馬婭楠,李繼平,,3,鄭 果,,3,張金奎,馬生彪,惠娜娜,3,王 立,3,張自強

(1.甘肅農業(yè)大學 植物保護學院,蘭州 730070;2.甘肅省農業(yè)科學院 植物保護研究所,蘭州 730070;3.農業(yè)部天水作物有害生物科學觀測試驗站,甘肅天水 741299)

赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)為毛茛科(Ranunculaceae)多年生草本植物,是中國傳統(tǒng)野生中藥材,應用歷史悠久[1],種質資源豐富,在中國四川、甘肅、陜西、云南、貴州、青海等地有大面積栽培[2]。

赤芍入藥部位為根部,具有抗腫瘤[3]、散瘀止痛[4]、清肝火[5-6]等功效。此外,赤芍花色艷麗,花香四溢,是花壇和公園的首選觀賞植物,適合生態(tài)綠化及林地經濟開發(fā)。

2021年5月,在甘肅省定西市渭源縣赤芍種植示范田發(fā)現一種新的赤芍根部病害。受侵染植株地上部出現葉片發(fā)黃、植株瘦弱矮小、近地部腐爛及整株干枯死亡等癥狀,根部組織變色腐爛且有異味,嚴重影響赤芍的生產量、藥用品質及觀賞價值。

據報道芍藥屬病害有炭疽病、葉斑病、銹病、灰霉病、白粉病、白絹病等[7-9],但未見赤芍根部病害的詳細調查及病原菌鑒定報道。為明確赤芍根腐病病原菌及相關特性,遂對其進行了病原菌分離鑒定及生物學特性研究,以期為該病害的田間診斷及有效防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病害樣品的采集及病原菌分離

2021年5月,從甘肅省定西市渭源縣赤芍種植示范田隨機采集典型根腐病根部病樣。

采用常規(guī)組織分離法進行分離[10]:縱切發(fā)病根部,在病健交界處切取大小為5 mm×5 mm的組織塊,浸入75%酒精溶液中消毒10 s,然后投入3%次氯酸鈉溶液中消毒45 s,再用滅菌水清洗3次,晾干后移入PDA 平板,25 ℃黑暗條件下培養(yǎng),待邊緣長出菌絲后,根據顏色和形態(tài),挑取菌落邊緣的菌絲轉接到新的PDA平板進行純化,純化后置于PDA斜面上,4 ℃保存。

1.2 致病性測定

采用室內離體接種法進行致病性測試[11]:純化菌培養(yǎng)15 d后,洗脫孢子以制備懸浮液,利用紐鮑爾血球計數板計數孢子濃度,孢懸液稀釋至107mL-1。選取健康赤芍根部,用75%的酒精擦拭表面,將其切成8～10 cm長的小根段,移液槍吸取10 μL接種于表面,進行刺傷與未刺傷兩個處理,無菌水作為對照,每個處理重復3次。接菌后保濕置于25 ℃下黑暗培養(yǎng),逐日觀察發(fā)病 情況。

1.3 形態(tài)學鑒定

觀察記錄病原菌在PDA平板上的菌落形態(tài)、顏色變化、菌絲生長速率等,并對分生孢子形態(tài)、大小及顏色進行顯微觀察、拍照。

1.4 分子生物學鑒定

采用真菌基因組提取試劑盒(Solarbio)提取基因組DNA,利用引物ITS1/ ITS4[12]、LROR/LR7[13]、EF1-728F/EF1-986R[14]進行PCR擴增。取5 μL PCR產物在1%瓊脂凝膠上檢測出陽性后,將合成引物和PCR產物委托生工生物工程(上海 )有限公司完成測序,測序結果與數據庫NCBI中已知的序列進行Nucleotide Blast同源性比對,下載相關的屬種序列(表1)。利用 MAFF v7．037b軟件進行多重比較,GBLOCKS 0.91b軟 件 進 行 保 守 區(qū) 域 選擇,ACOPTools軟件將各基因串聯成數據集并用PAUP v4.0b10軟件和最大簡約法(Maximum Parsimony,MP)構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 參考菌株信息和GenBank登錄號

1.5 病原菌的生物學特性測定

1.5.1 光照對病原菌生長的影響 光照條件設置為全黑暗(24 D)、全光照(24 L)、16 h光照+ 8 h黑暗(16 L/8 D)和12 h光照+12 h黑暗 (12 L/12 D)。

1.5.2 pH對病原菌生長的影響 培養(yǎng)基pH設定為4、5、6、7、8、9、10、11、12共9個梯度。

1.5.3 溫度對病原菌生長的影響 設定5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃共7個溫度條件。

