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      骨肉瘤銅死亡相關(guān)LncRNA 預(yù)后模型構(gòu)建與驗(yàn)證

      2023-09-09 02:04:56范以東蘇國(guó)威肖世富劉俊良李威材吳廣濤
      關(guān)鍵詞:訓(xùn)練組生存期因素

      范以東,秦 剛,蘇國(guó)威,肖世富,劉俊良,李威材,吳廣濤

      (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530022;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧530022)

      骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是起源于原始間充質(zhì)細(xì)胞的最常見(jiàn)的原發(fā)性骨腫瘤[1]。在兒童和青少年中最常見(jiàn),是繼軟骨肉瘤和脊索瘤之后的成人第3 大常見(jiàn)骨癌。全球總發(fā)病率為每年3.4/100 萬(wàn)[2]。當(dāng)前,OS 患者的治療通常包括手術(shù)聯(lián)合新輔助化療藥物,且估計(jì)轉(zhuǎn)移性O(shè)S 患者的5 年生存率不足20%[3]。在過(guò)去的20 年中,盡管有許多化療方案,但生存率沒(méi)有顯著改善。對(duì)OS 預(yù)后生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè),能夠輔助判斷患者接受治療后可能發(fā)生的臨床轉(zhuǎn)歸、提高OS 的治療效果、降低治療相關(guān)毒性并為將來(lái)的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供方案[4]。因此,確定OS的預(yù)后生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

      銅是所有生物體內(nèi)不可缺少一種微量元素,主要參與真核生物的能量代謝、活性氧積累、鐵攝取和信號(hào)傳導(dǎo),細(xì)胞中銅對(duì)細(xì)胞增殖、分化或細(xì)胞死亡有直接影響[5]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度超過(guò)了維持穩(wěn)態(tài)的閾值時(shí),將導(dǎo)致細(xì)胞毒性的出現(xiàn)。涉及的機(jī)制包括活性氧的積累、抗血管生成和蛋白酶體抑制等[6]。最近的研究表明,銅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的模式與已知的死亡機(jī)制(如:鐵死亡、細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡、自噬)不同,且與線粒體呼吸關(guān)系更為密切[7]。銅離子直接結(jié)合三羧酸循環(huán)(TCA)中的脂?;煞郑瑢?dǎo)致這些蛋白聚集、失調(diào),隨后鐵-硫簇蛋白丟失,進(jìn)而引發(fā)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激,并最終致使細(xì)胞 死 亡,Tsvetkov 等[8]將 這 一 過(guò) 程 命 名 為 銅 死 亡(cuproptosis)。

      長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本,參與許多生物過(guò)程,包括細(xì)胞分化、發(fā)育和凋亡[9]。重要的是,lncRNA 已被證明是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子,它們可以在包括癌癥在內(nèi)的各種生物學(xué)功能和疾病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 與多種癌癥相關(guān),包括乳腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、肝癌[13]等。當(dāng)前,銅死亡相關(guān)LncRNA 在OS 中的作用尚不清楚,因此,我們的研究旨在利用生物信息學(xué)探索銅死亡相關(guān)lncRNA 在OS 預(yù)后中的作用。

      1 材料與方法

      1.1 銅死亡相關(guān)lncRNA 的篩選

      2022 年10 月19 日 從UCSC Xena 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http://xena.ucsc.edu/)下載88 例骨肉瘤樣本的基因表達(dá)譜與相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)(包括生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別、是否轉(zhuǎn)移)。2022 年10 月20 日從GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.gtexportal.org/home/)獲得396 例正常樣品的基因表達(dá)譜,對(duì)所有基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2(x+1)轉(zhuǎn)換。從已發(fā)表的文章中提取 了19 個(gè) 銅 死 亡 相 關(guān) 基 因[8,14]。R 軟 件”sva“包Combat 函數(shù)對(duì)UCSC 和GTEx 的合并數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。根據(jù)合并數(shù)據(jù)中基因的注釋信息來(lái)區(qū)分mRNA 與LncRNA。為了篩選潛在與銅死亡相關(guān)的LncRNA,使用R 軟件“l(fā)imma”包以|R|>0.4 和P<0.05(R 為相關(guān)系數(shù))作為篩選條件對(duì)19 個(gè)銅死亡基因與lncRNA 進(jìn)行共表達(dá)分析。最后,對(duì)符合要求的lncRNA 按|log2FC|≥1,F(xiàn)DR<0.05 條件進(jìn)行差異分析,得到差異的銅死亡相關(guān)lncRNA 進(jìn)行后續(xù)分析。

