李子正蔡廷陽李元鑫楊婧張蕾蕾燕志翔褚鵬飛孟維偉王旭清

(1. 聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東聊城 252000；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟南 250100)

玉米(Zea maysL.)作為我國三大主糧作物之一，廣泛種植于我國北方地區(qū)，產(chǎn)量已超過稻谷、小麥[1]。 玉米生長除遭受干旱、高溫及土壤營養(yǎng)不足等非生物脅迫外，病蟲害也是影響玉米產(chǎn)量形成的重要因素[2]。 近年來，隨著玉米單產(chǎn)和種植面積增加，化肥和化學(xué)農(nóng)藥用量逐年升高，加劇了土壤營養(yǎng)流失和微生物多樣性喪失，導(dǎo)致植食性害蟲抗藥性增加[3]。 因此，人們陸續(xù)實施可持續(xù)糧食生產(chǎn)系統(tǒng)行動和戰(zhàn)略，如有害生物綜合管理(IPM)和發(fā)展有機農(nóng)業(yè)等[4-5]，其中一項重要措施是生物防治劑(BCAs)的應(yīng)用，即基于微生物及其代謝產(chǎn)物控制病蟲害對作物的危害，增強植物對非生物脅迫的“免疫力”和促進作物生長等[6-7]。

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)作為木霉屬最常見的菌種，廣泛存在于土壤、植物殘體及根際等[8]。 有研究表明其在植物體內(nèi)的定殖可以發(fā)揮防治植物病原菌和促進植物生長的雙重作用[9-10]，一些哈茨木霉菌株的定殖可通過直接作用或間接誘導(dǎo)植物防御機制來抵御害蟲的危害[11]。 亦有研究證實，某些昆蟲病原真菌[如球孢白僵菌(Beauveria basssiana)]可通過人工接種的方式定殖于多種作物體內(nèi)(如玉米、小麥、高粱等)[12-13]，并作為內(nèi)生菌以直接或間接的方式提高植物對病蟲害[14-15]或干旱等不良環(huán)境[16]的抗性，還可改善植物對養(yǎng)分的吸收，刺激生長類激素產(chǎn)生，促進植物生長[17]。

目前，生物防治劑的研發(fā)從單一有益菌的使用逐漸轉(zhuǎn)向多菌種聯(lián)合應(yīng)用，以發(fā)揮對植物更積極的影響[18]。 Shrivastava 等[19]研究指出，叢植菌根(AMF)與球孢白僵菌聯(lián)合施用條件下，番茄植株部分萜類物質(zhì)(如單萜、倍半萜、新單萜)含量顯著增加，甜菜夜蛾危害顯著減少。 Farias 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉、球孢白僵菌、金龜子綠僵菌、厚垣普奇尼亞菌、棘孢木霉5 種菌株聯(lián)合施用顯著促進大豆和玉米生長。 Batool 等[21]研究指出，球孢白僵菌與棘孢木霉聯(lián)合處理種子的玉米株高、產(chǎn)量顯著增加，同時有效降低了亞洲玉米螟的危害，植株體內(nèi)的過氧化物酶和過氧化氫酶等防御酶活性以及脯氨酸含量提高，且與茉莉酸-乙烯信號通路及抗氧化酶相關(guān)的基因表達量增加。

本研究分析球孢白僵菌與哈茨木霉單獨或聯(lián)合土壤施用條件下玉米苗期干物質(zhì)積累量、農(nóng)藝性狀、光合特性和抗性相關(guān)酶活性的變化規(guī)律，旨在探明兩種生防真菌對玉米苗期生長的影響及其誘導(dǎo)玉米植株抗性的協(xié)同效應(yīng)，以期為球孢白僵菌與哈茨木霉在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的聯(lián)合施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的球孢白僵菌菌株購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，該菌株來源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，菌種保存號為ACCC No. 30110；哈茨木霉菌株由德國哥廷根大學(xué)植物保護系提供，菌株號為T39。 供試玉米品種為黃淮海地區(qū)廣泛種植的鄭單958。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 試驗設(shè)計試驗共設(shè)置4個處理:CK(無菌水施用土壤)、BB(球孢白僵菌孢懸液施用土壤)、TH(哈茨木霉孢懸液施用土壤)和BB+TH(球孢白僵菌與哈茨木霉孢懸液聯(lián)合施用土壤)。

