李超群,李 毅,張詠梅,陳君嬋,李 蒙,蘆 倩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心,蘭州 730070)

白刺是古老的第三紀(jì)孑遺植物[1],由于在獨立成科的問題上一直存在爭論[2],目前,分類學(xué)上普遍認(rèn)同白刺屬于蒺藜科白刺屬(ZygophyllceaeNitraria)。在世界范圍內(nèi)白刺屬被劃分為11種或13種,但絕大部分學(xué)者認(rèn)為有12種[3-6],在中國分布有8種,其中,唐古特白刺為中國特有種[7]。

花粉是植物開啟一生的關(guān)鍵因素之一,攜帶著大量的遺傳信息。其表面紋飾精巧,形態(tài)特殊,構(gòu)造奇特,在隨著環(huán)境的變化發(fā)展中,具有穩(wěn)定的遺傳保留性和呈現(xiàn)性[8-9]。因此,植物花粉的外部特征是分類學(xué)的重要指標(biāo)之一,對植物物種和品種的鑒定具有十分重要的意義[10]。潘曉玲等[2]依據(jù)果實和葉片性狀對白刺屬植物進行了分類,制作了分種檢索表,卻未考慮到花粉和種子等性狀具有較高的遺傳穩(wěn)定性。目前,關(guān)于白刺花粉研究的文獻較少。席以珍等[1]利用白刺屬化石花粉與現(xiàn)代花粉進行了對比研究,明確了白刺花粉形態(tài)的進化方向;努爾巴衣·阿布都沙力克等[11]利用臘葉標(biāo)本對蒺藜科5屬11種植物花粉的形態(tài)進行了研究,結(jié)果表明花粉表型性狀是可以作為區(qū)分5個屬之間的重要依據(jù),并且支持白刺屬升為白刺科;張曉明等[12]在內(nèi)蒙古收集白刺屬花粉,制作標(biāo)本后進行觀察研究,發(fā)現(xiàn)不同種之間存在差異,而且白刺屬植物可能正處于進化過程中的分化階段。唐古特白刺(Nitrariatangutorum)花粉的研究水平仍停留在白刺屬或種間,而對這一特有種的花粉未見詳細(xì)研究報道。相關(guān)文獻[10,13-15]證明植物在種間與種內(nèi)均有不同程度的遺傳多樣性,而同一植物個體產(chǎn)生不同的花粉形態(tài)有利于植物的進化,對此,研究唐古特白刺種內(nèi)花粉多樣性對于遺傳育種具有重要意義。甘肅地處青藏高原、黃土高原、蒙新高原和西秦嶺山地的交匯地帶,境內(nèi)地形地貌復(fù)雜、氣候多變[16],尤其是地處青藏高原向蒙新荒漠過渡的甘肅省河西走廊,大部分地區(qū)屬于中國中度和重度生態(tài)環(huán)境脆弱區(qū),白刺屬植物資源分布非常充足,可以提供豐富多樣的試驗材料。前人的試驗材料均來自標(biāo)本,而標(biāo)本花粉與自然狀態(tài)下的花粉存在明顯的差異[17]。本研究選用甘肅省不同地理的6個唐古特白刺家系花粉,采用冷凍干燥的方法,旨在發(fā)現(xiàn)唐古特白刺不同家系間花粉形態(tài)的變異,從種內(nèi)角度研究其花粉的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料收集

唐古特白刺試驗林位于甘肅省蘭州新區(qū)中川鎮(zhèn)倒水塘村(36°30′N,103°37′E),黃土高原的西北部,海拔1 947.2 m,年降水量328 mm,1月平均氣溫為-6.9 ℃,7月平均氣溫為22.2 ℃,屬于溫帶半干旱大陸性氣候,土壤均為堿性砂壤。試驗林由2011年收集的來自甘肅省武威、張掖和酒泉等地區(qū)的唐古特白刺自然群落的種子,建植成林。2020年6月20日選擇處于盛花期的、生長健壯的唐古特白刺家系(表1),每個家系隨機選擇3個單株收集新鮮花粉,低溫保存帶回實驗室。

表1 唐古特白刺家系的概況

1.2 預(yù)處理

將采集的新鮮花粉放入5 mL離心管中,將離心管蓋剪掉,用封口紙將管口封實,然后用小針在封口紙上留下4～6個小孔,冷凍干燥12 h。

1.3 掃描電鏡觀察花粉形態(tài)