      1.2 銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后模型構(gòu)建與驗(yàn)證

      對(duì)85 例患者(其中2 名患者沒(méi)有生存狀態(tài),1 名患者沒(méi)有總生存時(shí)間,故未納入研究)按1∶1 隨機(jī)分成訓(xùn)練組與驗(yàn)證組。訓(xùn)練組用于構(gòu)建預(yù)后模型,驗(yàn)證組和總樣本組進(jìn)行模型驗(yàn)證(表1)。單因素Cox回歸篩選銅死亡相關(guān)差異lncRNA 中預(yù)后相關(guān)的lncRNA。然后,對(duì)訓(xùn)練組采用最小絕對(duì)收縮和選擇算子(LASSO)Cox 回歸和多元Cox 回歸模型來(lái)創(chuàng)建預(yù)后模型。計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)值公式為:,其 中xi和Coefi代 表 每 個(gè)lncRNA 的表達(dá)量和風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)。根據(jù)訓(xùn)練組中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將OS 患者分成高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組。Kaplan-Meier(K-M)生存分析比較了兩個(gè)不同風(fēng)險(xiǎn)組之間的總生存期。進(jìn)一步繪制預(yù)測(cè)1 年、3 年、5 年總生存期及臨床特征的受試者工作特征(ROC)曲線以評(píng)估模型的預(yù)測(cè)價(jià)值。驗(yàn)證組和總樣本組中每個(gè)OS 患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分根據(jù)相同的公式計(jì)算。

      表1 分組的臨床信息Tab 1 Grouped clinical information

      1.3 獨(dú)立預(yù)后分析

      將風(fēng)險(xiǎn)打分與OS 患者的臨床信息結(jié)合,包括年齡、性別、轉(zhuǎn)移。采用單因素與多因素Cox 分析確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素。

      1.4 列線圖的構(gòu)建

      為了更好的使預(yù)后模型應(yīng)用于臨床,使用R 軟件的“rms”與“survival”包構(gòu)建預(yù)后列線圖模型,以評(píng)估OS 患者的1 年、3 年和5 年的生存期。校準(zhǔn)曲線可視化實(shí)際結(jié)果與列線圖預(yù)測(cè)結(jié)果間的一致性。

      1.5 不同風(fēng)險(xiǎn)組的免疫細(xì)胞和功能差異分析

      采用R 軟件“GSVA”包中的單樣本基因集富集分析(ssGSEA)分析16 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和13 種免疫功能在高、低風(fēng)險(xiǎn)組的差異。

      1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      本研究所有的統(tǒng)計(jì)分析與繪圖均在R(64x 4.1.2)軟件上進(jìn)行。Pearson 相關(guān)分析得到基因共表達(dá)的相關(guān)性。采用Wilcox test 比較腫瘤組織與正常組織的差異基因表達(dá)。Mann-Whitney 檢驗(yàn)來(lái)比較高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫細(xì)胞含量或功能的ssGSEA 評(píng)分。采用Kaplan-Meier 生存分析和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)來(lái)比較高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的生存差異。單因素和多因素Cox 回歸分析用于確定獨(dú)立的預(yù)后因素。P<0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 確定預(yù)后模型構(gòu)建相關(guān)的銅死亡lncRNA

