姜曉東，李紅艷，王穎*，吳松波，紀蕾，劉天紅，孫元芹，李曉

（1.山東省海洋科學研究院，山東 青島 266104；2. 青島市水產(chǎn)品質(zhì)評價工程研究中心，山東 青島 266104；3.無棣縣海洋漁業(yè)發(fā)展研究中心，山東 濱州 256600）

鹵蟲（Artemia），也稱豐年蟲、豐年蝦、鹽水豐年蟲等，是一種較為低等的甲殼類動物，主要以水中的浮游藻類和細小碎屑為食。本世紀30 年代，美國科學家首先發(fā)現(xiàn)鹵蟲的無節(jié)幼體可以作為魚苗、蝦苗的餌料，為水產(chǎn)育苗業(yè)的發(fā)展開創(chuàng)了新時代[1]。除了可以直接做水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的餌料，鹵蟲也可作為食品原料。在美國、新西蘭等國出售一種“鹵蟲薄餅”的加工品，味道類似干蝦，廣受消費者歡迎；在泰國將鹵蟲制成蝦醬，在非洲、美洲將鹵蟲曬干食用[2]，國內(nèi)也有利用鹵蟲卵開發(fā)氨基酸飲料的研究[3]。然而自然生長的鹵蟲由于未加營養(yǎng)改良和科學投喂，存在氨基酸不平衡和不飽和脂肪酸缺乏的營養(yǎng)缺陷問題以及施用有機肥（如雞糞）導致的弧菌超標等食品安全問題，限制了鹵蟲作為食品原料的進一步開發(fā)和應用。

微藻在海洋中分布廣泛，是海洋生態(tài)系統(tǒng)的主要生產(chǎn)者，而且富含蛋白質(zhì)、脂類、藻多糖、β-胡蘿卜素和多種無機元素等營養(yǎng)物質(zhì)[4]，采用微藻營養(yǎng)強化可有效補充鹵蟲無節(jié)幼體中的蛋白質(zhì)和長鏈不飽和脂肪酸[5]。目前，國內(nèi)外研究多集中于針對鹵蟲無節(jié)幼體的營養(yǎng)強化和針對鹵蟲無節(jié)幼體作為魚苗餌料的營養(yǎng)分析，而對人工養(yǎng)殖的鹵蟲成蟲作為食品原料，營養(yǎng)強化并分析其營養(yǎng)價值的相關研究較少。為此，本研究選取6 種微藻對鹵蟲進行投喂，并對成蟲體長、生物量、營養(yǎng)成分含量等進行分析，以期為利用鹵蟲開發(fā)休閑食品或保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無棣鹵蟲卵：山東省友發(fā)水產(chǎn)有限公司。

中肋骨條藻（Skeletonemaco statum）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）、威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii）、小球藻（Chlorella pyenoidosa）：中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所保存種質(zhì)，培養(yǎng)液采用F/2 培養(yǎng)液配方，在自然光照下，50 L 塑料桶內(nèi)進行充氣培養(yǎng)。酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

YSI556MPS 多參數(shù)水質(zhì)檢測儀：美國YSI 公司；LA8080 氨基酸自動分析儀：日立高新技術公司；1100液相色譜儀、GC6890 氣相色譜儀：美國安捷倫有限公司；Kjeltec 8400 全自動蛋白測定儀、Soxtec 8000 全自動脂肪測定儀：丹麥FOSS 公司；XSP-10C 顯微鏡：上海光學儀器一廠。

1.3 方法

1.3.1 鹵蟲孵化

準確稱取50 g 鹵蟲卵，在pH 值為7.5±0.5、溫度18～22 ℃的潔凈海水中連續(xù)光照充氣孵化30 h，得無節(jié)幼體，分離并選出健康的無節(jié)幼體用于營養(yǎng)強化試驗。

