PMCB)對Parylene進行修飾，并對比研究了3種兩性離子修飾的Parylene表面的潤濕性、抗非特異性蛋白/細胞粘附性能。此外，將兩性離子修飾的Parylene和未修飾的Parylene相結合制備圖案化的生物界面，用于空間上調控細胞的粘附行為。

2 實 驗

2.1 實驗試劑

[2,2]對環(huán)芳烷-4-甲基2-溴異丁酯參考文獻[18]進行合成。二聚對二甲苯、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(MPC)于國藥集團化學試劑有限公司購買；三(2-吡啶基甲基)胺(TPMA)于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司購買；3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基銨]丙酸酯(MCB)、溴化亞銅(CuBr)、溴化銅(CuBr2)于薩恩化學技術(上海)有限公司購買；[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氫氧化銨(MSB)、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、纖維蛋白原(FNG)、新生牛血清、谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸鈉于西格瑪?shù)吕锲?上海)貿易有限公司購買；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基、Tryspin/EDTA于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司購買；新生牛血清于浙江天杭生物科技股份有限公司購買；大鼠小膠質細胞系(HAPI cell line)于MerckMillipore購買；小鼠胚胎成纖維細胞(NIH 3T3 cell line)、大鼠腎上腺嗜鉻細胞(PC12 cell line)由中國科學生命院干細胞庫提供；光刻膠S1813、顯影劑ZX238、去膠劑N-甲基吡咯烷酮于蘇州研材微納有限公司購買。

2.2 Parylene及Parylene-Br的制備

Parylene及Parylene-Br均通過CVD法制備。本實驗中CVD實驗均使用自制的CVD裝置，包括升華倉、高溫裂解倉和低溫沉積倉。

Parylene樣品制備過程為：將玻璃片/石英芯片置于低溫沉積倉，5 g二聚對二甲苯粉末置于升華倉內，升華倉溫度控制在90～200 ℃，高溫裂解倉溫度控制在670 ℃左右，低溫沉積倉溫度保持在25 ℃，真空壓力保持在10 Pa以下。Parylene-Br樣品制備過程為：將樣品置于低溫沉積倉，500 mg [2,2]對環(huán)芳烷-4-甲基2-溴異丁酯粉末置于升華倉內，升華倉溫度控制在90～200 ℃，高溫裂解倉溫度控制在550 ℃左右，低溫沉積倉溫度保持在25 ℃，真空壓力保持在10 Pa以下。

2.3 原子轉移自由基聚合反應

反應前準備反應溶劑——二甲基亞礬和超純水混合溶劑(體積比為1∶1)，通入氮氣鼓泡除氧2 h。后續(xù)實驗在手套箱內完成。使用已準備好的反應溶劑配置濃度為2.5 mmol/L CuBr、2.5 mmol/L CuBr2、10 mmol/L TPMA、665 mmol/L MPC(或者MSB、MCB)的混合溶液。將沉積有Parylene-Br的樣品置于反應試管，加入反應溶液并密封，放入搖床中進行振蕩，反應溫度為50 ℃。反應結束后，采用去離子水沖洗反應產(chǎn)物，并吹干待用。

2.4 石英晶體微天平測試

石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)測試實驗用于原位模擬樣品表面與生物分子的相互作用，實驗通過QCM-D(Analyzer，瑞典Biolin)進行測試。在QSX301金芯片(瑞典Biolin)表面沉積Parylene及Parylene-Br，并通過ATRP反應在其上修飾兩性離子基團。所有待測樣品置于樣品槽內，使用蠕動泵(Ismatec ISM935C)將測試所用的磷酸緩沖液(PBS，pH=7.2)或蛋白溶液流入樣品槽?？刂屏魉贋?0 μL/min，測試溫度為25 ℃。先流動PBS溶液，使得基線穩(wěn)定，再開展具體的實驗。流10 min PBS緩沖液(得到基線過程)，40 min蛋白溶液(與蛋白作用過程)，30 min PBS緩沖液(沖洗過程)。當溶液流入QCM腔室之后，溶液中的蛋白與QCM芯片表面材料相互作用會引起傳感器共振頻率的變化(Δf)，若表面粘附蛋白會引起頻率下降。QCM的基準頻率為5 MHz，存在7種諧頻(15，25，35，45，55和65 MHz)，本實驗均選擇3階諧頻(15 MHz)。本實驗利用QCM探索Parylene及修飾的Parylene與蛋白的作用。

