章玉婷，王安慧，楊晉妮，林佳純，田 媛，董海娟，張尊建，宋 瑞*

（1中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2中國(guó)藥科大學(xué)公共實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，南京 210009）

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一種與2 型糖尿病、肥胖和心血管疾病密切相關(guān)的代謝綜合征。它包含一系列肝臟病理特征，從以肝臟總膽固醇和甘油三酯水平升高為主要特征的單純脂肪變性，到更為嚴(yán)重的伴隨繼發(fā)性炎癥和線粒體功能障礙的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），最后發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[1-4]。近年來(lái)，受高脂高糖飲食和久坐不動(dòng)等不良生活方式的影響，NAFLD 患病率已高達(dá)25%且仍呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)[5]。然而，目前還沒(méi)有獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的藥物用于臨床[6]。因此，亟須深入了解疾病發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)。

肝臟是膽固醇生物合成的主要部位，膽固醇可轉(zhuǎn)化為膽汁酸（bile acids, BAs）、維生素和類固醇，也可酯化生成膽固醇酯后以脂滴的形式儲(chǔ)存，以維持細(xì)胞內(nèi)的膽固醇穩(wěn)態(tài)[7-8]。一項(xiàng)橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 患者血清和肝臟中甘油三酯（triglyceride,TG）和總膽固醇（total cholesterol,TC）水平顯著升高[9]，此外，肝活檢組織的脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，單純脂肪變性和NASH 患者肝臟中游離膽固醇累積[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)foz/foz小鼠可誘導(dǎo)其肝臟膽固醇積聚，導(dǎo)致脂肪性肝炎和肝纖維化的產(chǎn)生，而降低肝臟膽固醇水平可改善肝臟疾病的嚴(yán)重程度[11]。另外，膽固醇累積還會(huì)影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）的功能，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和壞死，最終導(dǎo)致肝臟損傷加劇[12-13]。這些研究表明，肝臟膽固醇代謝失調(diào)與NAFLD/NASH 疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。

有文獻(xiàn)報(bào)道棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)的L02脂肪變性細(xì)胞模型中膽固醇水平升高，并發(fā)現(xiàn)膽固醇生物合成相關(guān)的基因表達(dá)顯著增加[15]。但影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的其他因素，如膽固醇攝取、轉(zhuǎn)化和儲(chǔ)存的相關(guān)基因和蛋白表達(dá)情況是否發(fā)生變化還尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究基于PA 構(gòu)建的HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型，從基因、蛋白和代謝物水平系統(tǒng)研究NAFLD 狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的變化，為基于膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)控治療NAFLD提供有益參考。

1 材 料

1.1 試 劑

棕櫚酸鈉、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；CCK-8（上海百賽生物技術(shù)有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和PBS（美國(guó)Gibco 公司）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries 公司）；牛血清白蛋白（free-fatty acid，BSA，索萊寶生物科技有限公司）；甘油三酯和總膽固醇測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol、HiScrip Ⅲ qRTSuperMix 和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司）；RIPA 裂解液、PMSF、Triton X-100、油紅O 染色試劑盒、增強(qiáng)型BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、SDSPAGE 制備試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；CHOP 和GRP78 一抗（美國(guó)Affinity 公司）；STARD1、LXRα、ABCG5 和β-actin 一抗（武漢愛(ài)博泰克公司）；丁基羥基甲苯（BHT，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；（2, 2, 4, 4-d4）-膽酸（CA-d4）（美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories 公司）；（2, 2,4, 4-d4）-石膽酸（LCA，美國(guó)Glpbio 公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Infinite 200Pro 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 有限公司）；Light Cycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)羅氏公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海Tanon 公司）；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技公司）；UPLC-MS/MS 8040 液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（日本Shimadzu 公司），包含LC-30AD 泵、SIL-30AD 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A 柱溫箱、DGU-20A5R 脫氣機(jī)、CMB-20A 系統(tǒng)控制器、MS-8040 三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器；FinniganTMTSQ Quantum Discovery MAX 液相三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司），包括Surveyor 液相色譜儀，Surveyor 自動(dòng)進(jìn)樣器， TSQ Quantum三重四極桿質(zhì)譜儀。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞購(gòu)自科佰生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 PA-BSA溶液制備