1.3.2 不同微藻營養(yǎng)強化試驗

將鹵蟲無節(jié)幼體接種于養(yǎng)殖裝置[6]內(nèi)培育，接種密度為2 000～3 000 ind/L，分別投喂不同微藻進行營養(yǎng)強化試驗。設中肋骨條藻、三角褐指藻、球等鞭金藻、亞心形扁藻、威氏海鏈藻和小球藻6 個試驗組，以酵母為對照，每組試驗設3 個平行。每日上午9:00、下午15:00 投喂餌料，不同餌料投喂量如表1 所示。試驗周期14 d，期間養(yǎng)殖水體溫度為（27±1）℃，鹽度為30±1，pH 值為7.5±0.5，溶解氧≥6.5 mg/L，每天監(jiān)測養(yǎng)殖條件，及時進行調(diào)節(jié)。

表1 不同餌料投喂量Table 1 Different feed quantity 個/mL

1.3.3 體長測定

從各試驗組隨機取10 只鹵蟲，鏡檢測量鹵蟲體長，每2 d 測定1 次，體長為頭部前端至尾叉底端的距離，計算平均值。

1.3.4 日平均生長速率和特定生長率測定

日平均生長速率和特定生長率計算公式如下。

式中：a 為日平均生長速度，mm/d；b 為特定生長率（specific growth rate，SGR），%；Lt為t d 后各組的鹵蟲的平均體長，mm；L0為第1 次測量時各組鹵蟲的平均體長，mm；t 為所經(jīng)歷的時間，d。

1.3.5 生物量測定

第14 天，用篩絹收集全部鹵蟲，用蒸餾水除去鹵蟲體表鹽分，濾紙吸干水分，稱量其質(zhì)量，獲得鹵蟲生物量[7]。

1.3.6 營養(yǎng)成分測定

水分含量測定依據(jù)GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；粗蛋白測定依據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪測定依據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；灰分測定依據(jù)GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；氨基酸成分測定依據(jù)GB 5009.124—2016 《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》；脂肪酸成分測定依據(jù)GB 5009.168—2016《食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定》。

1.3.7 營養(yǎng)價值評價

1.3.7.1 氨基酸品質(zhì)評價

將所測得必需氨基酸換算成1 g 蛋白質(zhì)中含氨基酸含量[8]，與2007 年糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）建議的氨基酸計分模式和以雞蛋蛋白質(zhì)作為理想蛋白質(zhì)進行比較[8]，按下式計算鹵蟲的氨基酸分（A）和化學分（C）。

式中：M1為待評蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量，mg/g N；M0為FAO/WHO 模式中蛋白質(zhì)相應必需氨基酸的含量，mg/g N；M2為雞蛋蛋白質(zhì)中相應必需氨基酸的含量，mg/g N。

1.3.7.2 脂肪酸品質(zhì)評價

血栓形成指數(shù)（index of thrombogenicity，IT）是評估脂肪酸對人類心血管疾病發(fā)生影響的指標，其計算公式如下。

式中：c 為血栓形成指數(shù)；S 為飽和脂肪酸的含量，%；M 為單不飽和脂肪酸的含量，%；P3為OMEGA-3 多不飽和脂肪酸的含量，%；P6為OMEGA-6 多不飽和脂肪酸的含量，%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示，使用SPSS 16.0 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 不同微藻對鹵蟲體長的影響

鹵蟲是一種非選擇性濾食動物，成體所能攝取的最大餌料顆粒粒徑為40～50 μm，本試驗選取的微藻粒徑均符合要求。不同微藻強化下鹵蟲體長隨時間的變化情況見表2。

表2 不同微藻營養(yǎng)強化下鹵蟲體長隨時間變化情況Table 2 Changes of Artemia length with time under different microalgae nutrition cm

由表2 可知，不同微藻對鹵蟲體長的影響效果不同。試驗14 d 后，鹵蟲的體長為1.15 ～3.10 cm。其中小球藻組體長最長，為3.10 cm，顯著高于其它組（P＜0.05）。其次為亞心形扁藻組和威氏海鏈藻組，分別為2.20 cm 和1.90 cm，均高于對照組。中肋骨條藻組和三角褐指藻組體長最短，分別為1.20 cm 和1.15 cm，與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

不同微藻強化對鹵蟲生長速率和特定生長率的影響見表3。

表3 不同微藻營強化下鹵蟲生長速率和特定生長率Table 3 Growth rate and specific growth rate of Artemia under different microalgae nutrition