2.5 薄膜表面性能測試

薄膜表面接觸角實驗采用光學接觸角測量儀(Theta Flex，瑞典Biolin)測試，測試溶液為超純水，液滴大小為3 μL，滴速為2 μL/s。

X射線光電子能譜(XPS，Thermo Scientific Al K Alpha XPS)用于分析沉積在電極表面的元素：碳元素(C 1s)、氧元素(O 1s)、硫元素(S 2p、S 2s)、氮元素(N 1s)、磷元素(P 2p、P 2s)、溴元素(Br 3p、Br 3d)、氯元素(Cl 2s、Cl 2p)。

功能化Parylene及Parylene表面模量采用原子力顯微鏡(AFM，Bruker Multimode 8)DMT modulus表征，AFM的掃描尺寸為1 μm×1 μm。

2.6 細胞培養(yǎng)

NIH 3T3細胞所用培養(yǎng)基成分為：87% DMEM高糖培養(yǎng)基、10%新生牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉。HAPI細胞所用培養(yǎng)基成分為：95% DMEM低糖培養(yǎng)基、5% FBS。NIH 3T3細胞和HAPI細胞均在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。細胞直接種植在樣品表面，種植密度為105個/mL，細胞培養(yǎng)時間分別為1，2和4 d，采用顯微鏡進行拍照觀察(Olympus CKX53)。

2.7 圖案化生物界面構建

圖案化Parylene生物界面的制備路線如圖1所示，在玻璃表面通過CVD法沉積一層Parylene薄膜；在Parylene表面旋涂光刻膠S1813，旋轉速度為3500 r/min，旋涂60 s，并在115 ℃下熱烘60 s；采用紫外光刻技術將帶有圖案的掩模版置于樣品上進行光刻，紫外光波長為365 nm，曝光時間為2 s，未曝光的區(qū)域采用顯影劑ZX238洗去；采用CVD法在制備好的圖案上沉積一層Parylene-Br，并用N-甲基吡咯烷酮去除殘余光刻膠；最后通過ATRP，在Parylene-Br上接枝兩性離子聚合物分子鏈。

圖1 圖案化Parylene生物界面的制備路線

3 結果與分析

3.1 兩性離子修飾Parylene薄膜表面性能

為制備抗非特異性粘附的Parylene薄膜，首先在Parylene表面沉積一層Parylene-Br，隨后通過ATRP反應，將兩性離子基團成功修飾在Parylene上，如圖2所示。兩性離子基團具有較強的親水性能，其表面會形成一層致密的水膜，從而能夠抵擋細胞、蛋白等的粘附[19]。目前用于抗非特異性粘附最為廣泛的兩性離子主要分為3種，即磷酸膽堿(PC)，磺酸甜菜堿(SB)，羧酸甜菜堿(CB)。因此在Parylene表面分別修飾PC、SB、CB這3種兩性離子基團(圖3)。

圖2 兩性離子修飾Parylene的制備路線示意圖

圖3 3種兩性離子修飾Parylene的結構示意圖

對3種兩性離子修飾的Parylene進行對比研究。通過分析XPS能譜(圖4)，可知已成功制備了3種兩性離子基團修飾的Parylene薄膜。由于Parylene和及兩性離子修飾的Parylene中均含有碳原子和氧原子，因此在XPS譜上可以觀察到氧元素(O 1s：532.0 eV)和碳元素(C 1s：285.0 eV)的信號峰。由于選用的基底Parylene為Parylene C，其中含有氯原子，因此可在XPS譜圖中觀察到氯元素特征電子信號峰(Cl 2s：271.0 eV；Cl 2p：200.0 eV)。3種兩性離子修飾的Parylene均含還有氮元素(N 1s)，其信號峰位置在402.0 eV。PMPC-Parylene特征的磷元素(P 2p)電子信號峰出現(xiàn)在133.0 eV，PMSB-Parylene特征的硫元素S 2s電子信號峰出現(xiàn)在231.0 eV，S 2p電子信號峰出現(xiàn)在167.0 eV。