取出預(yù)處理后的離心管于干燥器中恢復(fù)至室溫,將花粉均勻粘貼在雙面導(dǎo)電膠上。離子濺射儀進行噴金(Pt)1.5 min。然后在掃描電子顯微鏡(HITACHI S-3400N,日本)下觀察花粉的表面形態(tài),鏡下挑選30粒清晰花粉粒進行拍照,利用Photoshop測量花粉粒極軸長和赤道軸長等數(shù)據(jù)并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2019軟件統(tǒng)計花粉測量數(shù)據(jù),在此基礎(chǔ)上利用SPSS 18.0軟件對測量數(shù)據(jù)進行方差分析,統(tǒng)計各個家系間的異同,并計算變異系數(shù)(CV):CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%;后進行主成分分析,得到不同家系間變異的主要性狀,并將6個家系進行聚類分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古特白刺花粉的基本特征

6個唐古特白刺家系花粉均以單粒形式存在,極軸長為35.95～41.53 μm,赤道軸長為 18.34～22.52 μm,極軸長/赤道軸長(P/E)在 1.82～1.96,均為中等大小花粉,長球形,具三孔溝。家系zglq-14的花粉粒最大(41.53 μm× 22.52 μm),萌發(fā)溝長(36.94 μm±0.53 μm)占極軸長的91%,家系w3-1的花粉粒最小(35.95 μm×18.34 μm),萌發(fā)溝(30.21 μm±1.07 μm)占極軸長的84%;家系w3-1的萌發(fā)溝脊面最窄(11.90 μm±0.43 μm),家系j3-30的最寬(15.88 μm±0.20 μm)。而花粉在萌發(fā)溝特征、萌發(fā)溝脊面形狀及紋飾類型等方面存在顯著差異(表2、圖1)。

圖1 不同家系花粉表型性狀

表2 6個家系唐古特白刺性狀指標(biāo)值

萌發(fā)溝特征為(CG):①窄,存在縫隙;②寬,存在連接;③窄,存在連接;④窄,無連接;⑤寬,無連接。脊面形狀(垂直赤道軸觀察)為(GS):①兩極小,中間大;②變化不大;③兩極小,中間凹陷。萌發(fā)溝為赤道三孔溝,紋飾類型為(PT):①條狀,腦狀;②腦狀;③條狀,負(fù)網(wǎng)狀。由表面紋飾有無組成圖案(P)分為:①無;②似“指紋”?？籽ǖ男螤钣?HS):①條形;②圓形(所有花粉粒上均有條形、圓形孔穴, 以占比多的命名為條形孔穴和圓形孔穴)。

家系j3-30表現(xiàn)為:萌發(fā)溝窄,存在縫隙;萌發(fā)溝脊面表現(xiàn)為:兩極小,中間較大;表面紋飾表現(xiàn)為條狀、腦狀混合與腦狀等兩種,不規(guī)則圖案;孔穴形狀有條形、圓形孔穴。

家系jc-17表現(xiàn)為:萌發(fā)溝有寬有窄,有連接;萌發(fā)溝脊面表現(xiàn)為:兩極小,中間較大;表面紋飾表現(xiàn)為條狀、腦狀混合與腦狀等兩種,不規(guī)則圖案;孔穴形狀為圓形孔穴。

家系zglq-14表現(xiàn)為:萌發(fā)溝寬,存在連接,萌發(fā)溝窄,無連接;萌發(fā)溝脊面表現(xiàn)為:①兩極小,中間大;②變化不大;③兩極小,中間凹陷;表面紋飾為條狀、腦狀與條狀、負(fù)網(wǎng)狀混合等兩種,并會構(gòu)成似“指紋”般的圖案;孔穴形狀為圓形孔穴。

家系zglsm-29表現(xiàn)為:萌發(fā)溝寬,存在連接與無連接;萌發(fā)溝脊面表現(xiàn)為:①兩極小,中間大;②變化不大;表面紋飾為:①條狀,腦狀混合;②腦狀;③條狀,負(fù)網(wǎng)狀混合,不規(guī)則圖案;孔穴形狀為條形、圓形孔穴。

