孫悅，趙宏晶，黃義棚，袁春營，崔青曼

（天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，是中國養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟甲殼動物之一。稻田養(yǎng)蟹是以種植水稻以及養(yǎng)殖河蟹為目標，充分利用自然資源，挖掘稻田的生產(chǎn)潛力，實現(xiàn)稻蟹產(chǎn)量的雙增收[1]。水稻種植過程中會使用一些農(nóng)藥，而對共生的中華絨螯蟹產(chǎn)生一定的影響。農(nóng)藥不僅破壞水體生態(tài)環(huán)境，還會影響水生生物的個體發(fā)育和繁殖，導(dǎo)致水生生物組織病理學(xué)的改變、脂質(zhì)過氧化損傷和相關(guān)抗氧化酶活性改變等一系列生理變化，嚴重的還會致其死亡[2-7]。

新煙堿類殺蟲劑是世界上使用最廣泛的殺蟲劑之一。它們對昆蟲具有優(yōu)先毒性，而對脊椎動物卻低毒性[8]。噻蟲嗪是一種全新結(jié)構(gòu)的第二代煙堿類高效低毒殺蟲劑，具有獨特的作用機制和觸殺、胃毒和內(nèi)吸活性，適用于葉面、顆粒和種子的處理應(yīng)用[9]。Minakshi 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪對雙殼貝類的24 h、48 h、72 h 和96 h 的半致死濃度（LC50）分別為91.83 mg/L、61.91 mg/L、38.46 mg/L 和25.79 mg/L。在急性作用下，隨暴露時間的延長，雙殼貝類的氧耗率降低。這是由于沉積在呼吸表面的高黏液分泌干擾氧的擴散速率，減少氧的消耗，與急性作用相比，慢性作用下的耗氧率下降幅度較大[11]，表明噻蟲嗪可能會損害淡水動物的氧化代謝。陳姣姣等[12]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪對中華蟾蜍（Bufo gargarizans）蝌蚪為低毒性，暴露于噻蟲嗪96 h 后，中華蟾蜍蝌蚪的總超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性逐漸降低，丙二醛（MDA）含量明顯升高，說明噻蟲嗪會毒害中華蟾蜍蝌蚪的抗氧化防御系統(tǒng)。王召等[13]研究表明，噻蟲嗪對鯽（Carassius auratus）幼魚96 h 的LC50為28.95 mg/L。暴露于1 mg/L 和10 mg/L 噻蟲嗪中96 h 后，鯽幼魚肝胰腺和鰓組織中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性呈先上升后下降的趨勢，表明噻蟲嗪可導(dǎo)致鯽幼魚抗氧化防御系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂，影響鯽的正常發(fā)育。陳愛梅[14]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪能夠造成斑馬魚（Danio rerio）脂質(zhì)過氧化，損傷肝臟細胞的DNA，并且隨時間和濃度增加，DNA 損傷程度增大。在稻田養(yǎng)蟹中，每平方米一般使用噻蟲嗪1.10～1.64 μg/L，但很少有關(guān)于噻蟲嗪對中華絨螯蟹影響的報道。為此，本研究采用半靜態(tài)毒性試驗法，探討了噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細胞數(shù)量、肝胰腺、血淋巴和鰓免疫代謝指標及相關(guān)基因表達的影響，初步闡釋噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹的亞急性毒性效應(yīng)機理，為噻蟲嗪在稻田養(yǎng)蟹上的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

共采用中華絨螯蟹幼蟹樣本480 只，平均殼長為（2.78±0.23）cm，平均體質(zhì)量為（8.28±1.27）g，其他生物數(shù)據(jù)見表1，購自天津蟹源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。

表1 不同濃度組中華絨螯蟹幼蟹的生物學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Biological data of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis in different concentration groups

TRIzolTMReagent 試劑盒、M-MLV、Random Primer，Invitrogen Corporation；Oligo dT、DTT、RNA 酶抑制劑、dNTPs 混合溶液、氯仿及乙醇購自北京索萊寶科技有限公司；異丙醇購自天津基準化學(xué)試劑有限公司；噻蟲嗪（Thiamethoxam）購自上海源葉生物科技有限公司。

熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司；MIKRO 200R 離心機，德國Hettich 科學(xué)儀器公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；全自動酶標儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計