圖4 Parylene、PMPC-Parylene、PMSB-Parylene及PMCB-Parylene的XPS譜圖

原始Parylene膜的接觸角能達到91.3°。而由于PC、SB和CB修飾的Parylene表面水化強度大，具有超親水性能，所以Parylene表面修飾此3種兩性離子后呈現(xiàn)出超親水性，接觸角均在10°左右。如圖5所示，PMPC-Parylene接觸角為10.0°，PMSB-Parylene接觸角為12.6°，PMCB-Parylene表面接觸角最小，為8.7°。

圖5 Parylene、PMPC-Parylene、PMSB-Parylene、PMCB-Parylene薄膜表面的水接觸角

3.2 兩性離子修飾Parylene薄膜抗非特異性粘附

生物電子器件在復雜的生物環(huán)境中，其表面會被生物分子/細胞包覆，造成生物組織的損傷以及器件的失效[20]。而兩性離子修飾的Parylene表面存在離子相互作用，使得其表面產(chǎn)生的水化層更加致密和穩(wěn)定[17]，從而賦予薄膜優(yōu)異的抗蛋白/細胞粘附的性能。為了評估3種兩性離子修飾的Parylene薄膜(PMPC-Parylene、PMSB-Parylene、PMCB-Parylene)對蛋白的粘附性能，使用BSA、FNG和FBS 3種蛋白作為粘附測試模型。其中BSA作為單一蛋白模型來初步評價薄膜的抗非特異性粘附。FNG是一種大蛋白質(Mw=340 kDa)模型，具有較強的吸附能力[21]。FBS用來提供一個相對更加復雜的非特異性粘附環(huán)境，其中包含血紅蛋白和白蛋白等多種蛋白、葡萄糖、多種生長因子等，可用于體外模擬電子器件的使用環(huán)境。由圖6可知，相比于Parylene薄膜，3種蛋白流經(jīng)QCM腔室時，兩性離子修飾的Parylene薄膜的頻率基本無變化，即經(jīng)過修飾的Parylene薄膜具有優(yōu)異的抗蛋白粘附效果。

圖6 PMPC-Parylene、PMSB-Parylene、PMCB-Parylene和Parylene對各類蛋白的粘附情況：(a)BSA，(b)FNG，(c)FBS

為進一步驗證PC、SB和CB基團修飾的Parylene對細胞的粘附情況，選用NIH 3T3和HAPI細胞作為細胞模型進行體外測試。NIH 3T3細胞是一種常用的細胞相容性驗證模型。HAPI細胞是一種典型的炎癥細胞模型，它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要免疫細胞。為方便作對比，制備了修飾/未修飾交替存在的Parylene薄膜。圖7結果表明，與未修飾的Parylene薄膜相比，兩性離子修飾過的PMPC-Parylene、PMSB-Parylene和PMCB-Parylene薄膜對NIH3T3和HAPI細胞都具有比較優(yōu)異的抗粘附性能。其中PMPC-Parylene薄膜相對另外2種兩性離子修飾的Parylene薄膜具有更為優(yōu)異的抗炎癥細胞HAPI粘附性能。