1.2.2 孢子懸浮液的制備將球孢白僵菌孢子粉接種至PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，刮去孢子粉并用無菌水(含0.1% Tween80)混勻，通過內(nèi)置脫脂棉的滅菌注射器過濾殘渣，置于磁力攪拌器上充分振蕩混勻15 min 后，使用Neubauer 血細胞計數(shù)板計算孢子數(shù)量。 接種前將孢子懸浮液調(diào)整至1 × 108conidia/mL 備用。 在PDA 培養(yǎng)基上進行孢子萌發(fā)試驗，萌發(fā)率達到90%以上方可使用。 哈茨木霉孢懸液制備同球孢白僵菌的方法，接種前將孢子懸浮液調(diào)整至1 ×107conidia/mL 備用。

1.2.3 玉米種植及菌株接種玉米種子消毒參考Akello 等[22]的方法，略有改動。 種子在70%乙醇中表面消毒3 min，1.5%次氯酸鈉表面消毒3 min，然后用無菌水沖洗3 次。 吸取100 μL 沖洗水在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進行消毒效果評價。

將泥炭土與蛭石按照2∶1 的比例混勻后裝入塑料花盆(15 cm×15 cm×20 cm)。 每盆種兩粒玉米種。 溫室條件(25 ℃±1 ℃，每天光照14 h、黑暗10 h，相對濕度75%)下生長至三葉一心，分別于幼苗根際附近均勻施入孢子懸浮液10 mL，連續(xù)2 d 各施用1 次，第2 次施用的第2 天開始記錄接種天數(shù)。 隨后將玉米放在溫室條件下生長。所有花盆每周澆水施肥1 次，以保證幼苗正常生長發(fā)育。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 不同菌株在玉米植株內(nèi)的定殖率接種后10、20、30 d，每個處理選取5 株玉米的根、莖、葉分別進行測定。 根、莖、葉清洗后分別用1.5%次氯酸鈉表面消毒3 min，再用70%乙醇表面消毒3 min，用100 μL 無菌水沖洗3 次[23]后在無菌濾紙上干燥。 將已消毒處理的根、莖和葉切成約0.5 cm2的小塊放入PDA 培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿放置同一植株同一器官的9 份樣品，(25±2) ℃避光培養(yǎng)21 d，定期觀察真菌生長情況。 最后沖洗的100 μL 無菌水在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 周，用以檢測是否有菌絲生長，確定消毒效果[23]。 根據(jù)公式計算定殖率:定殖率＝生長菌絲的樣品數(shù)/樣品總數(shù)[24]。 每處理重復(fù)5 次。

1.3.2 玉米生長指標接種后10、20、30 d，每處理選玉米5 株，使用SPAD-502Plus 葉綠素儀(日本KONICA MINOLTA 公司)測定葉片SPAD 值；挖取玉米整株，測量株高、莖粗、最大葉長和葉寬，統(tǒng)計葉片數(shù)；將其地上部和地下部分別裝入紙袋，75 ℃烘干后稱重，計算干物質(zhì)積累量和根冠比。

1.3.3 玉米葉片光合特征參數(shù)接種后第3 天和第7 天選取完全展開的功能葉，用便攜式光合儀(CIRAS-2，美國漢莎科學(xué)儀器有限公司)測定功能葉凈光合速率(Pn)和氣孔導(dǎo)度(Gs)。

1.3.4 玉米葉片光合色素含量和生理指標接種后第3 天和第7 天選取完全展開的功能葉，取樣后立即用液氮冷凍，在-80℃超低溫冰箱中保存。 采用分光光度計法測定玉米葉片光合色素含量[25]，分別在470、645、663 nm 處測定吸光度。采用氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性，分別在560、240、470 nm 測定吸光度[26]。 每個指標重復(fù)測定5 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，通過Duncan’s 法進行多重比較，采用GraphPad Prism8 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下玉米植株不同部位真菌定殖率分析