由表3 可知，不同微藻對鹵蟲生長速率和特定生長率影響效果不同。試驗14 d 后，小球藻組生長最快，日平均生長速率和特定生長率分別為1.67 mm/d 和10.95%。其次為亞心形扁藻組、威氏海鏈藻組和球等鞭金藻組，日平均生長速率分別為1.03、0.81、0.57 mm/d，特定生長率分別為8.13%、6.85%和6.23%，均高于對照組。中肋骨條藻組生長最慢，日平均生長速率和特定生長率分別為0.38 mm/d 和4.30%，低于對照組。

2.2 不同微藻對鹵蟲生物量的影響

不同微藻強化對鹵蟲生物量的影響見表4。

表4 不同微藻營養(yǎng)強化下鹵蟲生物量Table 4 Biomass of Artemia under different microalgae nutrition

由表4 可知，不同微藻對鹵蟲生物量的影響效果不同，生物量為0.19～0.98 g。其中小球藻組和威氏海鏈藻組生物量較高，分別為0.98 g 和0.93 g，顯著高于其它組（P＜0.05），其次為亞心形扁藻、球等鞭金藻和中肋骨條藻，分別為0.84、0.49 g 和0.35 g，均顯著高于對照組（P＜0.05）。三角褐指藻組生物量最低，僅為0.19 g，與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

不同微藻對鹵蟲體長和生物量影響差異顯著，其中小球藻對于鹵蟲生長的促進作用最好，可能與不同微藻的蛋白質(zhì)和脂肪酸含量差異較大有關。鹵蟲生長與攝入的蛋白質(zhì)含量呈正相關，還與蛋白質(zhì)跟碳水化合物的比值、維生素等有關[9]，而鹵蟲生殖中卵黃的積累需要提供大量脂肪酸[10]。小球藻蛋白質(zhì)含量在50%左右，超過牛肉、大豆等高蛋白食物，不飽和脂肪酸達50%以上，亞麻酸和亞油酸含量分別為28.07%和16.49%[11]，豐富的營養(yǎng)物質(zhì)為鹵蟲的生長發(fā)育提供了營養(yǎng)來源。此外，鹵蟲的生長環(huán)境也適宜小球藻的生長，小球藻最適生長溫度為20～30 ℃，最適鹽度為20～30[12]，而本試驗的水溫為27.5 ℃，鹽度為30，符合小球藻的最適生長溫度和鹽度。

2.3 不同微藻對鹵蟲基本營養(yǎng)成分的影響

不同微藻強化對鹵蟲基本營養(yǎng)成分的影響見表5。

表5 不同微藻強化下鹵蟲基本營養(yǎng)成分比較Table 5 Comparison of basic nutrients of Artemia under different microalgae nutrition %

由表5 可知，不同微藻對鹵蟲基本營養(yǎng)成分的影響效果不同，鹵蟲粗蛋白含量為41.82%～56.45%，粗脂肪含量為7.04%～10.26%，灰分含量為22.29%～33.50%。其中小球藻組粗蛋白含量最高，為56.45%，顯著高于其它組（P＜0.05），其次為球等鞭金藻組和中肋骨條藻組，分別為52.51%和48.33%，均顯著高于對照組（P＜0.05），對照組最低，僅為39.63%。小球藻組和中肋骨條藻組粗脂肪含量最高，分別為10.26%和9.84%，顯著高于其它組（P＜0.05），三角褐指藻組脂肪最低，為7.04%，與對照組差異不顯著（P＞0.05）。對照組灰分含量最高，為33.50%，顯著高于其它組（P＜0.05），中肋骨條藻組灰分含量最低，為22.29%。綜合基本營養(yǎng)成分來看，營養(yǎng)強化效果最佳的微藻為小球藻。