      提取UCSC+GTEx 合并數(shù)據(jù)中19 個(gè)銅死亡基因與13 425 個(gè)lncRNA 的表達(dá)量進(jìn)行共表達(dá)分析,共得到符合條件的181 個(gè)lncRNA(|R|>0.4 和P<0.05),其中PDHA1 未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)lncRNA。進(jìn)行差異分析,得到108 個(gè)差異銅死亡相關(guān)lncRNA(|log2FC|≥1,F(xiàn)DR<0.05),其中33 個(gè)下調(diào),75 個(gè)上調(diào)。?;鶊D可視化銅死亡基因與其相關(guān)lncRNA 共表達(dá)關(guān)系(圖1A)。共有85 位OS 患者被隨機(jī)分為訓(xùn)練組(n=43)和驗(yàn)證組(n=42)。對(duì)于訓(xùn)練組,將篩選得到的108 個(gè)銅死亡相關(guān)lncRNA 進(jìn)行單因素Cox 分析,確定了10 個(gè)預(yù)后相關(guān)的銅死亡lncRNA,其 中 有 5 個(gè) 高 風(fēng) 險(xiǎn) lncRNA(AC124798.1、AC005277.2、LINC01549、LINC01060、AP00085 1.2)和5 個(gè)低風(fēng)險(xiǎn)lncRNA(PCOLCE-AS1、AC090 152.1、NKILA、AC090559.1、AL136162.1)(圖1B)。隨后,采用Lasso 回歸與多因素Cox 回歸分析最終確定了參與模型構(gòu)建的最優(yōu)的3 個(gè)lncRNA(AC124798.1、AC090152.1、AC090559.1)(圖1C、D、E)。

      圖1 鑒定OS 中具有預(yù)后意義的銅死亡相關(guān)lncRNAFig 1 Identification of cuproptosis -associated lncRNAs with prognostic significance in OS

      2.2 預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

      采用篩選得到的3 個(gè)lncRNA 對(duì)訓(xùn)練組、驗(yàn)證組及總樣本組中的每位患者計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分= AC124798.1×(1.14553168738236)+AC09015 2.1×(-1.13701301122647)+AC090559.1*(-1.8 3119937382105)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值將訓(xùn)練組患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。生存分析顯示低風(fēng)險(xiǎn)組的總生存期明顯優(yōu)于高風(fēng)險(xiǎn)組。風(fēng)險(xiǎn)熱圖顯示從低風(fēng)險(xiǎn)組到高風(fēng)險(xiǎn)組AC124798.1 表達(dá)逐漸升高,AC090152.1 與AC090559.1 表達(dá)逐漸降低。生存狀態(tài)圖顯示,低危組到高危組患者死亡數(shù)逐漸增加。不僅如此,我們還在驗(yàn)證組和總樣本組進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,驗(yàn)證組與總樣本組均具有與訓(xùn)練組相似的趨勢(shì)(圖2A-L)。ROC 曲線顯示,1 年、3 年和5 年的AUC 值分別為0.799、0.786、0.827(圖3A)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與轉(zhuǎn)移的AUC 值分別為0.799 和0.905,高于年齡(0.461)與性別(0.467)(圖3B)??傊?,以上結(jié)果說(shuō)明我們構(gòu)建的預(yù)后模型具有較好的預(yù)后價(jià)值。

      圖2 不同分組中OS 患者銅死亡相關(guān)lncRNA 的預(yù)后價(jià)值Fig 2 Prognostic value of cuproptosis -related lncRNAs in different groups of patients with OS

      圖3 預(yù)后模型的臨床相關(guān)ROC 曲線Fig 3 ROC curve of clinical relevance of prognostic model

      圖4 OS 患者臨床性狀與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的獨(dú)立預(yù)后分析Fig 4 Independent prognostic analysis of clinical traits and risk score in patients with OS

      2.3 獨(dú)立預(yù)后分析

      采用單因素和多因素Cox 分析,以判斷風(fēng)險(xiǎn)打分是否是可以獨(dú)立于其他臨床特征的預(yù)后因素。結(jié)果顯示,在單因素和多因素Cox 分析中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和轉(zhuǎn)移可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素,且都為高危因素。

