王明成，劉道奇，劉超英，柴迎慧

（黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南駐馬店 463000）

鞘氨醇單胞菌（Sphingononas sp.）是變形細(xì)菌中的α-4 亞類，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，是20 世紀(jì)末從假單胞菌中新分離的一類新屬[1]。該菌在環(huán)境修復(fù)、農(nóng)業(yè)發(fā)展、畜禽養(yǎng)殖中具有極大的應(yīng)用潛力[2,3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，麻雞盲腸中分離的鞘氨醇單胞菌能有效降低養(yǎng)殖場氨氣含量[4]，并且能顯著提高雞的生長性能、雞肉和蛋的品質(zhì)[5]。因此，鞘氨醇單胞菌也被認(rèn)為是重要的微生物菌劑之一。

目前，為提高微生物菌體濃度，通常采用分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、半連續(xù)發(fā)酵來提高菌體密度[6,7]。分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中會(huì)受到代謝產(chǎn)物的抑制，補(bǔ)料分批發(fā)酵是間歇或連續(xù)補(bǔ)料的分批培養(yǎng)方法，可以有效緩解有害代謝產(chǎn)物的積累，克服營養(yǎng)物質(zhì)的不足，延長次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間，最終達(dá)到微生物高密度培養(yǎng)增大菌體密度的效果。段學(xué)輝等[8]研究發(fā)現(xiàn)，分批補(bǔ)料明顯加快了酒精酵母菌的生長并獲得了較高的細(xì)胞濃度。鞘氨醇單胞菌在以上培養(yǎng)條件下的細(xì)菌密度通常較低。

微膠囊是一類容許小分子物質(zhì)在膠囊內(nèi)自由出入以及代謝產(chǎn)物自由分泌，并可阻止外部生物大分子進(jìn)入的材料[9]。液芯膠囊易于輸送物質(zhì)，細(xì)胞生長均勻，密度高，可用于乳酸菌、酵母菌的增殖和培養(yǎng)[9,10]。將菌液與無水氯化鈣、羧甲基纖維素鈉的混合物滴入海藻酸鈉溶液中，并用殼聚糖溶液成膜形成液芯微膠囊[7]，與補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法相結(jié)合，來增加菌體密度。因此，本研究為增加鞘氨醇單胞菌的細(xì)胞密度首先對其發(fā)酵的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，然后使用最佳培養(yǎng)基進(jìn)行微膠囊的高密度發(fā)酵，以提高鞘氨醇單胞菌的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室低溫保存的鞘氨醇單胞菌（Sphingononas sp.）。LB 培養(yǎng)基用于菌種活化、發(fā)酵種子液培養(yǎng)以及活菌數(shù)檢測。

羧甲基纖維素鈉購自鄭州派尼化學(xué)試劑廠；殼聚糖、乳糖、葡萄糖購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛肉浸粉購自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雙人單面超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；電子分析天平（AR2140）購自梅特勒托利儀器（上海）有限公司；可見分光光度計(jì)（722）購自青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將實(shí)驗(yàn)室保存的鞘氨醇單胞菌在超凈工作臺(tái)中接種到LB 液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min 培養(yǎng)活化。

1.3.2 生長曲線測定

將以上活化好的菌液以2%的接種量轉(zhuǎn)接至LB 培養(yǎng)基中，28℃、180r/min 培養(yǎng)48h。每2h取樣，檢測菌體吸光度（OD600），并繪制鞘氨醇單胞菌的生長曲線。

1.3.3 單因素優(yōu)化

首先進(jìn)行單因素優(yōu)化：分別考察不同碳源種類及含量、不同氮源種類及含量、溫度、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、pH 值和菌液接種量對鞘氨醇單胞菌細(xì)胞密度的影響。

培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化：以LB 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察不同碳源（乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和果糖）、不同氮源、不同KH2PO4濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L）對鞘氨醇單胞菌細(xì)胞密度的影響，確定最適碳源、氮源以及最適的KH2PO4使用濃度。