鹵蟲蛋白質(zhì)含量豐富，目前多作為魚苗蝦苗的生物餌料使用。曾廣元等[13]測得黃旗海產(chǎn)鹵蟲成蟲粗蛋白含量為54.14%，潘茜等[14]測得古根豐年蟲成蟲粗蛋白含量在75.56%以上，徐秀蘭等[15]測得連云港鹽場鹵蟲粗蛋白含量約為40.86%。脂肪對鹵蟲的生長有關鍵作用，當其他條件合適時，脂肪含量越高對鹵蟲成活率越有利[16]。黃旭雄[17]發(fā)現(xiàn)鹵蟲成蟲粗脂肪含量介于2.40%～12.84%，Léger 等[18]發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的養(yǎng)殖鹵蟲脂肪含量在9.4%～19.5%。與本試驗研究結果的不同可能與鹵蟲的品種、發(fā)育階段、生長環(huán)境、攝取的餌料和檢測方法不同等有關。張躍群等[19]比較了小球藻、亞心形扁藻和湛江叉鞭金藻對鹵蟲蛋白質(zhì)的強化作用，結果顯示小球藻效果最好。本研究發(fā)現(xiàn)，小球藻對鹵蟲蛋白質(zhì)強化作用最好，小球藻和中肋骨條藻對鹵蟲粗脂肪強化作用最好，這與張躍群等[19]的研究結果一致。經(jīng)小球藻強化培養(yǎng)后，鹵蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量提高了1.42 倍，粗脂肪含量提高了1.43 倍，表明經(jīng)過小球藻培養(yǎng)的鹵蟲成蟲營養(yǎng)成分得到了一定的提高。

2.4 不同微藻對鹵蟲氨基酸組成與含量的影響

鹵蟲體內(nèi)的氨基酸組成基本不受外界因素的影響，但其氨基酸含量卻與鹵蟲的發(fā)育階段所攝取的餌料有關[20]。不同微藻強化對鹵蟲氨基酸含量的影響見表6。

表6 不同微藻強化下鹵蟲氨基酸含量Table 6 Amino acid content of Artemia under different microalgae nutrition g/100 g 干基

由表6 可知，不同微藻強化下的鹵蟲氨基酸含量豐富，含有8 種必需氨基酸。其中小球藻組氨基酸總量最高，為44.10 g/100 g 干基。其次為球等鞭金藻組和亞心形扁藻組，分別為34.77 g/100 g 干基和32.91 g/100 g干基，對照組氨基酸總量最低，僅為16.47 g/100 g 干基?？梢姡⒃鍫I養(yǎng)強化能顯著提升鹵蟲中氨基酸含量。

小球藻組中，谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸含量較高，依次為5.88、3.84 g/100g 干基和3.51g/100g 干基，組氨酸和胱氨酸含量較少，蛋氨酸含量最低，僅為0.57 g/100 g干基。谷氨酸不僅是公認的鮮味氨基酸，還參與腦內(nèi)蛋白質(zhì)和糖的代謝以及促進氧化過程[21]；天冬氨酸參與鳥氨酸循環(huán)，降低血液中氮和二氧化碳的量，有增強肝臟功能、消除疲勞的作用；亮氨酸能夠修復肌肉，控制血糖，并給身體組織提供能量，小球藻組這3 種氨基酸含量豐富，對人體健康十分有益。此外，小球藻組必需氨基酸占總氨基酸總量的40.27%，符合FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式，EAA/TAA 在40%左右，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白。小球藻組呈味氨基酸比例高，占總氨基酸含量的34.59%，其中鮮味氨基酸（谷氨酸和天門冬氨酸）占22.04%，甜味氨基酸（甘氨酸和丙氨酸）占9.25%，因此其味道鮮美，可作為開發(fā)鮮味調(diào)料的原料。

氨基酸分（amino acid score，AAS）和化學分（chemical score，CS）可以反映蛋白質(zhì)構成和利用率關系。不同微藻強化下鹵蟲氨基酸分和化學分見表7、表8。

表7 不同微藻強化下鹵蟲氨基酸分Table 7 Essential amino acids scores of Artemia under different microalgae nutrition

表8 不同微藻強化下鹵蟲化學分Table 8 Chemical scores of essential amino acids of Artemia under different microalgae nutrition

由表7、表8 可知，小球藻組氨基酸得分最高，各必需氨基酸得分均非常接近或高于FAO/WHO 模式值，氨基酸平均分為99.77，其次為亞心形扁藻組和中肋骨條藻組，氨基酸平均分分別為91.75 和81.75。最低為對照組，氨基酸評分僅為47.06。綜上，對照組鹵蟲蛋白質(zhì)中氨基酸含量比例不平衡，屬于不完全蛋白質(zhì)。