稱取一定量的棕櫚酸鈉，加入適量純水，于70 ℃下加熱至完全溶解，配制成100 mmol/L 棕櫚酸溶液。然后用含2% BSA 的DMEM（含1% FBS）溶液稀釋，配成濃度為1.5 mmol/L 的PA-BSA 儲(chǔ)備液[16]，0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌后待用。使用前用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2 細(xì)胞用含10% FBS 的高糖DMEM 完全培養(yǎng)基，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)及密度，融合至80% ～ 90%時(shí)，采用胰蛋白酶消化，按1∶2/1∶3進(jìn)行傳代。

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，以每孔8 × 103個(gè)細(xì)胞的密度接種至96 孔板中，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁，然后更換成含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基饑餓12 h，隨后用不同濃度的PA（0.075, 0.15,0.3 mmol/L）分別處理細(xì)胞24、48和72 h，每個(gè)濃度組均分別設(shè)置對(duì)照組（含細(xì)胞）和空白組（不含細(xì)胞），加入對(duì)應(yīng)體積的2% BSA 處理相同時(shí)長(zhǎng)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，平行實(shí)驗(yàn)3次。處理結(jié)束后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，于37 ℃避光孵育3 h，在450 nm處測(cè)定吸收度并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 油紅O染色

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，饑餓12 h，棄去培養(yǎng)基，用0.3 mmol/L PA處理72 h，對(duì)照組加入相同體積的2% BSA。處理結(jié)束后，按照改良油紅O 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況。

2.5 細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量測(cè)定

將HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板中，同方法“2.4”項(xiàng)下分組且對(duì)應(yīng)處理72 h，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入適量1% Triton X-100 于冰上裂解40 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC和TG含量，測(cè)定結(jié)束后，于4 ℃，14 000 r/min，離心20 min，用BCA 法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量（mg/mL），以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

2.6 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）

采用Trizol 試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作去除基因組DNA，并在37 ℃，15 min、85 ℃，5 s 的條件下合成cDNA。由SYBR Green master mix 5 μL、引物（0.5 mmol/L）1 μL、cDNA 2.5 μL 和ddH2O 1.5 μL 組成10 μL 體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)。以GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)倍數(shù)變化。實(shí)驗(yàn)中所使用的引物如表1所示。

Table 1 Primer sequences used for real-time polymerase chain reaction

2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）

根據(jù)各孔細(xì)胞密度加入適量RIPA（含PMSF）裂解液，4 ℃裂解20 min，細(xì)胞刮收集細(xì)胞，4 ℃，14 000 r/min，離心20 min，采用BCA 法測(cè)定上清液中蛋白濃度，按每孔20 μg 折算上樣量。上樣并進(jìn)行SDS-PAGE電泳（電泳時(shí)間：80 V、30 min；110 V、60 min），隨后將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結(jié)合，并在4 ℃與STARD1、ABCG5、LXRα 一抗（1∶1 000）孵育過(guò)夜。TBST 清洗膜3 次后，與二抗（1∶8 000）在室溫下孵育1 h，TBST 清洗膜3 次后，通過(guò)ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin 為內(nèi)參對(duì)照，用ImageJ 軟件分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.8 LC-MS/MS測(cè)定膽汁酸和氧甾醇含量

2.8.1 細(xì)胞及培養(yǎng)液上清液中膽汁酸含量測(cè)定選取狀態(tài)較好的HepG2 細(xì)胞接種于100 mm 培養(yǎng)皿中，同 “2.4”項(xiàng)下分組且對(duì)應(yīng)處理72 h，每組設(shè)置7個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置一皿無(wú)細(xì)胞但含相同培養(yǎng)液，以扣除外源干擾。精密吸取培養(yǎng)液上清液200 μL，加入甲醇（含膽汁酸內(nèi)標(biāo)CA-d40.1μg/mL 和LCA-d40.05 μg/mL）1.2 mL，渦旋5 min 以沉淀蛋白，4 ℃，14 000 r/min，離心10 min。取上清液1.2 mL，氮吹干燥后待用。用冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入80%甲醇（含膽汁酸內(nèi)標(biāo)CA-d40.1 μg/mL 和LCAd40.05 μg/mL）3 mL，在-80℃冰箱中淬滅20 min（淬滅的目的是使細(xì)胞中的酶失活，終止細(xì)胞代謝），細(xì)胞刮收集細(xì)胞，冰浴超聲破碎，4 ℃，14 000 r/min，離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移并氮?dú)飧稍?。干燥后的樣本均用甲?0 μL 復(fù)溶，供LC-MS/MS分析。每組各隨機(jī)選取一皿用BCA 法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量（mg/mL），用于膽汁酸含量歸一化[17-18]。

