菊苣酸調(diào)控TLR9/NF-κB通路改善膿毒癥小鼠腸損傷研究

盛雙雙，孫紹欣，馮 帥，李 峰，王 歡，李 健*

菊苣酸調(diào)控TLR9/NF-κB通路改善膿毒癥小鼠腸損傷研究

盛雙雙1，孫紹欣1，馮 帥1，李 峰1，王 歡2，李 健2*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250014

研究菊苣酸對(duì)膿毒癥小鼠腸損傷的影響及作用機(jī)制。60只雄性C57小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松（5 mg/kg）組和菊苣酸高、中、低劑量（40、20、10 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ip相應(yīng)藥物3 d后，采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)建立膿毒癥小鼠模型。造模成功后連續(xù)給藥48 h，采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠腸組織病理變化；采用ELISA法測(cè)定腸組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β水平；取對(duì)照組、模型組和菊苣酸中劑量組的腸組織樣本，基于Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析；采用Western blotting檢測(cè)腸組織Toll樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）、p-NF-κB p65和干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）蛋白表達(dá)。與模型組比較，各給藥組腸黏膜損傷程度明顯改善，腸組織炎癥因子水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，與對(duì)照組比較，模型組共分析出1140個(gè)差異表達(dá)基因；與模型組比較，給藥組共分析出497個(gè)差異表達(dá)基因，差異基因均富集于NF-κB信號(hào)通路。與模型組比較，菊苣酸給藥后腸組織TLR9、MyD88、p-NF-κB p65和IRF7蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。菊苣酸可通過TLR9/NF-κB信號(hào)通路改善膿毒癥誘導(dǎo)的腸黏膜損傷。

菊苣酸；膿毒癥；腸損傷；炎癥因子；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；Toll樣受體9/核因子-κB信號(hào)通路

膿毒癥是指人體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)激發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，伴隨免疫功能失調(diào)和器官功能障礙，屬于重癥疾病[1-2]。研究表明，膿毒癥發(fā)生時(shí)，過度炎癥損害腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞凋亡增多，進(jìn)而發(fā)生腸道黏膜屏障損傷，引發(fā)腸道中的微生物及其產(chǎn)物從腸道進(jìn)入血液，促進(jìn)細(xì)菌遷移和毒素傳播，進(jìn)一步會(huì)激發(fā)宿主的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官衰竭和危及生命的臨床癥狀[3-4]。因此，迫切需要尋找能夠改善腸道損傷的安全、有效的天然藥物。

菊苣酸從菊科植物紫錐菊(Linn.) Moench中分離得到，是一種主要存在于菊科植物中的咖啡酸衍生物。研究證明，菊苣酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性[5-7]，可以抑制HIV病毒[8]；逆轉(zhuǎn)減輕高脂小鼠肝臟的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)水平[9]；通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路來抑制腦缺血再灌注損傷大鼠的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)作用[10]；通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路減輕帕金森模型小鼠的腸道炎癥[11]。然而，目前關(guān)于菊苣酸對(duì)膿毒癥致腸損傷調(diào)節(jié)作用及機(jī)制方面的研究較缺乏，本研究從菊苣酸對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠腸損傷的保護(hù)作用方面進(jìn)行重點(diǎn)研究，并采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析探索菊苣酸發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機(jī)制，為膿毒癥的腸損傷治療提供潛在藥物。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57小鼠，體質(zhì)量18～22 g，7周齡，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（魯）20190003。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫（24±2）℃，模擬12 h晝夜交替的環(huán)境，自由飲用水以及商業(yè)級(jí)動(dòng)物飼料。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)AWE-2023-084）。