家系w3-1表現(xiàn)為:萌發(fā)溝有寬有窄,存在連接;萌發(fā)溝脊面表現(xiàn)為:①兩極小,中間大;②兩極小,中間凹陷;表面紋飾表現(xiàn)為條狀、腦狀混合與腦狀等兩種,不規(guī)則圖案;孔穴形狀為條形、圓形孔穴。

家系w2-28表現(xiàn)為:萌發(fā)溝窄,存在縫隙,存在連接,而萌發(fā)溝寬,存在連接;萌發(fā)溝脊面表現(xiàn)為:①變化不大;②兩極小,中間凹陷;表面紋飾為條狀、腦狀混合,并會出現(xiàn)似“指紋”般的圖案;孔穴形狀為條形、圓形孔穴。

2.2 唐古特白刺家系花粉間性狀比較

花粉表型性狀的方差分析結(jié)果見表3。6個唐古特白刺家系花粉在赤道軸長、萌發(fā)溝長和萌發(fā)溝脊面寬等存在顯著差異,其余花粉表型性狀差異不大,說明唐古特白刺花粉性狀具有較高的遺傳穩(wěn)定性?；ǚ郾硇托誀畹淖儺愊禂?shù)為 4.33%～40.09%,平均變異系數(shù)為10.58%(表4),其中有4個家系(zglq-14、w2-28、zglsm-29、w3-1)的平均差異系數(shù)高于10%,說明家系的遺傳多樣性較豐富,而酒泉的兩個家系(j3-30、jc-17)變異系數(shù)均小于10%,酒泉的家系遺傳穩(wěn)定性相對較高。不同家系間花粉的極軸長 (5.47%)、赤道軸長(4.33%)、極軸/赤道軸 (4.97%)、萌發(fā)溝長(4.84%)、萌發(fā)溝長/極軸 (5.15%)和萌發(fā)溝脊面寬(4.71%)等變異系數(shù)較小,說明花粉的數(shù)量性狀差異較小。但萌發(fā)溝特征(31.02%)、萌發(fā)溝脊面形狀(29.78%)、紋飾類型(40.09%)、圖案(12.99%)和孔穴形狀 (25.98%)等變異系數(shù)較大,說明花粉的質(zhì)量性狀差異較大。

表3 6個家系間花粉表型性狀方差分析

表4 6個家系間花粉表型性狀變異系數(shù)

2.3 唐古特白刺花粉性狀主成分分析

對花粉形態(tài)指標(biāo)進行主成分分析,旨在可以找到一些反映家系間花粉變異的性狀。結(jié)果(表5)表明:前4個主成分的累計貢獻率達(dá)到 74.977%,涵蓋了所有花粉性狀指標(biāo),其中主成分1(貢獻率:30.689%)中,赤道軸長(0.916)、萌發(fā)溝長(0.920)和萌發(fā)溝脊面寬(0.791)的因子荷載值比較大,花粉的數(shù)量性狀占主導(dǎo)地位;主成分2(貢獻率:21.141%)中,極軸長(0.660)、極軸長/赤道軸長(0.820)、萌發(fā)溝長/極軸長(-0.768)和圖案(-0.711)的因子荷載值比較大,花粉的數(shù)量性狀占主導(dǎo)地位;主成分3(貢獻率:12.143%)中,紋飾類型(0.603)和孔穴形狀(-0.372)的因子荷載值比較大,花粉的質(zhì)量性狀占主導(dǎo)地位;主成分4(貢獻率:11.002%)中,萌發(fā)溝特征 (-0.767)和萌發(fā)溝脊面形狀(0.433)的因子荷載值比較大,即花粉的質(zhì)量性狀占主導(dǎo)地位。綜上所述,唐古特白刺花粉性狀中數(shù)量性狀累積方差的貢獻率高于質(zhì)量性狀的貢獻率,說明質(zhì)量性狀的遺傳穩(wěn)定性高于數(shù)量性狀。