分析條件：Zorbax Bonus-RP 色譜柱（2.1 mm ×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：含0.01%甲酸和5 mmol/L醋酸銨的水溶液（A相）和甲醇溶液（B相）；梯度洗脫程序設(shè)置如下：0 ～ 10 min，55% B ～ 60% B； 10 ～60 min，60% B；60 ～ 65 min，60% B ～ 80% B； 65 ～75 min，80% B；75 ～ 85 min，80% B ～ 90% B；85.01 ～88 min，100% B；88.01 ～ 93 min，55% B；柱溫：42 ℃，進(jìn)樣量：5 μL，流速為0.3 mL/min。各膽汁酸對(duì)照品及其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)與碰撞能等詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

Table 2 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters (Q1/Q3 transition pair; collision energy (CE)) of 25 bile acids and 3 deuterium-labeled internal standards used in the analysis

2.8.2 線粒體分離 將HepG2 細(xì)胞以每皿1 ×107個(gè)細(xì)胞的密度接種于150 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，同“2.4”項(xiàng)下分組且對(duì)應(yīng)處理72 h，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。PA 處理結(jié)束后，用冰冷的PBS 清洗細(xì)胞3 次，細(xì)胞刮收集細(xì)胞至離心管中，根據(jù)Minowa 等[19]報(bào)道的方法進(jìn)行線粒體分離，將細(xì)胞重新懸浮在含有0.5% BSA 的Hypo 緩沖液中（0.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L MgCl2，1 mol/L Tris-HCl），冰上靜置10min 后轉(zhuǎn)移至2 mL 玻璃勻漿器勻漿，隨后加入適量的線粒體分離液（525 mmol/L 甘露醇，175 mmol/L 蔗糖，2.5 mmol/L EDTA，12.5 mmol/L Tris-HCl）充分混合，4 ℃，2 254 r/min，5 min，沉淀為完整的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)胞核。取上清液，4 ℃，2 667 r/min，10 min，除去殘留細(xì)胞核。取上清液于4 ℃，9 017 r/min，10 min，得線粒體粗組分。氧甾醇含量以對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)含量（mg/mL）歸一化。

2.8.3 線粒體氧甾醇含量分析 根據(jù)已有報(bào)道［20］進(jìn)行線粒體脂質(zhì)提取，甲醇40 μL 復(fù)溶后，經(jīng)LC-MS/MS 8040 進(jìn)樣分析。分析條件如下：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A 為70% 甲醇、30% 水、0.1% 甲酸，流動(dòng)相B為70% 乙腈、30% 甲醇、0.1% 甲酸；梯度洗脫程序設(shè)置如下：0 ～ 3 min，8% B；3 ～ 14 min，8% B ～ 20% B；14 ～ 31 min，20% B ～ 35% B； 31 ～32 min，35% B ～ 70% B；32 ～ 49 min，70% B； 51 ～54 min，100% B；56 ～ 59 min，8% B；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。各氧甾醇對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)與碰撞能等信息見(jiàn)表3。

Table 3 MRM parameters (Q1/Q3 transition pair; CE) of 15 oxysterols and 2 deuterium-labeled internal standards used in the analysis

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。利用Graphpad Prism 8.0 軟件應(yīng)用非配對(duì)t檢驗(yàn)、單因素方差分析或兩因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P <0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 PA對(duì)細(xì)胞活力的影響

通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同濃度PA 處理不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)HepG2 細(xì)胞的毒性。結(jié)果如圖1 所示，3 種不同濃度的PA 處理1 ～ 3 d 對(duì)HepG2 細(xì)胞具有明顯的毒性作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性。

3.2 PA促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)堆積

TG 與TC 含量測(cè)定結(jié)果如圖2-A 所示，與對(duì)照組相比，0.3 mmol/L PA 處理72 h 后，細(xì)胞內(nèi)TG 與TC 含量顯著增加（P <0.000 1）。油紅O 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)幾乎無(wú)明顯脂滴；而模型組中細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量橙紅色脂滴（圖2-B）。