1.5.4 培養(yǎng)基對病原菌生長的影響 選擇PDA、Czapek、OA、NA、黑麥培養(yǎng)基共5種培 養(yǎng)基。

1.5.5 碳源和氮源對病原菌生長的影響 以Czapek為基礎培養(yǎng)基,將蔗糖替換成等量的(以碳元素的質量計算)麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇;將硝酸鈉替換成等量的(以氮元素的質量計算)蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、硝酸納、甘氨酸。同時,以不加碳源和氮源作為對照(CK)。

將病原菌菌餅(d=5 mm)接種在不同培養(yǎng)基平板中央,除溫度對病原菌生長的影響外,所有處理均在25 ℃下黑暗培養(yǎng),5 d后測量菌落直徑,15 d后測量產孢量,每個處理重復3次。用Excel 2016和SPSS 25.0對數據進行整理和分析,Duncan’s 新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 赤芍根部病害癥狀及病原菌分離

田間自然發(fā)病植株根部變色腐爛,根皮表面有黑褐色病斑,根皮與韌皮部脫離,橫切面木質部有黑色擴散,并有異臭味,地上部分葉片褪綠皺縮變小,枝條枯死,發(fā)育不全,后期嚴重時可導致全株死亡(圖1-A～1-B)。從采集的赤芍發(fā)病根部,分離純化獲得6株菌落顏色及形態(tài)一致的菌株,編號為CS-1～CS-6,隨機選取菌株CS-1進行后續(xù)試驗。

A.田間發(fā)病植株;B.發(fā)病植株近地部;C.赤芍根腐病發(fā)病根部(紅色圓圈區(qū)域為分離樣部位);D.病原菌孢子懸浮液接種7 d根段(左為根段表面發(fā)病癥狀,右為病原菌擴展狀況); E.孢子懸浮液接種10 d后病原菌擴展根段; F.對照

2.2 致病性測定結果

結果表明CS-1可使刺傷根部發(fā)病。接菌7 d后,根部表面有明顯棕褐色病變并附著白色菌絲,10 d后接種部位變黑并伴有腐爛發(fā)生,切開侵染根段后發(fā)現,病原菌已向木質部擴散,與田間發(fā)病癥狀一致。再分離已發(fā)病的接菌病根,可獲得與原接種菌一致的菌落形態(tài)與分生孢子,符合柯赫氏法則,進一步證實了CS-1為赤芍根腐病的致病菌(圖1)。

2.3 形態(tài)鑒定結果

病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長較快,7 d后直徑可達90 mm,菌落初呈白色或乳白色,具輪紋,由內向外呈放射狀,背面呈白色(圖2-A～2-B)。15 d后,培養(yǎng)基表面變成橘黃色并開始產生黑棕色油狀分生孢子團。分生孢子團為球形或近球形,直徑為231.5 ～ 512.4 μm,最初透明,后期逐漸變?yōu)楹谧厣?圖2-C)。分生孢子梗形態(tài)明顯,透明呈近柱狀,頂端著生有一至兩個分生孢子,分生孢子大小為(7.5～11.0) μm×(5.5～7.5) μm,褐色,厚壁,球形至近球形(圖3-D～3-F)。通過形態(tài)學特征比較,可初步鑒定該病原菌為Coniella屬[15]。

A-B.PDA上菌落形態(tài)(正反面);C.PDA上的分生孢子團;D-E.分生孢子器;F.分生孢子

圖3 基于ITS、LSU、TEF-α多基因聯合構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 系統(tǒng)進化樹的構建結果

PCR擴增后獲得大小分別為601 bp(ITS)、 1 327 bp(LSU)和373 bp(TEF1-α)的DNA片段,將測序結果置于GenBank獲得登錄號分別為OP824764(ITS)、OP824767(LSU)和OP903926(TEF1-α)。Blastn分析結果顯示,供試菌株CS-1與Coniellafragariae的相似度為99%～100%。選用其近源相關序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(表1),結果表明:CS-1與C.fragariae遺傳距離最近,聚于同一分支上,區(qū)別于其他Coniella屬(圖3)。結合形態(tài)學特征,確定該病原菌為草莓墊殼孢(C.fragariae)。

2.5 生物學特性測定

2.5.1 光照對病原菌生長的影響 病原菌在24D、24L、16L/8D和12L/12D條件下均能生長,菌絲生長速率表現為24D>16L/8D>12L/12D>24L,在24L條件下測得的菌落直徑最小,為62.38 mm,顯著低于其他處理。在4種光照條件下均可產孢,除24L外,其余光照條件下產孢量無顯著差異(圖4)。

圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),下同

2.5.2 溫度對病原菌生長的影響 病原菌在 10 ℃～30 ℃范圍內均可生長,最適菌絲生長溫度為20 ℃～25 ℃,25 ℃時產孢量達最高。在 5 ℃和35 ℃溫度下,菌落大小無變化,菌絲無生長,未見產孢(圖5)。

圖5 不同溫度下的病原菌菌絲和產孢量

2.5.3 培養(yǎng)基對病原菌生長的影響 病原菌在供試的5種培養(yǎng)基上都能生長,菌落從大到小依次為PDA、OA、黑麥培養(yǎng)基、Czapek和NA,其中在PDA培養(yǎng)基上生長最快,平均菌落直徑為 63.92 mm,顯著大于其他培養(yǎng)基中的菌落直徑。在黑麥培養(yǎng)基上產孢量最高,在Czapek和NA上不產孢(圖6)。

Ⅰ.PDA培養(yǎng)基;Ⅱ.黑麥培養(yǎng)基;Ⅲ.OA培養(yǎng)基;Ⅳ.NA培養(yǎng)基; Ⅴ.Czapek培養(yǎng)基

2.5.4 pH對病原菌生長的影響 適宜病原菌生長的pH為6～7,且pH為7時菌落直徑和產孢量達到最大。過酸或過堿均不利于該菌菌絲生長和產孢(圖7)。

圖7 不同pH下病原菌菌絲和產孢量

2.5.5 碳源對病原菌生長的影響 病原菌菌絲在供試的6種培養(yǎng)基上都能生長,表明該菌能夠利用多種碳源。以乳糖為碳源時,菌落直徑最大,為50.48 mm,顯著大于以麥芽糖、甘露醇、葡萄糖和蔗糖為碳源時的菌落直徑。該菌在供試的6種培養(yǎng)基上均不產孢(表2)。

表2 不同碳源下病原菌的生長

2.5.6 氮源對病原菌生長的影響 由表3可見,病原菌在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大,顯著大于以牛肉膏、甘氨酸、硝酸鈉、硫酸銨為氮源的菌落直徑。該菌在供試的7種培養(yǎng)基上均不產孢。不同碳源與氮源下病原菌的菌落形態(tài)見圖8。

表3 不同氮源下病原菌的生長

A.乳糖;B.甘露醇;C.麥芽糖;D.葡萄糖;E.蔗糖;F.無碳源;G.酵母膏;H.蛋白胨;I.牛肉膏;J.甘氨酸;K.硝酸鈉;L.硫酸銨

3 結論與討論

本研究發(fā)現一種新的赤芍根部病害,經病原菌分離純化、致病性檢測、形態(tài)特征觀察和多基因序列分析,確定該病原菌為草莓墊殼孢(Coniellafragariae)。據報道,C.fragariae可侵染薔薇屬(Rosasp.)、小麥屬(Triticumsp.)、歐洲草莓(FragariavescaL.)、草莓屬(Fragariasp.)、豌豆(PisumsativumL.)、碗豆屬(Pisumsp.)、葉下珠屬(Phyllanthussp.)、榆綠木屬(Anogeissussp.)、展葉松(PinuspatulaSchlecht.et Cham)、柏木屬(Cupressussp.)等[16],但未見病原菌分離鑒定及生物學特性方面的研究報道。2020年,張智博等[17]從赤芍根部分離出C.fragariae,但并未將其作為致病菌進行研究,而是以內生菌進行抑菌試驗。本研究首次發(fā)現C.fragariae侵染赤芍根部導致根腐病,但致病性試驗發(fā)現,該菌不能侵染無傷的赤芍根部,說明該菌致病性或寄生性較弱,只能通過傷口侵入[18]。因此,該病的防控方面,應避免根部受傷,預防地下害蟲,該病害侵染是否存在復合侵染尚需進一步研究。

病原菌的生物學特性與其生長環(huán)境有著密切聯系,根據生物學特性研究可以更好地預測病情發(fā)生時期以及對病害的防控[19-21]。本試驗結果表明:病原菌在供試的多種培養(yǎng)基上都能生存,OA和黑麥培養(yǎng)基可促進其產孢,全光照不利于病原菌生長,最適溫度為20～25 ℃,這與5月份當地赤芍根腐病的發(fā)生趨勢相符。該病發(fā)生最適pH為6～7,喜好中性偏酸環(huán)境,與赤芍多年性生長、連作導致土壤偏酸有關。病原菌在不同的碳氮源條件下均可存活,但對碳源的利用率較低,生長至后期也未見有明顯的菌落形成,且不產孢,但在不同氮源的培養(yǎng)基上生長差異顯著,酵母膏為氮源時菌絲茂密且菌落形態(tài)明顯,缺氮時該菌停止生長。該結果與赤芍田間施肥管理有無直接關系,有待進一步研究。