      2.4 列線圖模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

      根據(jù)臨床特征(包括風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、性別、轉(zhuǎn)移),構(gòu)建預(yù)測(cè)OS 患者1 年、3 年和5 年生存期的列線圖模型(圖5A)。校準(zhǔn)曲線表明,列線圖預(yù)測(cè)的總生存期與實(shí)際的總生存期具有較好的一致性(圖5B)。我們還將列線圖加入進(jìn)來(lái),繪制了預(yù)測(cè)5 年生存期的ROC 曲線,結(jié)果顯示,列線圖的AUC 值(AUC=0.852)最高,具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值(圖5C)。

      圖5 列線圖的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig 5 Construction and validation of nomograms

      2.5 高、低風(fēng)險(xiǎn)組ssGSEA 結(jié)果

      通過(guò)ssGSEA 研究了不同風(fēng)險(xiǎn)組與浸潤(rùn)腫瘤免疫細(xì)胞和免疫功能之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)免疫細(xì)胞和免疫功能在高低風(fēng)險(xiǎn)組之間有差異,且低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫細(xì)胞和免疫功能打分均比高風(fēng)險(xiǎn)組的高。低風(fēng)險(xiǎn)組中免疫細(xì)胞(包括B cells、CD8+T cells、DCs、Macrophages、Neutrophils、NK cells、pDCs、T helper cells、Tfh、Th1 cells、Th2 cells、TIL、Treg)(圖6A)及免疫功能(包括APC co inhibition、APC co stimulation、CCR、Check-point、Cytolytic activity、HLA、inflammation-promoting、MHC class I、Parainflammation、T Cell co-inhibition、T Cell costimulation、Type_I_IFN_Reponse)(圖6B)顯 著 上調(diào)(P<0.05)。說(shuō)明銅死亡與腫瘤免疫關(guān)系密切,高風(fēng)險(xiǎn)組中免疫細(xì)胞及功能可能受到抑制。

      圖6 高低風(fēng)險(xiǎn)組中免疫細(xì)胞與免疫功能的差異分析Fig 6 Analysis of differences between immune cells and immune function in high and low risk groups

      3 討論

      銅死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種銅依賴性調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡形式。細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的失衡可以影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖的速度[15]。以往的研究表明,細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡與腫瘤密切相關(guān),如細(xì)胞凋亡、自噬、壞死性凋亡等[16]。所以,對(duì)銅死亡的深入研究可能會(huì)為癌癥的治療帶來(lái)新的解決方案。

      LncRNA 一類是非蛋白質(zhì)編碼RNA 分子,能夠在各種水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá),包括組蛋白修飾,轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[17]。據(jù)估計(jì),人類中有超過(guò)60 000個(gè)lncRNA,并且lncRNA 的數(shù)量仍在快速增長(zhǎng)[18]。到目前為止,只有極少數(shù)lncRNA 的功能被注釋[19]。失調(diào)的lncRNA 廣泛參與腫瘤的發(fā)病機(jī)制,包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞凋亡和抗腫瘤耐藥性[20]。不僅如此,一部分LncRNA 還被確定為腫瘤診斷和預(yù) 后 的 生 物 標(biāo) 志 物。Deng 等[21]證 實(shí)LncRNA RBM5-AS1 在OS 組織和細(xì)胞系中顯著增加,此外,在體外實(shí)驗(yàn)中敲低RBM5-AS1 顯著抑制OS 細(xì)胞的增 殖,遷 移 和 侵 襲。Huang 等[22]發(fā) 現(xiàn)LncRNA BE503655 在人OS 組織和OS 細(xì)胞系中過(guò)表達(dá),敲低lncRNA BE503655 可以抑制OS 細(xì)胞增殖和侵襲,且其發(fā)揮功能依賴于OS 細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。LncRNA CBR3-AS1 被發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)OS 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲方面具有致癌作用,并且還是OS 患者的獨(dú)立不良預(yù)后因素[23]。以上研究說(shuō)明在OS 中,LncRNA 不僅可以充當(dāng)OS 的生物標(biāo)志物,且與其預(yù)后密切相關(guān)。