Figure 1 Effects of palmitic acid (PA) induced cytotoxicity in HepG2 cells. HepG2 cells were exposed to various concentrations of PA (0,0.075, 0.15, 0.3 mmol/L) for 24, 48, and 72 h, and cell viability was subsequently determined by CCK-8 assay (± s, n = 6)

Figure 2 Induction of lipid accumulation by PA in HepG2 cells

3.3 PA 對(duì)細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因與蛋白表達(dá)的影響

如圖3 所示，與對(duì)照組相比，膽固醇合成相關(guān)基因SREBF-2和HMGCRmRNA 表達(dá)以及負(fù)責(zé)膽固醇攝取的NPC1L1mRNA 的表達(dá)均未發(fā)生顯著變化。而膽汁酸替代合成途徑限速酶STARD1mRNA的表達(dá)水平呈時(shí)間和濃度依賴性顯著升高；與此同時(shí)，STARD1 蛋白表達(dá)也升高約2 倍（圖4）。另外，隨著PA 濃度增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)，膽汁酸合成限速酶CYP7B1和關(guān)鍵酶CYP8B1的基因表達(dá)均上調(diào)。然而，膽固醇外流相關(guān)基因表達(dá)沒(méi)有發(fā)生顯著變化（P> 0.05），但ABCG5 蛋白及其上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LXRα 表達(dá)水平均顯著下降（P< 0.05）。

3.4 PA增加細(xì)胞及培養(yǎng)液中BAs水平

為了進(jìn)一步觀察生物大分子功能改變是否會(huì)體現(xiàn)在代謝物水平上，本研究利用LC-MS/MS 檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)液中BAs 水平。C4 是膽汁酸合成過(guò)程中產(chǎn)生的一種穩(wěn)定的中間體，可用于表征膽汁酸的合成速率[21]。結(jié)果如圖5 所示，在細(xì)胞及培養(yǎng)液中均只檢測(cè)到CA、CDCA 及C4 3 個(gè)物質(zhì)。與對(duì)照組相比，PA 處理后細(xì)胞內(nèi)CA、CDCA 與C4 水平均有不同程度的增加，培養(yǎng)液中CA 與CDCA 水平顯著升高，而C4 含量較低，但總BAs 水平增加約1.5倍（P< 0.05,P< 0.01），這與STARD1和CYP7B1mRNA表達(dá)增加一致。

3.5 PA誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體中27-OHC水平升高

為了更好地了解飽和脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞亞細(xì)胞器的脂毒性機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用差速離心法分離肝細(xì)胞線粒體，并利用LC-MS/MS 測(cè)定線粒體中氧甾醇水平。結(jié)果如圖6 所示，膽固醇和替代合成途徑的中間產(chǎn)物27-OHC 水平顯著增加，而經(jīng)典膽汁酸合成途徑的中間產(chǎn)物7-OHC 含量無(wú)明顯變化。另外，PA 對(duì)非酶途徑產(chǎn)生的7-KC、5α，6α-Epox、5β，6β-Epox 和Triol 等氧甾醇含量也無(wú)顯著影響。

4 討 論

NAFLD 通常分為非酒精性脂肪肝（NAFL）和NASH，NASH 是NAFL 的一種進(jìn)行性形式，涉及炎癥和肝細(xì)胞損傷[22]。肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)失調(diào)在NAFLD/NASH 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積不僅是肝臟損傷的調(diào)節(jié)因素，也是改善代謝性疾病的治療靶點(diǎn)[14]。因此，深入了解疾病狀態(tài)下膽固醇代謝過(guò)程對(duì)預(yù)防和治療NAFLD具有重要意義。