培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化：分別設(shè)置溫度（25、28、30、35、37℃）、初始pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%），在28℃、180r/min 搖床培養(yǎng)48h，來確定最適溫度、初始pH 值和接種量。

然后，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選出影響顯著的組分因子，以初始pH 值和溫度為考察因素，以菌體OD 值為考察指標(biāo)，采用SPSS AU 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.4 微膠囊制備

將活化好的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在最適條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，25℃、2500r/min 離心15min，棄上清。在收集的菌體中加入5mL 生理鹽水將菌體重懸，隨后與45mL 4%（w/v）CaCl2和2%的羧甲基纖維素鈉混合溶液混合均勻。然后，用規(guī)格10mL 的一次性注射器或滴管滴入1.2%海藻酸鈉溶液，立即收集預(yù)膠囊并用無菌水沖洗，再放入0.1%的殼聚糖溶液中靜置30min，使微膠囊成膜[9]。最后用無菌水沖洗表面殘留的殼聚糖溶液，得到微膠囊[11]。

1.3.5 微膠囊后高密度培養(yǎng)

將制備好的鞘氨醇單胞菌的微膠囊，按照3%的接種量加入優(yōu)化后的培養(yǎng)基中于30℃、pH 6.0、180r/min 培養(yǎng)48h。然后，在無菌條件下將液芯微囊濾出，轉(zhuǎn)移到新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。采用以上方法連續(xù)培養(yǎng)5 次后，將液芯微囊濾出，用無菌水洗滌液芯微囊外殘留的菌體。然后，采取化學(xué)法將液芯微囊破碎，最后使用平板稀釋涂布法檢測每克液芯微囊內(nèi)的菌體數(shù)量。

1.3.6 活菌總數(shù)測定

囊內(nèi)活菌計(jì)數(shù)：取培養(yǎng)結(jié)束的完整膠囊，將微膠囊與破囊液按照1∶10 的比例混合，劇烈振蕩使其破碎完全。然后，將其稀釋進(jìn)行平板涂布活菌計(jì)數(shù)，單位為CFU/g。

破囊液：0.06mol/L 的檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）和0.2mol/L 的碳酸氫鈉（NaHCO3）混合溶液。

培養(yǎng)基菌液活菌計(jì)數(shù)與制作微膠囊并進(jìn)行高密度培養(yǎng)的過程各設(shè)置3 組平行試驗(yàn)，計(jì)數(shù)取3組菌落數(shù)平均值作為最后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.3.7 微膠囊的切面觀察

取培養(yǎng)完整的膠囊切片，放出囊內(nèi)菌液，在體視顯微鏡下觀察其囊壁及孔隙。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SAS V8 分析顯著性差異，正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，GraphPad Prism 繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 鞘氨醇單胞菌的生長曲線

由圖1 可知，鞘氨醇單胞菌生長曲線，在0～6h 生長緩慢為延滯期，6～38h 快速增長進(jìn)入對數(shù)生長期，38h 后菌體密度達(dá)到最高且不再增加，進(jìn)入穩(wěn)定期，因此以38h 的菌液為最佳培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)行下一步研究所用。

圖1 鞘氨醇單胞菌的生長曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖2 可知，以蔗糖為碳源時(shí)OD600最高，OD600為0.659，其次是葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖。因此，選擇蔗糖為最適碳源。

圖2 不同碳源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.2 不同蔗糖濃度對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖3 可知，當(dāng)蔗糖濃度為10～40g/L 時(shí)，菌體的OD600呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)蔗糖濃度為25g/L 時(shí)，OD600最高（0.772），比20g/L蔗糖時(shí)的OD600（0.646）提高19.5%。繼續(xù)增加蔗糖濃度，OD600呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，可能是高濃度的蔗糖使鞘氨醇單胞菌細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓不平衡，抑制了細(xì)胞的生長。因此，選擇25 g/L蔗糖濃度為鞘氨醇單胞菌為最適碳源含量。