      本研究通過(guò)Pearson 相關(guān)系數(shù)與差異分析共得到108 個(gè)差異銅死亡相關(guān)lncRNA。隨后對(duì)85 例骨肉瘤患者按1∶1 分為訓(xùn)練組和驗(yàn)證組,在訓(xùn)練組中使用單因素Cox、Lasso 回歸及多因素Cox 構(gòu)建了包含3 個(gè)LncRNA 的預(yù)后模型,并在驗(yàn)證組和總樣本組中得到了驗(yàn)證。利用生存分析、ROC、獨(dú)立預(yù)后分析、校準(zhǔn)曲線驗(yàn)證評(píng)估了此模型的預(yù)測(cè)性能。

      預(yù)后模型是由3 個(gè)LncRNA 構(gòu)成,包括AC124798.1、AC090152.1、AC090559.1。其 中,AC124798.1 是骨肉瘤預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,AC090152.1 和AC090559.1 則是保護(hù)因素。本研究發(fā)現(xiàn)這3 個(gè)LncRNA 與多種腫瘤預(yù)后相關(guān),在一定程度上反映了本研究結(jié)果的可靠性。AC124798.1與乳腺癌和胰腺癌患者的生存相關(guān),是兩者重要的預(yù)后保護(hù)因素[24][25]。AC090152.1 被認(rèn)為是肝癌預(yù)后 生 物 標(biāo) 志 物[26]。Wang 等[27]發(fā) 現(xiàn)AC090152.1 不僅是腎細(xì)胞癌的預(yù)后不良因素,而且與T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞群之間存在正相關(guān)關(guān)系,與中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。AC090559.1 與鐵死亡、自噬、壞死性凋亡、焦亡密切相關(guān),可以用作肺腺癌與骨肉瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物[28-31]。目前這些LncRNA 在OS 中的相關(guān)研究甚少,與OS 的關(guān)系仍不清楚。

      腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞和免疫功能在腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[32]。我們對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行了16 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和13種免疫功能的差異分析,結(jié)果顯示有13 種免疫細(xì)胞和12 種免疫功能在高風(fēng)險(xiǎn)組都受到抑制。OS 的免疫微環(huán)境主要是由T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成,此外還有B 淋巴細(xì) 胞和肥大細(xì)胞[33]。CD8+T 細(xì)胞被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的主要驅(qū)動(dòng)因素之一[34],可以直接裂解和清除癌細(xì)胞[35]。有研究表明,在三陰性乳腺癌中,CD8+T 細(xì)胞的高水平與患者的預(yù)后良好有關(guān)[36]。Tfh(濾泡輔助性T 細(xì)胞)與抗腫瘤免疫也密切相關(guān),乳腺癌患者中Tfh 細(xì)胞浸潤(rùn)較高的患者生存率也較高[37]。深入研究腫瘤微環(huán)境中的各種免疫細(xì)胞及功能的內(nèi)在機(jī)制,并從中尋找有利于提高免疫系統(tǒng)抗腫瘤能力的研究具有十分重要的意義。

      這項(xiàng)研究也存在著許多不足,首先,盡管構(gòu)建的預(yù)后模型在內(nèi)部數(shù)據(jù)中得到了證實(shí),但是,還是需要更多的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。其次,本研究的預(yù)后模型是通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)建立和驗(yàn)證的,除了本研究的數(shù)據(jù)分析外,仍要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

      作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明:

      秦剛:文章構(gòu)思;范以東:數(shù)據(jù)分析、研究設(shè)計(jì)及手稿撰寫(xiě);蘇國(guó)威、肖世富:文章芯片篩選;劉俊良、李威材和吳廣濤:負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理及文獻(xiàn)查閱。

      所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。

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