設(shè)置噻蟲嗪濃度分別為0 μg/L、90 μg/L、180 μg/L、360 μg/L、720 μg/L 和1 440 μg/L，每組10 只河蟹，實驗前按照河蟹體質(zhì)量3%～5%投喂飼料。實驗容器為63 cm×43 cm×20 cm 的水族箱，驗用水為充分曝氣的自來水，飼養(yǎng)水溫（23±2）℃。在噻蟲嗪中暴露96 h，根據(jù)李燕華等[15]的公式法計算96 h的半致死濃度（LC50）和安全濃度（SC）：

其中xm是最大死亡組質(zhì)量濃度的對數(shù)，d 是相鄰兩組質(zhì)量濃度的對數(shù)差，p 是各組的死亡率。

在此基礎(chǔ)上，設(shè)置噻蟲嗪濃度分別為0 μg/L（對照組）、28.25 μg/L、56.5 μg/L、113 μg/L 和226 μg/L，每個實驗組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)20 只河蟹。實驗持續(xù)21 d，期間按照河蟹體質(zhì)量3%～5%投喂飼料，飼料組分見表2。實驗第0 d、1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，每個重復(fù)各取2 只河蟹，冰浴上麻醉、酒精消毒河蟹體表，用1 mL 注射器從河蟹心臟處抽取血淋巴，用解剖剪剪開河蟹外殼，取其肝胰腺和鰓組織置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 實驗飼料的組分Tab.2 Ingredient of the experimental diets（g/kg dry matter）

1.2.2 血淋巴細胞計數(shù)

從中華絨螯蟹幼蟹的心臟處抽取血淋巴與抗凝劑（每100 mL 2.05 g 葡萄糖，0.42 g 氯化鈉，0.8 g檸檬酸鈉）迅速混勻（1∶1），100 μL 血淋巴滴于血球計數(shù)板上，重復(fù)計數(shù)3 次。

1.2.3 免疫代謝相關(guān)指標測定

將每個濃度組第0 d、1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d取得的肝胰腺，與預(yù)冷的生理鹽水按照1∶9 的配比冰浴勻漿，4 000 r/min 高速冷凍離心10 min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量和酶活性。蛋白質(zhì)含量按照Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書進行測定。肝胰腺中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及血淋巴中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性按照試劑盒（南京建成生物工程研究）說明書進行測定。血淋巴中的酚氧化酶活性按照Ashida[16]方法略有修改進行測定。

1.2.4 qRT-PCR 檢測酚氧化酶（PO）和Na+-K+-ATPase 基因表達

中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺和鰓組織RNA 的提取按照Trizol 總RNA 抽提試劑盒說明書進行。β-action（內(nèi)參）、酚氧化酶（PO）和Na+-K+-ATPase 的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列見表3。qRT-PCR 反應(yīng)體系：10 μL 的SYBR Mix，0.4 μL 的50×ROX，0.5 μL 的上游引物，0.5 μL 的下游引物，7.6 μL 的雙蒸水和1 μL 的樣品cDNA 組成20 μL 的反應(yīng)體系。qRT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃下反應(yīng)30s 進行預(yù)變性；95 ℃下反應(yīng)5 s，60 ℃下反應(yīng)34 s，40 個循環(huán)；溶解曲線：95 ℃下反應(yīng)15 s，60 ℃下反應(yīng)1 min，0.5 ℃/cycles，95 ℃反應(yīng)15 s。反應(yīng)結(jié)束后，保存并整理數(shù)據(jù)，利用2-△△ct法處理數(shù)據(jù)。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

測得的數(shù)據(jù)用平均值±標準差（X±SD）表示。采用SPSS 26.0 分析和處理數(shù)據(jù)。采用LSD 法進行多重比較，GraphPadPrism 8 繪制相關(guān)柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹幼蟹的半致死濃度和安全濃度

統(tǒng)計96 h 各濃度組中河蟹的死亡數(shù)量，得出96 h 半致死濃度（LC50）為452 μg/L，安全濃度（SC）為45.2 μg/L。

2.2 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細胞數(shù)量的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻中嗪濃度的升高，河蟹血淋巴細胞數(shù)量先增加后降低；第14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹的血淋巴細胞數(shù)量顯著低于對照組（P＜0.05）。表明噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細胞的毒性效應(yīng)較大（表4）。

表4 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細胞數(shù)量的影響（×106）Tab.4 Effect of thiamethoxam on the number of lymphocytes in juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.3 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺免疫指標的影響

