潘曉威 孫愛娣 潘 政 梁耀輝 葉劍芝*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東 湛江 524001;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 熱帶作物學(xué)院,云南 普洱 665000)

橡膠籽(Rubber Seed)為一種橡膠樹種子,由淺黃褐色并帶有許多銀灰色帶狀斑紋的硬皮質(zhì)種殼和種仁構(gòu)成[1-2]。橡膠籽粕富含大量的人體必需脂肪酸和多種蛋白質(zhì)及各種人體必需氨基酸,是天然熱帶蛋白質(zhì)飼料的優(yōu)質(zhì)原料,橡膠種殼可以生產(chǎn)活性炭,木塑產(chǎn)品等[3-4],具有生物可降解性和無毒特性,其殼制備的活性炭可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、工業(yè)等多個領(lǐng)域[5]。橡膠籽仁主要由油脂、蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉組成,其中油脂含量最為豐富,占種仁的50% 以上[6]。

據(jù)調(diào)查,大量橡膠籽未被有效利用而被直接丟棄,WEN等[7]估計(jì)亞洲每年平均生產(chǎn)超過1 300萬t橡膠籽,膠園里生產(chǎn)的大量種子僅有少部分用于育種,其余大量的種子長期廢棄在膠園里,造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。因此有必要加強(qiáng)對橡膠籽開發(fā)利用的研究。

無機(jī)元素的含量與分布關(guān)系到植物的使用功效和營養(yǎng)價值,具有重要的研究價值[8]。目前,有關(guān)橡膠籽的研究多集中在橡膠籽油或者橡膠籽粕等領(lǐng)域的開發(fā)利用[9-12],或關(guān)于氨基酸等植物化學(xué)成分的相關(guān)研究[13],在無機(jī)元素含量分布領(lǐng)域的研究還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。在無機(jī)元素分析中,主要有原子吸收光譜儀、原子熒光光譜儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)等設(shè)備進(jìn)行檢測[14-15],其中具備準(zhǔn)確性高、精密度好、抗干擾能力強(qiáng)、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)的ICP-MS 法在食品、環(huán)境等檢測領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用[16-17]。

數(shù)據(jù)分析中常用的主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)和聚類分析法(Cluster Analysis,CA)等多元統(tǒng)計(jì)分析方法可將多個變量(多指標(biāo))的數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理,將批量數(shù)據(jù)合理地簡化為少數(shù)幾個綜合數(shù)據(jù)[18]。

為全面評價橡膠籽的品質(zhì),本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地橡膠籽(海南、廣東、云南、廣西、臺灣、福建)作為研究對象,通過微波消解法結(jié)合ICP-MS內(nèi)標(biāo)法同時檢測橡膠籽中Mg、K、Ca、Zn、Ti、Cu、Mn、Ni、Cr、Ba、Co、Cd、Se、Pb、V、As等16種無機(jī)元素的含量,分析不同產(chǎn)地橡膠籽中元素的含量差異,通過主成分分析和聚類分析篩選其特征元素,進(jìn)行橡膠籽中無機(jī)元素的差異性分析,為我國橡膠籽的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供有力的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

所用橡膠籽分別采自云南、廣東、廣西、海南、福建、臺灣等6個產(chǎn)地(編S1～S5為云南、S6～S8為廣東、S9～S11為廣西、S12～S15為海南、S16～S17為福建、S18為臺灣),分別挑選飽滿、無壞損的橡膠籽,充分晾干后去殼,分別搗碎、研磨成粉末,分裝并貼好標(biāo)簽備用。

消解試劑如無特別說明,均為優(yōu)級純,實(shí)驗(yàn)用水為二級水,HNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68%。

Mg、K、Ca、Zn、Ti、Cu、Mn、Ni、Cr、Ba、Co、Cd、Se、Pb、V、As等單元素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1 000 mg/L),采購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 主要設(shè)備

X series Ⅱ 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾),AUY120電子天平(日本島津),FW100高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特),MARS6全自動微波消解萃取儀(美國CEM公司),VB24 UP智能樣品趕酸器(北京萊伯泰科)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取 0.4 g(精確至 0.1 mg)制備好的橡膠籽粉末于消解罐中,加入8 mL硝酸后,預(yù)消解2 h,待冷卻后根據(jù)表1程序進(jìn)行微波消解。

表1 微波消解程序

微波消解結(jié)束待冷卻后擰開內(nèi)外蓋排除氣體,此時消解液呈淡黃色,150 ℃趕酸2 h,消解液冷卻至室溫,此時消解液清澈透明無沉淀,將其轉(zhuǎn)移至 25 mL 比色管中,并用去離子水清洗消解管2～3次,定容至刻度,混勻備用,同時做空白樣品實(shí)驗(yàn)[19]。