1.2 藥品與試劑

菊苣酸（批號(hào)B20647，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；地塞米松（批號(hào)D829854）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；多聚甲醛固定液（批號(hào)G1101）、蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號(hào)G1003）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗體（批號(hào)10745-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)10494）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗體（批號(hào)A0980）購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；p-NF-κB p65抗體（批號(hào)AF2006）、Toll樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）抗體（批號(hào)DF2970）購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司；干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）抗體（批號(hào)ET1610-89）購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)7074）購(gòu)自美國(guó)CST公司；Marker（批號(hào)26616）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)分別為EK282、EK201B、EK206）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器

TGL-16M型醫(yī)用離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；Imark-22353型酶標(biāo)儀、PowerPac Basic電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；4800型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；TS-2型搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松（5 mg/kg）組和菊苣酸高、中、低劑量（40、20、10 mg/kg）組，每組10只。對(duì)照組和模型組ip生理鹽水，各給藥組ip相應(yīng)藥物3 d后，采用CLP誘導(dǎo)建立膿毒癥小鼠模型。

2.2 造模與標(biāo)本采集

小鼠CLP造模前12 h禁食[12]，ip 0.3%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）麻醉后固定，常規(guī)備皮消毒，沿腹白線做1個(gè)長(zhǎng)約1 cm的切口，用無(wú)齒鑷在右下側(cè)尋找盲腸，將其輕柔拉出（注意盡量只牽拉盲腸），用無(wú)菌的尼龍縫線結(jié)扎在盲腸1/2處，在盲腸的底端，盡量避開系膜血管，以22 G無(wú)菌注射器針頭做穿刺，擠出少許糞便后推回腹腔，用濕潤(rùn)的4-0縫線依次縫合各層組織2～3針。對(duì)照組小鼠僅做開腹操作，不做結(jié)扎和穿孔。術(shù)后保證小鼠飲食和飲水供應(yīng)。觀察小鼠術(shù)后狀況，當(dāng)小鼠出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、寒戰(zhàn)、眼瞼低垂且有白色分泌物、活動(dòng)減少等癥狀時(shí)代表膿毒癥模型造模成功[13]。

造模成功后，各組小鼠繼續(xù)每天ip等體積的生理鹽水或藥物，48 h后取材。麻醉法安樂死小鼠，打開腹腔，取距離回盲瓣3 cm的回腸組織2 cm，用4 ℃生理鹽水沖洗干凈后，再置于多聚甲醛溶液中，用于HE染色檢測(cè)。取剩余回腸組織8 cm于干凈的EP試管中，?80 ℃凍存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白和炎癥因子的檢測(cè)。

2.3 腸組織病理觀察

各組小鼠腸組織采用4%多聚甲醛溶液常溫固定，修剪成塊，樣品脫水，浸蠟包埋，切片貼片，染色封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理變化。

2.4 ELISA法檢測(cè)腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平

取各組小鼠腸組織約20 mg，充分勻漿，離心，吸取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

分別隨機(jī)選取對(duì)照組、模型組、菊苣酸中劑量組3只小鼠的腸組織作為樣本，液氮凍存，委托北京諾禾致源科技有限公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

從樣本中提取RNA，篩選mRNA，按照NEB普通建庫(kù)方式或鏈特異性建庫(kù)方式建庫(kù)后，使用Qubit 2.0熒光計(jì)初步定量并稀釋文庫(kù)，隨后使用Agilent 2100型生物分析儀對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè)，插入片段長(zhǎng)度符合預(yù)期后，以qRT-PCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，使用HISAT2（v2.0.5）軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)過濾后的潔凈讀段與參照基因組比對(duì)。根據(jù)比對(duì)后的reads數(shù)目，通過Subread軟件中的FeatureCounts工具進(jìn)行基因表達(dá)定量分析。采用具有生物學(xué)重復(fù)性的DEseq2方法，以篩選閾值＜0.05且|log2(FoldChange)|≥1的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)基因表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。根據(jù)差異分析結(jié)果，采用ClusterProfiler軟件落實(shí)候選基因集的基因功能，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.6 Western blotting檢測(cè)腸組織TLR9/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組小鼠的回腸組織，剪碎，加入研磨珠和適量的裂解液，研磨10 min，1300 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后，孵育相應(yīng)抗體，洗滌，顯影后分析條帶灰度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況觀察