2.3.1 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺SOD 活性的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺SOD 活性先上升后下降；第1 d、4 d、7 d 和14 d，28.25 μg/L 噻蟲嗪組河蟹SOD 活性顯著高于對照組（P＜0.05），第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 組SOD 活性顯著低于對照組（P＜0.05）（表5）。

表5 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺SOD 活性的影響/（U·mg-1prot）Tab.5 Effect of thiamethoxam on SOD activity in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.3.2 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺MDA 含量的影響

隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺MDA 含量逐漸增加，第4 d、7 d、14 d 和21 d，56.5 μg/L、113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹肝胰腺MDA 含量顯著高于對照組（P＜0.05）；除了第0 d 外，226 μg/L噻蟲嗪組河蟹肝胰腺MDA 含量顯著高于其他三個噻蟲嗪組（P＜0.05）（表6）。

表6 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺MDA 含量的影響/（nmol·mg-1prot）Tab.6 Effect of thiamethoxam on MDA content in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.4 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴免疫指標的影響

2.4.1 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴GPT 活性的影響

隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹血淋巴GPT 活性逐漸增加，第7 d、14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L噻蟲嗪組河蟹血淋巴GPT 活性顯著高于對照組（P＜0.05）；第7 d 和14 d，226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹血淋巴GPT 活性顯著高于28.25 μg/L 和56.5 μg/L 噻蟲嗪組（P＜0.05，表7）。可見，高濃度噻蟲嗪可能破壞了中華絨螯蟹幼蟹的肝胰腺細胞結(jié)構(gòu)，致使血淋巴中GPT 活性升高。

表7 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴GPT 活性的影響/（U·L-1）Tab.7 Effect of thiamethoxam on GPT activity in hemolymph of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.4.2 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴AST 活性的影響

隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹血淋巴AST 活性逐漸增加，第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹血淋巴AST 活性顯著高于對照組（P＜0.05）；第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹血淋巴AST 活性顯著高于28.25 μg/L 噻蟲嗪組（P＜0.05，表8）。

2.4.3 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴PO 活性的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹血淋巴PO 活性先上升后下降，且以28.25 μg/L 組為最高，其中第1 d、4 d 和7 d，該組河蟹血淋巴PO 活性顯著高于對照組（P＜0.05）。第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹血淋巴PO活性顯著低于對照組（P＜0.05，表9）。

表9 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴PO 活性的影響（/U·L-1）Tab.9 Effect of thiamethoxam on PO activity in hemolymph of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.5 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺po 和Na+/K+-ATPase 基因表達的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲嗪濃度的升高，肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平先上升后下降。除第0 d 外，28.25 μg/L 噻蟲嗪組河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）；第4 d 和7 d，56.5 μg/L噻蟲嗪組河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）；第14 d 和21 d，226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平顯著低于其他四組（P＜0.05）（圖1、圖2）。

圖1 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺po 基因表達的影響Fig.1 Effect of thiamethoxam on po gene expression level in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

圖2 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺Na+/K+-ATPase 基因表達的影響Fig.2 Effect of thiamethoxam on Na +/K+-ATPase gene expression level in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.6 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 基因表達的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平先上升后下降。第1 d、4 d 和7 d，28.25 μg/L和56.5 μg/L 噻蟲嗪組河蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），第21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲嗪組河蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平顯著低于其他3 組（P＜0.05）（圖3、圖4）。

圖3 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹鰓組織po 基因表達的影響Fig.3 Effect of thiamethoxam on po gene expression level in gill of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

圖4 噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹鰓組織Na+/K+-ATPase 基因表達的影響Fig.4 Effect of thiamethoxam on Na +/K +-ATPase gene expression level in gill of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

3 討論

血細胞作為細胞免疫的一部分在甲殼動物機體免疫系統(tǒng)中處于非常關(guān)鍵的地位[17]。血細胞數(shù)量可以間接反映出動物機體的健康狀態(tài)及免疫應(yīng)激能力，因此常作為衡量甲殼類動物免疫水平的指標之一[18]。高濃度草甘膦明顯降低河蟹的血淋巴細胞數(shù)量[19]。本研究得到類似的結(jié)果，河蟹血淋巴細胞數(shù)量隨噻蟲嗪濃度的增加先上升后降低。究其原因，可能是低濃度噻蟲嗪刺激中華絨螯蟹幼蟹機體的免疫系統(tǒng)，使其血細胞數(shù)量升高以應(yīng)對應(yīng)激脅迫，而高濃度噻蟲嗪則會抑制中華絨螯蟹幼蟹的免疫功能，導(dǎo)致其血淋巴細胞數(shù)量下降。