由表1 可知，與CK 比較，不同采樣時期玉米各器官均有一定比例的菌定殖。 BB 處理條件下，接種后10 d，莖和根中的菌定殖率達到最高，分別為51.00%和37.60%，根、莖、葉中的菌定殖率表現(xiàn)為莖＞根＞葉；接種后20 d，葉中的菌定殖率達到最高，為31.00%。 TH 處理條件下，根、莖、葉中的菌定殖率均在接種后10 d 達到最高，分別為84.60%、28.60%、13.20%。 BB+TH 處理下根、莖、葉中的菌定殖率均在接種后10 d 達到最高，分別為82.40%、75.60%、39.80%。

表1 不同處理玉米植株不同部位真菌定殖率 %

2.2 不同處理對玉米苗期生長指標的影響

2.2.1 對苗期干物質(zhì)積累的影響由表2 可知，球孢白僵菌和哈茨木霉單獨或聯(lián)合土壤施用條件下，3個采樣時期玉米植株地上部干重、根干重和總生物量較CK 均有一定增加。 其中，BB+TH 處理下3個采樣時期的地上部干重、根干重和總生物量均最高。 接種后30 d，地上部干重、植株總生物量處理間差異顯著，均表現(xiàn)為BB+TH ＞TH ＞BB＞CK。 接種后10 d 時BB 處理的根冠比顯著低于CK，接種后30 d 時TH 和BB+TH 處理的根冠比顯著低于CK，其余時期各處理間差異不顯著。

表2 不同處理玉米苗期單株干物質(zhì)積累量

2.2.2 對苗期農(nóng)藝性狀及SPAD 值的影響接種后10 d，各處理的株高、莖粗及最大葉寬和葉長變化規(guī)律一致，均表現(xiàn)為BB+TH ＞TH ＞BB ＞CK。BB+TH 處理的株高、莖粗、最大葉長和葉寬較CK分別顯著增加15.08%、10.59%、9.43%、4.85%(圖1A～D)；各處理間葉片數(shù)無顯著差異(圖1E)；BB+TH、TH、BB 處理的葉片SPAD 值均顯著高于CK，BB+TH 與TH 和BB 處理間差異顯著，TH 與BB 處理間差異不顯著(圖1F)。

圖1 不同處理下玉米苗期農(nóng)藝性狀及SPAD 值

接種后20 d，各處理的株高和莖粗變化規(guī)律一致，均表現(xiàn)為BB+TH＞TH＞BB＞CK。 BB+TH 處理的株高和莖粗較CK 分別顯著增加13.88%和12.70%(圖1A、B)。 各處理的最大葉寬、最大葉長、葉片數(shù)和葉片SPAD 值變化規(guī)律一致，均表現(xiàn)為BB+TH＞BB＞TH＞CK。 BB+TH 處理的最大葉長、最大葉寬和葉片SPAD 值較CK 分別顯著增加17.71%、4.34%和8.82%。 各處理間葉片數(shù)無顯著差異。 BB+TH、TH、BB 處理的葉片SPAD 值均顯著高于CK；BB+TH、TH 處理間差異顯著，但與BB 處理間差異均未達顯著水平(圖1C～F)。

接種后30 d，BB+TH、TH、BB 處理的株高和莖粗均顯著高于CK，BB+TH 處理的株高和莖粗較CK 分別顯著增加12.52%、14.38%(圖1A、B)。BB 和BB+TH 處理的最大葉長和最大葉寬均顯著高于CK，BB+TH 處理的最大葉長和最大葉寬較CK 分別顯著增加9.14%和15.96%，BB 處理則較CK 分別顯著增加4.84%和8.45%(圖1C、D)。各處理間葉片數(shù)無顯著差異(圖1E)。 BB+TH、TH、BB 處理的葉片SPAD 值均顯著高于CK，其中，BB+TH 處理較CK 顯著增加9.11%，且顯著高于BB 和TH 處理，BB 與TH 處理間差異不顯著(圖1F)。