表5 主成分分析

2.4 唐古特白刺家系的聚類分析

對唐古特白刺花粉性狀進行家系聚類分析,采用組間聯(lián)接法,生成聚類樹系圖(圖2)。在閾值5以后,6個唐古特白刺家系被劃分為兩大類,第一類包括zglq-14(張掖甘州龍渠)、zglsm-29(張掖甘州老寺廟)、w2-28(武威民勤小壩口)、j3-30(酒泉金塔)和jc-17(酒泉瓜州槽沿子),第二類包括w3-1(武威民勤沙井子)。第一類進一步可分為兩個亞類,第一個亞類包括zglq-14(張掖甘州龍渠)、zglsm-29(張掖甘州老寺廟)和w2-28(武威民勤小壩口),第二個亞類包括j3-30(酒泉金塔)和jc-17(酒泉瓜州槽沿子);第一個亞類還可細(xì)分為zglq-14(張掖甘州龍渠)、zglsm-29(張掖甘州老寺廟)和w2-28(武威民勤小壩口)。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)細(xì)分之下,唐古特白刺家系花粉的聚類與地理分布有顯著相關(guān)性。

圖2 唐古特白刺花粉性狀聚類

3 討 論

一般來說,由于植物花粉結(jié)構(gòu)的高遺傳保守性,使其成為了研究植物起源、進化、分類和親緣關(guān)系的重要性狀。在這種情況下,許多學(xué)者[11-12,18]均以唐古特白刺作為白刺屬的代表植物,致力于研究白刺屬的分類學(xué)地位,結(jié)果均支持白刺屬獨立成科,但選取的唐古特白刺花粉表型性狀過于單一,且對其存在的差異并沒有進行深入研究。本研究在增加觀察及測量性狀的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)唐古特白刺花粉形態(tài)比較一致,為中等大小花粉粒,長球形,具三孔溝,萌發(fā)溝寬,局部連接,萌發(fā)溝脊面為兩極小,中間大,呈“凸”形增大,紋飾類型為條狀、腦狀,并沒有構(gòu)成圖案。為了適應(yīng)不同的環(huán)境條件,同一植物個體花粉也會出現(xiàn)多種變異形態(tài),是更有利于植物的進化[19]。如武威民勤小壩口的花粉萌發(fā)溝隨寬窄不同,開裂的程度不同;張掖甘州龍渠的花粉萌發(fā)溝脊面形狀有3種,變異較大;張掖甘州老寺廟的花粉紋飾類型有3種,最豐富;僅有張掖甘州龍渠與武威民勤小壩口的表面紋飾構(gòu)成了似“指紋”的圖案。結(jié)合資料,查閱前人研究[20-22]發(fā)現(xiàn)植物花粉形狀的演化趨勢是:舟形→縱長形→球形→扁球形→球形→圓球形→長球形;萌發(fā)溝的演化趨勢是:單溝→具溝→三溝;表面紋飾的演化趨勢是:表面光滑→表面條紋狀、網(wǎng)狀→表面疣狀、刺狀;萌發(fā)孔的演化趨勢是:橫長→圓形。即說明唐古特白刺屬于較進化的種。

遺傳因素與環(huán)境條件是影響花粉形態(tài)的主要原因,而種內(nèi)花粉的豐富差異主要來自局部環(huán)境影響[23]。對此,索玉靜等[24]、單奇等[25]都已經(jīng)在其他植物上進行了研究,均發(fā)現(xiàn)了種內(nèi)花粉確實存在豐富的遺傳差異。本研究材料來自于唐古特白刺試驗田,首先材料在相同環(huán)境下生長10年,排除了由于環(huán)境條件影響而產(chǎn)生的差異,因此表現(xiàn)出的差異主要受遺傳因子控制[26]。其次唐古特白刺的花粉性狀較多,存在信息重疊現(xiàn)象,通過主成分分析,減少干擾,可以得到簡潔的結(jié)果[27]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)前兩個主成分中數(shù)量性狀的載荷值位于前列,則花粉質(zhì)量性狀的遺傳變異相對數(shù)量性狀較穩(wěn)定,因此質(zhì)量性狀表現(xiàn)出的差異是來源于遺傳基因的差異,但還需要進一步通過分子水平進行驗證。聚類結(jié)果沒有嚴(yán)格地按照不同地理聚類,但在小范圍內(nèi)將近距離的聚為一類,說明唐古特白刺花粉與地理環(huán)境有顯著關(guān)系,與吉德娟等[28]發(fā)現(xiàn)唐古特白刺果實、葉片等性狀與地理存在顯著關(guān)系的結(jié)果一致。可以為唐古特白刺種質(zhì)資源遺傳多樣性及育種研究提供一定依據(jù)。