一項(xiàng)病例對(duì)照研究結(jié)果表明，PA 和油酸（oleic acid，OA）是NAFLD 患者血清中含量最豐富的FFA[23]，大多數(shù)研究使用PA 或OA 或FFA 混合物建立體外肝臟脂肪變性模型，以模擬人體疾病狀態(tài)[24-25]。在評(píng)估與病理生理狀態(tài)相關(guān)的脂毒性機(jī)制的實(shí)驗(yàn)中，由于FFA 溶解度的限制，F(xiàn)FA 與BSA的物質(zhì)的量之比不宜超過(guò)5[16]。故本研究采用PA與BSA 物質(zhì)的量之比為5 構(gòu)建HepG2 細(xì)胞脂肪變性模型，探討膽固醇代謝相關(guān)基因和蛋白表達(dá)變化，并基于細(xì)胞和亞細(xì)胞器水平觀察疾病狀態(tài)下膽固醇代謝過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性可能與膽固醇代謝紊亂密切相關(guān)，該結(jié)果對(duì)了解NAFLD 中膽固醇代謝變化具有一定的意義。

Figure 3 HepG2 cells were exposed to various concentrations of PA (0, 0.075, 0.15, 0.3 mmol/L) for 24, 48 and 72 h. The mRNA levels of cholesterol synthesis, including SREBF-2 and HMGCR (A-B), and NPC1L1, forcholesterol uptake (C), and the key genes of bile acids synthesis, including STARD1, CYP27A1, CYP7B1, CYP7A1 and CYP8B1 (D-H), and cholesterol efflux, including LXRα, ABCG5, ABCG8 and ABCA1 (I-L). The relative mRNA expression levels were determined by normalizing to GAPDH (± s, n = 3)

Figure 4 Effects of PA on the bile acids alternative synthesis pathway and cholesterol efflux, measured by blot. Time- (A) and dose-dependent(B) effect of PA on STARD1, LXRα, ABCG5 protein content; (C, D) Protein expression levels are normalized with β-actin (± s, n = 3)

Figure 5 Effects of PA treatment on endogenous bile acids (BAs) content. Total BAs are measured in the media and cells from cultures treated with 0.3 mmol/L PA for 72 h and in corresponding untreated control using LC-MS/MS. Data are normalized relative to the amount of proteins in each condition

本研究首先評(píng)估了PA 對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的影響，隨著PA 濃度與處理時(shí)間增加，對(duì)細(xì)胞毒性也明顯增強(qiáng)。采用0.3 mmol/L PA 處理72 h 后，可見(jiàn)細(xì)胞脂滴明顯累積，TG 和TC 含量也顯著升高，這與文獻(xiàn)[26]的結(jié)果一致，表明肝細(xì)胞脂肪變性模型建立成功。此外，PA 刺激HepG2 細(xì)胞后，與膽固醇合成、攝取和外排相關(guān)mRNA 表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化。而NAFLD細(xì)胞模型中膽固醇合成與之前的研究結(jié)果[15]不一致，這可能是由于膽固醇對(duì)肝臟HMG-CoA 還原酶和SREBF-2 的代償性抑制，以反饋細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的升高[27]。另外，LXRα和ABCG5mRNA 和蛋白表達(dá)水平不一致，可能是由于其轉(zhuǎn)錄后翻譯水平發(fā)生變化（如蛋白質(zhì)合成速率低或降解速率較快）而導(dǎo)致的[28-29]。已有研究表明NASH 患者和高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因，如CYP7A1，CYP8B1和CYP27A1表達(dá)水平顯著增加[30]。此外，STARD1 作為膽汁酸替代合成途徑的限速酶，其生物學(xué)功能是將胞質(zhì)中的膽固醇運(yùn)輸至線粒體內(nèi)膜進(jìn)行代謝，其可通過(guò)調(diào)控BAs 的組成和水平在NASH 驅(qū)動(dòng)的肝癌模型中發(fā)揮重要作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸合成途徑相關(guān)基因和蛋白表達(dá)均顯著增加。這些結(jié)果表明，PA 刺激HepG2 細(xì)胞后膽固醇穩(wěn)態(tài)失調(diào)主要表現(xiàn)為膽固醇外流減少和膽固醇向代謝產(chǎn)物BAs 的轉(zhuǎn)化速率增加。