上述結(jié)果表明，單獨或聯(lián)合施用球孢白僵菌和哈茨木霉，玉米植株的農(nóng)藝性狀指標及SPAD值均有一定程度增加，以聯(lián)合施用效果最好。

2.3 不同處理對玉米葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度的影響

圖2 顯示，與CK 相比，各處理接種后第3 天和第7 天的葉片凈光合速率和氣孔導(dǎo)度均有一定增加，以BB+TH 處理的提升幅度最大。

圖2 不同處理玉米葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度

接種后3 d，各處理間葉片的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度無顯著差異；接種后7 d，BB、BB+TH 處理的凈光合速率分別較CK 顯著提高6.39%、9.18%，BB+TH 處理的氣孔導(dǎo)度較CK 顯著提高14.14%。

表明單獨或聯(lián)合接種球孢白僵菌和哈茨木霉均能提高玉米葉片凈光合速率，增加氣孔導(dǎo)度，進而提高光合產(chǎn)物形成，促進玉米生長。

2.4 不同處理對玉米葉片光合色素含量的影響

與CK 相比，BB、TH 和BB+TH 處理接種后第3 天和第7 天玉米葉片光合色素含量均有一定程度的增加(圖3)。

圖3 不同處理玉米葉片光合色素含量

接種后3 d，BB、BB+TH 處理葉綠素a 和葉綠素a+b 含量分別較CK 顯著提高6.34%、6.82%和5.98%、6.46%，TH 處理與CK 無顯著差異；各處理的葉綠素b 和類胡蘿卜素含量與CK 均無顯著差異。

接種后7 d，BB、TH、BB+TH 處理葉片葉綠素a、b 含量分別較CK 顯著提高7.64%、10.86%、10.26%和4.97%、9.00%、7.28%；BB、TH、BB+TH處理的葉綠素a+b 和類胡蘿卜素含量分別較CK顯著提高6. 98%、10. 40%、9. 51% 和8. 12%、12.33%、9.55%。

上述結(jié)果表明單獨或聯(lián)合施用球孢白僵菌和哈茨木霉均能增加玉米幼苗在接種初期的葉片葉綠素含量，為光合能力的提升和后期生長發(fā)育提供有力條件。

2.5 不同處理對玉米葉片抗性相關(guān)酶活性的影響

圖4顯示，各處理接種后第3 天和第7 天的CAT、SOD 和POD 活性均較CK 有所提高，部分處理間差異顯著。

圖4 不同處理玉米葉片抗性相關(guān)酶活性

接種后3 d，BB+TH 處理葉片CAT 活性較CK 顯著提高6.02%；BB 處理葉片SOD 活性較CK顯著提高10.37%。 BB 和BB+TH 處理葉片POD活性分別較CK 顯著提高4.93%和7.67%。

接種后7 d，BB、TH、BB+TH 處理葉片CAT、SOD、POD 活性均顯著高于CK，處理間表現(xiàn)為BB+TH＞TH＞BB＞CK。 BB+TH 處理葉片CAT、SOD、POD活性較CK 分別顯著提高16.23%、25.49%、19.64%；TH 處理葉片CAT、SOD、POD 活性較CK 分別顯著提高13.20%、20.22%、16.58%；BB 處理葉片CAT、SOD、POD活性較CK 分別顯著提高11.26%、16.41%、13.78%。

表明真菌單獨或聯(lián)合接種初期玉米抗性相關(guān)酶活性提高，使玉米產(chǎn)生誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性，從而減輕外界不良因素對玉米幼苗的傷害。