圖7 NIH3T3細胞以及HAPI細胞在Parylene及抗非特異性粘附Parylene表面培養(yǎng)48 h的照片

兩性離子主要是依靠靜電力的作用與水在薄膜表面形成致密的水合層[17]。與兩性離子結合的水，其自由能較低[22]、遷移率低且無取向分布[23]。低的水分子遷移及無取向分布使兩性離子修飾的表面存在對蛋白/細胞的高度排斥力。然而，相比于PMPC-Paryene，PMSB-Parylene和PMCB-Parylene的抗非特異性粘附性能略遜一籌。這可歸因于SB中的陰離子和氧離子電荷不平衡。SB基團中陽離子電荷為3.0 e/nm3，陰離子電荷為-4.5 e/nm3，因此其自締合減弱[24]，結構易受溶液中鹽濃度的影響[25]，從而導致PMSB-Parylene抗粘附性能減弱。而CB雖然不存在自締合減弱的現(xiàn)象，但是它易受溶液pH值的影響。CB中的羧基在弱酸性條件下會發(fā)生質子化，因此CB保持兩性離子狀態(tài)的條件比較苛刻，從而減弱了PMCB-Parylene的抗粘附性能[26]。與SB和CB不同，PC中陰陽離子電荷是平衡的，且PC結構高度規(guī)整，能夠在不同濃度的鹽溶液中保持穩(wěn)定的結構[25]。因此相比于其他功能化的Parylene，PMPC-Parylene具有最佳的抗非特異性粘附性能。

3.3 圖案化細胞培養(yǎng)

目前植入式生物電子器件趨于小型化、微型化，因此在微型化線路中實現(xiàn)對細胞特定位置的粘附，是研究細胞其他行為的基礎[27]。通過CVD法結合光刻技術及ATRP在玻璃片表面沉積Parylene及兩性離子修飾的Parylene作為細胞粘附/排斥薄膜材料，用于研究細胞的粘附行為。由于兩性離子對細胞具有強烈的排斥作用，能夠在空間上限制細胞的粘附，因此制備不同條形化圖案用于研究圖案尺寸對細胞的粘附行為的影響。細胞粘附層材料為Parylene，條紋寬度為200/100/50/20/2 μm，細胞排斥層材料為PMPC-Parylene，條紋寬度對應為200/200/100/40/200 μm。

選用PC 12細胞作為神經(jīng)細胞模型，研究該細胞在修飾和未修飾的Parylene上的粘附情況，為未來進一步展開植入式神經(jīng)電極和體內研究工作奠定基礎。

如圖8所示，當PC12細胞接種于PMPC-Parylene以及未經(jīng)修飾的Parylene表面時，細胞傾向于粘附在未經(jīng)修飾的Parylene上。隨著未修飾Parylene條帶的寬度由200減小到2 μm，即PMPC-Parylene部位的寬度發(fā)生改變時，細胞粘附區(qū)域也隨之發(fā)生相應的變化(圖8a～8e)。PC12細胞只粘附在未經(jīng)過修飾的Parylene區(qū)域，此結果說明兩性離子修飾的Parylene對細胞具有非常強烈的排斥作用，該圖案設計能很好地限制細胞在空間上的粘附。

圖8 空間上限制PC12細胞粘附行為的圖案化Parylene/PMPC-Parylene薄膜，細胞粘附層材料為Parylene，條紋寬度從圖8a～8e為200/100/50/20/2 μm，細胞排斥層材料為PMPC-Parylene，條紋寬度從圖8a～8e為200/200/100/40/200 μm

4 結 論

本文通過原子轉移自由基聚合在Parylene表面分別修飾聚甲基丙烯酸甲酯磷酸膽堿(PMPC)、聚甲基丙烯酸甲酯磺酸甜菜堿(PMSB)、聚甲基丙烯酸甲酯羧酸甜菜堿(PMCB)。發(fā)現(xiàn)這3種兩性離子修飾的Parylene表面的潤濕性能和抗蛋白粘附性能并無顯著差別。但是PMPC-Parylene薄膜的抗炎癥細胞粘附能力明顯優(yōu)于PMSB-Parylene及PMCB-Parylene薄膜。因此，PMPC修飾的Parylene和未修飾的Parylene結合制備圖案化的生物界面，更有希望應用于在空間上調控神經(jīng)細胞的生長。