對(duì)照組小鼠眼鼻干凈，被毛光滑，精神活潑；模型組小鼠眼角有大量白色分泌物，眼瞼下垂，蜷縮；菊苣酸各劑量組小鼠精神狀態(tài)、行走能力、眼角白色分泌物等都有所改善；地塞米松組小鼠有少數(shù)眼角白色分泌物，行動(dòng)力良好。造模后48 h對(duì)照組小鼠死亡總數(shù)0只，模型組小鼠死亡總數(shù)6只，菊苣酸低劑量組小鼠死亡總數(shù)4只，菊苣酸中劑量組小鼠死亡總數(shù)3只，菊苣酸高劑量組小鼠死亡總數(shù)2只，地塞米松組小鼠死亡總數(shù)1只。

3.2 菊苣酸對(duì)腸損傷小鼠腸組織病理變化的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠回腸組織的腸絨毛的固有層出現(xiàn)壞死，肌層暴露，官腔中存在大量碎片細(xì)胞，說明黏膜組織損傷嚴(yán)重；與模型組比較，菊苣酸低劑量組腸絨毛的上皮層與固有層分離程度減輕，說明損傷有所減輕；菊苣酸中、高劑量組僅絨毛表層出現(xiàn)破損，表明給藥后小腸絨毛損傷均得到不同程度的改善，絨毛的完整度逐漸增加，管腔中碎片上皮細(xì)胞隨給藥劑量升高而減少。

3.3 菊苣酸對(duì)腸損傷小鼠回腸組織中炎癥因子水平的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠回腸組織中炎癥因子水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組回腸組織中炎癥因子水平均顯著降低（＜0.05、0.01），表明菊苣酸能夠下調(diào)回腸組織中促炎因子水平。

圖1 菊苣酸對(duì)腸損傷小鼠回腸組織病理變化的影響

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖8同

3.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

本研究進(jìn)行了9個(gè)樣本（對(duì)照組、模型組、菊苣酸中劑量組各3個(gè)）的測(cè)序分析，各樣本測(cè)序得到的clean reads與參考基因組的平均比對(duì)率為97.19%，樣品的20平均值為98.216%，30的平均值為94.711%，各樣本的GC堿基占比均在50%左右，說明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

3.4.1 對(duì)照組與模型組基因表達(dá)差異分析結(jié)果 如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組有1140個(gè)差異表達(dá)的mRNA，其中523個(gè)基因上調(diào)、617個(gè)基因下調(diào)。對(duì)篩查出的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行KEGG分析和GO分析。如圖4-A所示，富集的KEGG通路主要包括抗原處理和呈遞、造血細(xì)胞系、TNF信號(hào)通路等。GO分析顯示DEGs富集于1055個(gè)生物學(xué)過程條目、34個(gè)細(xì)胞組分條目、2151個(gè)分子功能條目，富集的主要結(jié)果見圖4-B，DEGs主要參與β干擾素應(yīng)答、γ干擾素應(yīng)答等生物學(xué)過程，分子功能主要條目與細(xì)胞因子的活性相關(guān)，細(xì)胞組分包含脂蛋白粒子、血漿脂蛋白顆粒等。

圖3 對(duì)照組和模型組DEGs的火山圖

圖4 對(duì)照組和模型組DEGs的KEGG通路(A) 和GO功能(B) 富集分析

3.4.2 菊苣酸組與模型組基因表達(dá)差異分析結(jié)果 如圖5所示，菊苣酸組與模型組共分析出497個(gè)差異表達(dá)的mRNA，涉及247個(gè)上調(diào)基因和250個(gè)下調(diào)基因。富集分析結(jié)果如圖6所示，KEGG分析顯示，DEGs主要與免疫途徑相關(guān)。GO分析顯示，DEGs富集了171個(gè)生物學(xué)過程條目、12個(gè)細(xì)胞組分條目、29個(gè)分子功能條目，其中重要的生物學(xué)過程包括B細(xì)胞活化、B細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)的激活等，主要的細(xì)胞組分包含免疫球蛋白復(fù)合體、免疫突觸等方面，主要的分子功能與蛋白受體結(jié)合、抗原結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等免疫過程相關(guān)方面。