3 討論與結(jié)論

Wei 等[27]發(fā)現(xiàn)在土壤施用條件下能夠檢測到球孢白僵菌在番茄植株根、莖、葉中的定殖且定殖率較浸種處理高。 Jaber 等[28]研究指出，球孢白僵菌土壤施用后其在甜椒莖和根內(nèi)的定殖率最高且較為穩(wěn)定。 影響內(nèi)生生防真菌在玉米中定殖的因素有很多，包括栽培介質(zhì)、接種方法、表面活性劑特性、菌株種類等[29]。 Batool 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌與棘孢木霉聯(lián)合土壤施用下能夠從根部傳播至葉片。 本研究同樣發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌和哈茨木霉聯(lián)合土壤施用下，能夠從根部轉(zhuǎn)移至葉片內(nèi)，且在玉米植株不同部位均檢測到其定殖。此外，本試驗條件下，兩種真菌均能在玉米植株內(nèi)定殖，單獨施用時哈茨木霉更易在根部定殖，而球孢白僵菌在莖內(nèi)的定殖率更高。 當(dāng)兩種真菌聯(lián)合施用時，兩者在根部和莖部均有較高的定殖率。

前人研究證實球孢白僵菌和哈茨木霉單獨施用均具有促進植物生長的作用。 Gonzalez-Guzman等[30]研究表明，土壤施用球孢白僵菌能顯著增加小麥總根長和莖伸長階段的根表面積以及細根的根長和根表面積。 Pachoute 等[31]研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌在土壤施用條件下顯著提高豇豆植株的株高、葉片數(shù)和生物量，其葉片氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、CO2同化率以及葉綠素a+b 含量亦顯著升高。Shukla 等[32]指出，哈茨木霉在水稻根部的定殖促進根系生長。 齊素敏等[33]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉根部定殖能夠顯著增加草莓植株的生物量、產(chǎn)量和葉綠素含量。 Batool 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌和棘孢木霉聯(lián)合施用較兩種生防真菌單獨施用更有利于促進玉米生長和產(chǎn)量形成。 本試驗表明土壤施用條件下，球孢白僵菌和哈茨木霉單獨施用均能促進玉米地上部和地下部生長，葉綠素含量亦增加，且兩種真菌聯(lián)合施用對玉米幼苗生長發(fā)育的促進效果更顯著，但其協(xié)同機制尚需進一步研究。

有研究指出，生防真菌的定殖能夠誘導(dǎo)植物自身誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性和獲得系統(tǒng)性抗性，以提高其對病蟲害等不良外界環(huán)境的適應(yīng)能力:Tomilova 等[34]通過浸根的方式分別將球孢白僵菌和羅伯茨綠僵菌接種到馬鈴薯體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌浸根處理植株的SOD 活性和POD 活性有一定程度的增加；費泓強等[35]研究表明，球孢白僵菌的定殖能夠增加玉米幼苗POD、SOD、CAT、PAL、PPO 活性，有利于提高玉米幼苗抗逆性；許紹歡等[36]研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌和摩西球囊霉菌混合接種能夠顯著提高成熟期煙草植株的CAT、POD、SOD 活性，進而提高其抗逆性。 本試驗結(jié)果表明，球孢白僵菌的定殖可增加CAT、SOD、POD 活性，從而提高植株的抗逆性，且球孢白僵菌和哈茨木霉聯(lián)合接種處理葉片的酶活性均最高。

球孢白僵菌和哈茨木霉作為農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中常見的昆蟲病原真菌和病原拮抗真菌，探明兩種真菌使用的最佳方式和濃度，能夠減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的施用，不僅提高生產(chǎn)者的農(nóng)業(yè)收入，而且還促進農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。 本試驗條件下，哈茨木霉和球孢白僵菌聯(lián)合土壤施用(BB+TH)時，其在玉米植株不同部位的定殖率明顯高于其他處理，且在根部的定殖率最高；BB+TH 處理下3個采樣時期的地上部干重、根干重和總生物量均最高，植株農(nóng)藝性狀及葉片SPAD 值表現(xiàn)最優(yōu)，明顯提高葉片葉綠素含量，提高玉米葉片凈光合速率，增加氣孔導(dǎo)度；聯(lián)合施用處理葉片CAT、SOD、POD 活性顯著高于CK 和單球孢白僵菌處理(BB)，較CK 分別顯著提高16.23%、25.49%、19.64%。 本研究結(jié)果可為兩種有益微生物的聯(lián)合施用提供理論參考。