為了進(jìn)一步探討細(xì)胞BAs 水平是否發(fā)生了與基因和蛋白相應(yīng)的變化，本研究采用LC-MS/MS 測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)BAs 的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和培養(yǎng)液中CA、CDCA 和C4 含量均顯著增加。與該結(jié)果一致的是Jiao 等[30]發(fā)現(xiàn)NAFLD 患者血清CA、CDCA、DCA 和UDCA 水平顯著升高，同時(shí)依據(jù)糞便總膽汁酸、初級(jí)膽汁酸和血清膽汁酸合成標(biāo)志物C4 水平升高等結(jié)果說(shuō)明NAFLD患者肝臟膽汁酸合成速率增加[32]。然而，外源性CDCA可以激活Kupffer細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子（如TNFα 和IL-1β），誘發(fā)炎癥反應(yīng)[33]。因此，細(xì)胞內(nèi)初級(jí)膽汁酸水平升高在一定程度上會(huì)破壞細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，從而惡化NAFLD進(jìn)程。

Figure 6 LC-MS/MS analysis of oxysterols levels in mitochondria. Cells were treated with 0.3 mmol/L PA for 72 h. Mitochondria were separated by differential centrifugation after PA treatment. Lipids were extracted with chloroform/methanol (2∶1) mixture. Data are normalized relative to the amount of mitochondria proteins in each condition. Total ion chromatograms (TIC) of oxysterol mixture standards (A) and samples (B); (C) Determination of oxysterols content in mitochondria (± s, n = 3)

膽固醇在線粒體膜結(jié)構(gòu)中起主要作用，可以調(diào)節(jié)線粒體膜的流動(dòng)性[34]。然而，線粒體游離膽固醇蓄積會(huì)破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。此外，一些研究表明，NAFLD 患者血清中由膽固醇合成膽汁酸的中間產(chǎn)物4β-OHC、7-OHC、24S-OHC、25-OHC 和27-OHC 等均具有很強(qiáng)的生物活性。27-OHC 是由膽汁酸替代合成途徑中的關(guān)鍵酶CYP27A1合成的一種膽固醇衍生物，可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中SREBF-2的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響膽固醇代謝[35]。27-OHC 還可以作為激活LXR 的生理性配體發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)。為了進(jìn)一步了解氧甾醇在脂肪變性細(xì)胞模型中的變化及飽和脂肪酸對(duì)細(xì)胞的脂毒性機(jī)制，本研究采用LC-MS/MS 測(cè)定線粒體氧甾醇含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體膽固醇和27-OHC 水平顯著增加，而其余氧甾醇均無(wú)明顯改變，這可能是由于其相應(yīng)的代謝酶定位在ER 或其他亞細(xì)胞器中，因而在線粒體中沒(méi)有觀察到差異。另外，本研究結(jié)果中CYP27A1 表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化，而線粒體中27-OHC含量顯著升高，這可能與CYP27A1催化底物增加或胞質(zhì)中介導(dǎo)27-OHC 經(jīng)硫酸化修飾進(jìn)行代謝的酶表達(dá)降低有關(guān)[36]。此外，27-OHC 水平升高，而LXRα 蛋白表達(dá)卻表現(xiàn)出相反趨勢(shì)，這可能是因?yàn)?7-OHC的激動(dòng)作用僅限于Kupffer細(xì)胞，并在很大程度上依賴于LXRβ，而27-OHC 在全肝中主要作為L(zhǎng)XRα 的拮抗配體，說(shuō)明27-OHC 對(duì)LXR 的興奮和拮抗作用是細(xì)胞特異性的[37]。這些研究結(jié)果表明，PA 刺激后，線粒體膽固醇含量增加，且膽汁酸酸性合成中間體27-OHC 水平同步升高，這可能通過(guò)破壞線粒體膜的完整性加重肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究詳細(xì)描述了膽固醇代謝相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)情況，并系統(tǒng)觀察了細(xì)胞膽汁酸和線粒體氧甾醇水平變化。這些發(fā)現(xiàn)為NAFLD 疾病中肝臟膽固醇代謝變化提供了更清晰的認(rèn)識(shí)。更重要的是，在該研究中發(fā)現(xiàn)STARD1基因和蛋白表達(dá)均顯著升高，這表明膽汁酸替代合成途徑在NAFLD 的發(fā)展中具有重要作用。另外，目前這些發(fā)現(xiàn)局限于外源誘導(dǎo)的細(xì)胞模型，而STARD1 對(duì)NAFLD 發(fā)展過(guò)程中膽汁酸替代合成途徑的調(diào)節(jié)作用還須通過(guò)敲除或過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證，從而部分支持STARD1 作為NAFLD 治療靶點(diǎn)的潛力。