3.4.3 共表達(dá)通路富集分析結(jié)果 KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，對(duì)照組的DEGs與55條KEGG通路相關(guān)，菊苣酸組的DEGs與15條KEGG通路相關(guān)，二者有8條共同的通路被富集，經(jīng)典炎癥信號(hào)通路NF-κB信號(hào)通路是其中之一（圖7）。

圖5 菊苣酸組和模型組DEGs的火山圖

圖6 菊苣酸組和模型組DEGs的KEGG通路(A) 和GO功能(B) 富集分析

圖7 共表達(dá)KEGG通路富集分析

3.5 菊苣酸對(duì)腸損傷小鼠回腸組織中TLR9/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可操作性和菊苣酸的作用機(jī)制，通過Western blotting法檢測(cè)參與NF-κB炎癥信號(hào)通路傳導(dǎo)的代表性蛋白（TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IRF7）表達(dá)。如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠回腸組織中TLR9、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IRF7蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），說明CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)；與模型組比較，菊苣酸中、高劑量組和地塞米松組MyD88、TLR9和IRF7蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），菊苣酸高劑量組和地塞米松組p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），證實(shí)菊苣酸在膿毒癥腸損傷中具有顯著的抗炎活性。

圖8 菊苣酸對(duì)腸損傷小鼠回腸組織中TLR9/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

膿毒癥是一種危及生命的炎癥綜合征，在全球范圍內(nèi)有很高的死亡率。多年來，隨著對(duì)膿毒癥研究的不斷加深，膿毒癥的臨床定義標(biāo)準(zhǔn)也在不斷更新，免疫病理和發(fā)病機(jī)制正在逐漸明確[14]，目前的干預(yù)治療策略可以分為靶向損傷相關(guān)分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs）（包括宿主細(xì)胞應(yīng)激）、靶向病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）、靶向炎癥介質(zhì)（抗炎）、免疫防御調(diào)節(jié)、內(nèi)皮屏障穩(wěn)定及恢復(fù)血管抗凝血屬性6類[15]。MacFie等提出了腸源性膿毒癥的概念，近年來被臨床研究者逐漸認(rèn)可，并應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)腸源性感染治療的有效性進(jìn)行研究[16]。已根據(jù)膿毒癥的發(fā)展特征建立了多種膿毒癥動(dòng)物模型，其中CLP誘導(dǎo)的膿毒癥模型是實(shí)驗(yàn)研究過程中最常用的模型，也被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)模型[17-18]。因此，本研究采用CLP誘導(dǎo)的膿毒癥模型探討了菊苣酸對(duì)膿毒癥小鼠腸道損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

膿毒癥發(fā)病的根源以及貫穿整個(gè)膿毒癥病程的主要原因是機(jī)體對(duì)抗炎癥的失衡，宿主為抵抗病原體產(chǎn)生一系列的促炎因子，從而激活先天免疫系統(tǒng)，生物學(xué)上解釋為模式識(shí)別受體識(shí)別到DAMPs或PAMPs[19]。TLR家族是一類重要的模式識(shí)別受體，在已發(fā)現(xiàn)的TLR家族蛋白中，TLR9在腸道疾病機(jī)制研究中發(fā)揮了重要作用。TLR9位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，具有I型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別細(xì)菌和病毒中非甲基化DNA基序并募集到MyD88信號(hào)分子與其結(jié)合，導(dǎo)致下游NF-κB和轉(zhuǎn)錄因子IRF7的激活，NF-κB負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)產(chǎn)生炎癥因子風(fēng)暴，IRF7負(fù)責(zé)介導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生[20]。