待測液在ICP-MS工作條件下進(jìn)行測定。開機(jī)穩(wěn)定20 min,測試之前將儀器狀態(tài)調(diào)至最優(yōu)。測試過程中確保儀器的吸液速率是恒定的[20]。

儀器工作條件見表2。

表2 ICP-MS測定參數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2010 軟件建立不同產(chǎn)地橡膠籽樣品元素含量的原始數(shù)據(jù)文檔,采用 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著性水平為P<0.05。所采用的數(shù)據(jù)均為3次平行的測定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的線性關(guān)系與檢出限

在設(shè)定的儀器條件下測定制備好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定結(jié)果見表3,各元素線性相關(guān)系數(shù)r均在0.999以上,說明各元素在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各樣品測定結(jié)果

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

在設(shè)定的儀器條件下,測定經(jīng)處理的11個空白溶液,根據(jù)11次測定結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差,得到方法檢出限。由表3可知,橡膠籽中各元素的方法檢出限在0.000 7～0.53 mg/kg,滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 精密度與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

按建立的檢測方法進(jìn)行處理并測定,平行測定6次,計(jì)算得到16種元素測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～8.9%,均小于10%,說明該實(shí)驗(yàn)所用的測定方法重復(fù)性較好。

在橡膠籽中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液,按建立的檢測方法進(jìn)行處理并測定,計(jì)算加標(biāo)回收率與RSD,結(jié)果表明,加標(biāo)回收率為86.0%～96.3%,RSD為1.1%～8.8%,表明所建立的檢測方法準(zhǔn)確可靠,可用于橡膠籽中多元素的快速分析。

2.3 橡膠籽中無機(jī)元素含量

取6個產(chǎn)地樣品,按照建立的檢測方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測定。根據(jù)表3的結(jié)果,不同產(chǎn)地橡膠籽中均含有豐富的Mg、K、Ca、Ti、Mn、Ni、Zn等無機(jī)元素,且各類元素含量也存在較大差異。我國海南、云南、廣東、臺灣、福建、廣西等6個產(chǎn)地橡膠籽中Mg元素含量最高,均在10 g/kg 以上,最高值可達(dá)33 g/kg;K元素含量達(dá)4 000～9 122 mg/kg;Ca元素含量達(dá)382～1 433 mg/kg;Zn元素含量在300 mg/kg以上;Ti、Cu、Mn、Ni含量也均在100 mg/kg以上。相對于一般的食品,橡膠籽中有害無機(jī)金屬As含量較低,均為未檢出,但Pb、Cd等重金屬含量較高,在食用產(chǎn)品開發(fā)過程中需注意控制,避免產(chǎn)品中重金屬含量超過食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的限量值,對人體造成傷害,進(jìn)而損害橡膠籽的食用產(chǎn)業(yè)開發(fā)前景。

對6個產(chǎn)地橡膠籽的 15種元素進(jìn)行方差分析(表4),結(jié)果表明,6個產(chǎn)地橡膠籽樣品中的 Cr、Co、Cd、Ba、Pb、V、Se、Ti、Mn、Ni、Cu、Zn、Ca、K、Mg在地域之間存在顯著差異(P<0.05)。不同產(chǎn)地橡膠籽樣品中的元素含量各有特點(diǎn)。臺灣產(chǎn)地橡膠籽中鎂元素含量顯著高于其他五個產(chǎn)地(P<0.05),福建鎂元素最低,而鉀元素低于其他五個產(chǎn)地(P<0.05);廣東產(chǎn)地鈣元素最高;6個產(chǎn)地中鋅、鈦、銅、錳、鎳含量相似且鋅元素明顯高于其他四種元素。在廣西與海南鉻元素顯著低于其他產(chǎn)地(P<0.05),而云南、廣東、福建、臺灣產(chǎn)地鉻元素含量相接近;云南鋇元素顯著低于其他產(chǎn)地(P<0.05);云南、廣東和臺灣產(chǎn)地元素鈷顯著高于其他產(chǎn)地(P<0.05),廣東和海南鎘元素含量顯著低于另外4個產(chǎn)地。因此,從橡膠籽中多元素的含量差異可以看出其無機(jī)元素含量受不同生長土壤、水文等環(huán)境因素的影響,與朱周俊等[21-22]的研究結(jié)果基本一致。

表4 不同產(chǎn)地橡膠籽測定結(jié)果

2.4 無機(jī)元素圖譜

以元素種類為橫坐標(biāo)、相對含量為縱坐標(biāo)繪制無機(jī)元素指紋圖譜,由于6種產(chǎn)地橡膠籽中16種無機(jī)元素含量數(shù)量級差別較大,故將其調(diào)整至同一數(shù)量級(Se、V擴(kuò)大1 000倍,Pb擴(kuò)大100倍,Cd、Co擴(kuò)大10倍,Ti、Ni、Mn、Cu縮小10倍,Ca、K縮小100倍,Mg縮小1 000倍)。由圖1 可知,不同產(chǎn)地橡膠籽元素相對含量的變化趨勢在一定程度上基本一致,說明橡膠籽在元素含量分布和元素種類上整體接近,但也能看出有部分元素在不同產(chǎn)地的相對含量存在一定差異,不同產(chǎn)地的環(huán)境因素還是會導(dǎo)致種植物含量的差異,借此也可通過差異性信息來分析不同產(chǎn)地的變化情況。