甲殼類動物沒有特異性免疫，其先天免疫主要由酚氧化酶和抗氧化酶等多種免疫因子組成[20]，其中，SOD 參與多種生理和代謝反應(yīng)，特別是清除自由基和防止生物分子損傷機體，是抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。MDA 是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，這些指標的變化能反映機體受氧化損傷程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度噻蟲嗪能提高河蟹肝胰腺SOD 活性，高濃度噻蟲嗪則抑制河蟹肝胰腺SOD 活性，與郝文靜[22]的結(jié)果相一致。這可能是低濃度噻蟲嗪脅迫能夠提高中華絨螯蟹的防御能力，大量產(chǎn)生SOD 以清除超氧物陰離子自由基，而高濃度噻蟲嗪脅迫下或暴露時間的延長，過量的自由基不能被及時分解，反過來會抑制SOD 的活性[23]。MDA 的含量可反映脂質(zhì)的過氧化程度[24]。本研究中，隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺MDA 含量逐漸增大，呈現(xiàn)出較好的濃度效應(yīng)關(guān)系。中華絨螯蟹幼蟹受阿維菌素[22]和苯噻酰草胺[6]脅迫時，肝胰腺MDA 含量變化與本結(jié)果相似。28.25 μg/L 噻蟲嗪組河蟹肝胰腺MDA 含量隨時間增加先上升后下降，當MDA 含量較高時，肝胰腺SOD 仍具有較高活性，可能是肝胰腺脂質(zhì)過氧化損傷對其抗氧化系統(tǒng)影響較小，說明中華絨螯蟹幼蟹對低于安全濃度的噻蟲嗪有很好的適應(yīng)性。

GPT 是一種參與機體蛋白質(zhì)新陳代謝的酶，以肝細胞的線粒體中最多，當1%肝細胞被破壞時，GPT 會大量被釋放進入血液，使血液中該酶活性顯著升高。

AST 主要存在于肝細胞線粒體內(nèi)，當肝臟發(fā)生嚴重壞死或破壞時，能引起谷草轉(zhuǎn)氨酶在血清中濃度偏高。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹血淋巴GPT 和AST 活性逐漸增加，可能是高濃度噻蟲嗪破壞了中華絨螯蟹幼蟹的肝胰腺細胞結(jié)構(gòu)。同時發(fā)現(xiàn)，第4 d、7 d 和14 d，28.25 μg/L 噻蟲嗪組河蟹血淋巴GPT 和AST 活性比對照組略有升高，第21 d，增加緩慢，可能是隨著暴露時間的延長，河蟹機體逐漸適應(yīng)了安全濃度下噻蟲嗪的脅迫。

酚氧化酶（PO）是甲殼動物重要的非特異性血淋巴免疫因子之一。于萍[25]研究指出，在第7 d 和14 d，隨著微塑料濃度的增加，中華絨螯蟹血淋巴中PO 活性呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。本研究也得到類似的結(jié)果，第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹血淋巴PO 活性出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺和鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達水平也出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與郝文靜[22]的結(jié)果相一致?？赡苁堑蜐舛揉缦x嗪對河蟹肝胰腺和鰓組織po 基因的表達有促進作用，高濃度噻蟲嗪則有抑制作用。Na+/K+-ATPase 可以水解ATP 獲得能量，利用該能量進行Na+和K+逆濃度梯度穿過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運，維持細胞內(nèi)外液的滲透差，在機體的代謝中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度噻蟲嗪脅迫下，Na+/K+-ATPase 的表達量升高，說明噻蟲嗪刺激中華絨螯蟹幼蟹的滲透壓調(diào)節(jié)，以抵御噻蟲嗪帶來的損害，而在高濃度和長時間暴露下，中華絨螯蟹機體的抗氧化系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)等受到損傷，肝胰腺細胞受到破壞，其功能受到影響，導(dǎo)致Na+/K+-ATPase 表達量降低。

綜上所述，高濃度的噻蟲嗪對中華絨螯蟹幼蟹的抗氧化酶活性、血淋巴細胞數(shù)量和PO 及Na+/K+-ATPase 的基因表達有較大影響，低濃度的噻蟲嗪對于中華絨螯蟹幼蟹的抗氧化和代謝系統(tǒng)具有刺激作用?；诒緦嶒灲Y(jié)果，建議稻田養(yǎng)蟹中噻蟲嗪使用濃度應(yīng)不超過45.2 μg/L。