本研究結(jié)果顯示，菊苣酸顯著降低膿毒癥小鼠回腸組織中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，改善CLP誘發(fā)的膿毒癥小鼠腸損傷癥狀，包括減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和腸絨毛損傷、恢復(fù)腸黏膜層，表明菊苣酸對(duì)腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選到與炎癥相關(guān)的調(diào)控通路TLR9/NF-κB，此前研究也發(fā)現(xiàn)，姜黃素[21]、桃仁承氣湯[22]、炎調(diào)方[23]能夠通過TLR9/NF-κB通路發(fā)揮對(duì)膿毒癥腸損傷的保護(hù)作用。Western blotting結(jié)果顯示，模型組小鼠腸組織中TLR9/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，菊苣酸給藥后小鼠腸組織中關(guān)鍵蛋白表達(dá)下調(diào)，且呈劑量相關(guān)性。表明菊苣酸可能通過調(diào)節(jié)TLR9，進(jìn)而調(diào)控NF-κB通路緩解膿毒癥模型小鼠的腸損傷。

綜上，本研究通過建立CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)菊苣酸對(duì)膿毒癥腸損傷具有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制TLR9/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，減低腸組織的炎性反應(yīng)從而改善小鼠的腸損傷。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chicory acid improves intestinal injury in mice with sepsis by regulating TLR9/ NF-κB pathway

SHENG Shuang-shuang1, SUN Shao-xin1, FENG Shuai1, LI Feng1, WANG Huan2, LI Jian2

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Shandong University of Chinese Medicine, Jinan 250014, China

To study the effect and mechanism of chicory acid on intestinal injury in mice with sepsis.Sixty male C57 mice were randomly divided into control group, model group, dexamethasone (5 mg/kg) group, cichoric acid high-, medium-, and low-dose (40, 20, 10 mg/kg) groups, with 10 mice in each group. The sepsis mouse model was induced by cecal ligation and perforation surgery (CLP) 3 d after ip administration to each group. After successful modeling, mice were continuously administered for 48 h, and HE staining was used to observe pathological changes in intestinal tissue; ELISA was used to detect levels of tumor crossing factor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) and IL-1β in intestinal tissue; Intestinal tissue samples from control group, model group and cichoric acid medium-dose group were taken, and transcriptomic analysis based on Illumina sequencing platform was performed; Western blotting was used to detect expressions of Toll-like receptor 9 (TLR9), myeloid differentiation factor 88 (MyD88), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), p-NF-κB p65 and interferon regulatory factor 7 (IRF7) proteins in intestinal tissue.Compared with model group, the degree of intestinal mucosal damage in each treatment group was significantly improved, and the levels of inflammatory factors in intestinal tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01). Transcriptomics analysis showed that compared with control group, a total of 1140 differentially expressed genes were analyzed in model group; Compared with model group, a total of 497 differentially expressed genes were analyzed in administration group, all of which were enriched in NF-κB signaling pathway. Compared with model group, expressions of TLR9, MyD88, p-NF-κB p65 and IRF7 proteins in intestinal tissue after administration of cichoric acid were significantly reduced (< 0.05, 0.01).Chicory acid may ameliorate sepsis-induced intestinal mucosal injury through TLR9/NF-κB signaling pathway.

chicory acid; sepsis; intestinal injury; inflammatory factors; transcriptomics; TLR9/NF-κB pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5952 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.013

2023-04-24

國(guó)家科技重大專項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2017ZX09301058）；山東省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（ZR2021QH111）；2022年全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（國(guó)中醫(yī)藥人教函[2022]75號(hào)）

盛雙雙（2000—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與活性成分研究。Tel: 17860505243 E-mail: 1348588751@qq.com

李 健，女，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與活性成分研究。Tel: 13708928056 E-mail: 770815488@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]