圖3 不同蔗糖添加量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.3 氮源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖4 可知，鞘氨醇單胞菌對有機(jī)氮源（牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉）均有較高的利用率，其中酵母浸粉的促生長效果略微優(yōu)于其余2 種，菌體OD600達(dá)到0.772，但對無機(jī)氮源（尿素和硫酸銨）利用率較差。因此，選擇酵母浸粉為最適氮源。

圖4 不同氮源種類對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.4 不同氮源濃度下鞘氨醇單胞菌的生長情況

由圖5 可知，酵母浸粉濃度對菌體OD600的影響，整體上表現(xiàn)為先升高后降低，在20～30g/L 添加量范圍內(nèi)，菌體OD600幾乎相當(dāng)，最大OD600為0.715，當(dāng)濃度繼續(xù)增加至30g/L 以上后，菌體OD600反而明顯降低，可能是過高的氮源濃度對菌的生長產(chǎn)生抑制作用?？紤]到實(shí)際中的應(yīng)用成本，選擇20g/L 酵母浸粉濃度為鞘氨醇單胞菌為最適碳源含量。

圖5 不同酵母浸粉添加量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.5 不同濃度KH2PO4條件下鞘氨醇單胞菌的生長情況

由圖6 可知，KH2PO4濃度為0.5～3.5g/L 時(shí)，菌體OD600表現(xiàn)為先升高后降低。在0.5～2.0g/L時(shí)，菌體OD600顯著升高，最大OD600為0.92。當(dāng)KH2PO4濃度繼續(xù)增加后，菌體OD600緩慢降低，可能是過高的KH2PO4濃度產(chǎn)生滲透脅迫作用，對菌的生長產(chǎn)生抑制作用。再結(jié)合實(shí)際中的生產(chǎn)應(yīng)用，選擇2.0g/L KH2PO4進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖6 不同KH2PO4 添加量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.6 不同接種量條件下鞘氨醇單胞菌的生長情況

以LB 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量大小對鞘氨醇單胞菌生長的影響如圖7 所示。當(dāng)接種量為1.0%～3.0%時(shí)，菌體OD600逐漸增加，當(dāng)接種量達(dá)到3.0%時(shí)鞘氨醇單胞菌的OD600達(dá)到較大值，為0.673。隨著接種量的繼續(xù)增加，菌體OD600反而下降。接種量在3.0%～5.0%對鞘氨醇單胞菌生長的影響無差異，且考慮到菌種活性和代謝產(chǎn)物積累問題，接種量過大時(shí)生長條件受限，選取3%為實(shí)驗(yàn)所用接種量。

圖7 不同接種量對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.2.7 不同pH 值條件下鞘氨醇單胞菌的生長情況

初始pH 值對菌體生長的影響如圖8 所示。pH 值在3.0～5.0 范圍內(nèi)，鞘氨醇單胞菌生長情況較差，在pH 值為6.0 時(shí)OD600（0.783）達(dá)到最大。繼續(xù)增加pH 時(shí)，鞘氨醇單胞菌的生長明顯被抑制。因此，選用培養(yǎng)液初始pH 6.0 為最佳培養(yǎng)液pH 值。

圖8 不同初始pH 對鞘氨醇單胞菌的影響

2.2.8 不同溫度對鞘氨醇單胞菌生長的影響

由圖9 可知，當(dāng)溫度為25～37℃時(shí)，菌體的OD600呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，鞘氨醇單胞菌的OD600達(dá)到最大，為1.011，且差異顯著。因此，選擇30℃為最適培養(yǎng)溫度。

圖9 不同培養(yǎng)溫度對鞘氨醇單胞菌生長的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定對鞘氨醇單胞菌生長情況顯著影響的因素：溫度和培養(yǎng)液初始pH 值，結(jié)合SPSS AU 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)，采用2 因素4 水平L16(42)正交設(shè)計(jì)方法，來確定最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表1 所示。