圖1 不同橡膠籽無機(jī)元素圖譜

2.5 主成分(PCA)分析

主成分分析法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,通過降低維度的作用提取出少數(shù)幾個相互無關(guān)而又能夠充分反映原始變量信息的綜合指標(biāo)(即主成分)。剔除未檢出的元素As,以不同產(chǎn)地15種無機(jī)元素的含量為指標(biāo)進(jìn)行主成分分析(PCA),對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理[23],得到各主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率(表5)。主成分分析結(jié)果顯示,前4個主成分(PCA1-PCA4)的特征值分別為6.370、3.211、1.677、1.145,方差貢獻(xiàn)率分別42.468%、21.403%、11.182%、7.637%,累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.69%,可知前4個主成分即能夠代表橡膠籽中無機(jī)元素的整體特征信息,故對前4個成分的載荷矩陣進(jìn)行深入分析。由表6可知,前4個主成分與部分元素正相關(guān)性,第1主成分PCA1與Co、V、Cu元素呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)>0.9),第2主成分PCA2與Se、Ti元素呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)>0.8),第3主成分PCA3與Pb元素呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)>0.9),第4主成分PCA4與Cr元素呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)>0.6),前4個主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為82.69%,超過總方差的80%,因此Co、V、Cu、Se、Ti、Pb、Cr這七種元素是橡膠籽的特征元素,是能顯著影響橡膠籽中無機(jī)元素組成的主要綜合指標(biāo)。

表5 各主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率

表6 主成分載荷矩陣

2.6 聚類分析

對18批橡膠籽樣品中的16種無機(jī)元素含量采用組間聯(lián)接方法、系統(tǒng)聚類分析法進(jìn)行聚類分析,進(jìn)一步簡化分析數(shù)據(jù)。當(dāng)歐式距離平方和為5 時,18個樣品可被分為4大類,結(jié)果見圖2。第1類:S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S11、S12、S14、S15;第2類:S9、S10、S13;第3類:S16、S17;第4類:S18。其中,第1類樣品分別來自于廣東、廣西、海南和云南;第2類樣品分別來自于海南和廣西;第3類樣品來自于福建,第4類樣品來自于我國臺灣,顯示了一定的差異性。由此也可看出,不同的種植氣候、土壤、地理空間造成了土壤中微量元素的差異性,也間接影響了作物的生長狀況,從而導(dǎo)致植物吸收的元素組成不同[24]。

圖2 橡膠籽聚類分析結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了微波消解結(jié)合ICP-MS內(nèi)標(biāo)法同時測定橡膠籽中的Mg、K、Ca、Zn、Ti、Cu、Mn、Ni、Cr、Ba、Co、Cd、Se、Pb、V、As等16種無機(jī)元素的檢測方法。采用內(nèi)標(biāo)補(bǔ)償法,排除基體效應(yīng)對多元素產(chǎn)生的抑制作用,最后,通過方法學(xué)驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。表明該檢測方法準(zhǔn)確、可靠,適用于橡膠籽中多元素的測定。

采用建立的ICP-MS法測定6個不同產(chǎn)地橡膠籽中16種無機(jī)元素的含量,建立各產(chǎn)地橡膠籽中無機(jī)元素指紋圖譜,通過主成分分析、聚類分析等方法對其元素分布規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明,不同產(chǎn)地橡膠籽中均含有豐富的Mg、K、Ca、Ti、Mn、Ni、Zn等無機(jī)元素,且各種元素含量存在較大差異。通過元素圖譜可以看出,橡膠籽在元素含量分布和元素種類上整體趨勢接近,其中有部分元素的不同產(chǎn)地相對含量存在一定差異,具有一定代表性。

以橡膠籽中15種無機(jī)元素含量進(jìn)行主成分分析,前4個主成分(Co、V、Cu、Se、Ti、Pb、Cr)對總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)82.69%,能夠代表橡膠籽中無機(jī)元素的整體特征信息,可初步認(rèn)為Co、V、Cu、Se、Ti、Pb、Cr是影響橡膠籽無機(jī)元素組成的特征元素,值得進(jìn)一步深入探討。通過對18批橡膠籽樣品中16種無機(jī)元素含量進(jìn)行聚類分析,可將18個樣品分為4大類,分屬于不同的地域,表明橡膠籽無機(jī)元素的含量與環(huán)境、地域等因素具有相關(guān)性。

本研究結(jié)果可為橡膠籽資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供更多可靠的數(shù)據(jù)支撐。