表1 正交試驗(yàn)二因素四水平設(shè)計(jì)表L16 (42)

由表2 可知，對鞘氨醇單胞菌的生長有顯著影響的因素為：溫度和培養(yǎng)液pH，且最佳培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)液初始pH 為6.0。且由以上研究分析結(jié)果可知，鞘氨醇單胞菌的最適培養(yǎng)基是：蔗糖 20.0g，酵母浸粉 25.0g，NaCl 10.0g，KH2PO42.0g，接種量為3%，蒸餾水1000mL。

表2 正交試驗(yàn)分析結(jié)果

2.4 微膠囊后高密度培養(yǎng)結(jié)果

2.4.1 鞘氨醇單胞菌微膠囊的切面觀察結(jié)果

取培養(yǎng)完整的膠囊切片，倒出囊內(nèi)菌液，在體視顯微鏡下觀察其囊壁及孔隙，如圖10 所示。膠囊囊壁較薄，孔隙較明顯，通透性良好，微膠囊高密度培養(yǎng)效果較好，說明液芯微包囊可以對菌體起到較好的保護(hù)作用。

圖10 微囊切面10×1.7

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

基于以上優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，采用微囊化發(fā)酵鞘氨醇單胞菌，連續(xù)培養(yǎng)5次，其細(xì)胞密度的變化見圖11。鞘氨醇單胞菌微囊化后在第1～4 批的培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度逐漸增加，達(dá)到5.17×109CFU/mL。當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)到第5代時(shí)細(xì)胞密度略有降低，可能是培養(yǎng)次數(shù)過多菌體老化所致，故確定培養(yǎng)代數(shù)為4 代。而游離條件下鞘氨醇單胞菌細(xì)胞密度只在1～2 培養(yǎng)批次時(shí)逐漸增加，達(dá)到最高的1.42×109CFU/mL，之后所有培養(yǎng)批次中均無變化。

圖11 鞘氨醇單胞菌微囊化后連續(xù)培養(yǎng)過程中囊內(nèi)細(xì)胞密度的變化

2.4.3 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

由表3 可知，鞘氨醇單胞菌在高密度液體培養(yǎng)條件下的活菌總數(shù)是原培養(yǎng)基正常培養(yǎng)下的8.07 倍，而微囊化高密度培養(yǎng)下的活菌總數(shù)是高密度液體培養(yǎng)下的3.64 倍，是原培養(yǎng)基正常培養(yǎng)條件下的29.4 倍。

表3 不同培養(yǎng)條件下活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)探究碳源種類及含量、氮源種類及含量、溫度、pH 值和接種量七個(gè)因素對鞘氨醇單胞菌生長的影響，隨后采用正交試驗(yàn)（2 因素4 水平）確定最佳培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)條件為：蔗糖20.0g/L，酵母浸粉25.0g/L，NaCl 10.0g/L，KH2PO42.0g/L，pH 6.0，培養(yǎng)溫度為30℃，pH 為6.0，接種量為2%。鞘氨醇單胞菌在高密度液體培養(yǎng)條件下得到的菌落總數(shù)達(dá)到1.42×109CFU/mL，是初始培養(yǎng)基正常培養(yǎng)條件下的8.07 倍。隨后，運(yùn)用液芯微膠囊法包埋技術(shù)制備微囊化鞘氨醇單胞菌，將培養(yǎng)完整的膠囊制切片在體視顯微鏡下觀察可知，膠囊囊壁較薄，孔隙較明顯，通透性良好。微囊化鞘氨醇單胞菌在最適條件下培養(yǎng)5 代，菌落總數(shù)達(dá)到5.17×109CFU/mL，是高密度液體培養(yǎng)條件下活菌數(shù)量的3.64 倍，是原培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的29.4 倍。菌體密度得到大幅度提升，顯著提高了鞘氨醇單胞菌的產(chǎn)量。