以AAS 為標準，小球藻組鹵蟲第一限制性氨基酸為半胱氨酸+蛋氨酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸。以CS 為標準，小球藻組鹵蟲第一限制性氨基酸為半胱氨酸+蛋氨酸，第二限制性氨基酸為異亮氨酸。為了保持飲食平衡，在開發(fā)以小球藻強化鹵蟲為原料的相關食品時，可搭配富含半胱氨酸、蛋氨酸的食物進行相應的補充，如鵝肉、雞肉、大豆、雞蛋等。

2.5 不同微藻對鹵蟲脂肪酸組成的影響

脂肪酸的含量和組成是評價動物營養(yǎng)質(zhì)量的重要指標之一。提高不飽和脂肪酸，特別是多不飽和脂肪酸的攝入，是人們膳食結構的發(fā)展趨勢[22]。不同微藻強化下鹵蟲脂肪酸組成與含量見表9。

表9 不同微藻強化下鹵蟲脂肪酸組成與含量Table 9 Fatty acid composition content of Artemia under different microalgae nutrition %

由表9 可知，不同微藻強化對鹵蟲脂肪酸組成的影響顯著。亞心形扁藻組和威氏海鏈藻組多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）含量最高，分別為38.77%和37.58%，其次為小球藻組26.75%，中肋骨條藻組PUFA 含量最低，為14.41%。小球藻組單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA） 含量最高，為41.24%，其次為球等鞭金藻組和中肋骨條藻組，分別為37.30%和34.57%，亞心形扁藻組MUFA 含量最低，為31.32%。威氏海鏈藻組二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）含量最高，為17.65%，其次為小球藻組和三角褐指藻組，EPA 含量分別為15.28%和14.12%，對照組EPA 含量最低，為7.42%。

PUFA 可以增加食物加熱過程中的香味，具有改善血液循環(huán)、降低血液黏稠度、增強人體免疫力等多種生理活性[23]，MUFA 具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、降膽固醇等作用[24]，威氏海鏈藻組和亞心形扁藻組不飽和脂肪酸含量達70%以上，營養(yǎng)價值較高。EPA 具有清理血管中垃圾的功能，俗稱“血管清道夫”[25]，是人和動物生長發(fā)育的必需脂肪酸[26]。然而鹵蟲幼體不能合成EPA[27]，需要從餌料中獲得，其含量高低直接影響鹵蟲的營養(yǎng)價值。研究表明，經(jīng)微藻強化后的鹵蟲EPA 含量提高了1.04～2.38 倍，其中威氏海鏈藻組效果最好，表明經(jīng)威氏海鏈藻強化的鹵蟲可顯著提高EPA 含量。不同微藻強化下鹵蟲脂肪酸的血栓形成指數(shù)為0.26～0.56，其中亞心形扁藻組最低，IT 為0.26，大大低于羊肉、牛肉和豬肉（IT 分別為1.58、1.06、1.37）[28]，表明鹵蟲脂肪酸不飽和度高，具有抑制血栓形成的功能。

不同微藻對鹵蟲脂肪酸組成的影響顯著，這可能與鹵蟲所處的生長周期、適口性、消化率及食物轉化等相關[29]。魯云霞等[30]通過微綠球藻、三角褐指藻、微藻-酵母混合餌料培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)鹵蟲體內(nèi)的ω-3 脂肪酸含量提高了2～3 倍，這與本試驗結果相近。在提高鹵蟲EPA 含量方面，陳瑞楠[31]發(fā)現(xiàn)扁藻組＞小球藻組＞金藻組＞混合藻組，趙素芬等[32]發(fā)現(xiàn)角毛藻能明顯改善鹵蟲體內(nèi)EPA 含量，黃旭雄等[33]發(fā)現(xiàn)小球藻可以顯著提高鹵蟲幼體EPA 含量。本研究結果EPA 含量威氏海鏈藻組＞小球藻組＞三角褐指藻組＞亞心形扁藻組＞中肋骨條藻＞球等鞭金藻＞對照組，表明威氏海鏈藻、小球藻均能明顯提高鹵蟲成體內(nèi)EPA 含量。經(jīng)威氏海鏈藻、亞心形扁藻或小球藻強化后，鹵蟲體內(nèi)的不飽和脂肪酸和EPA 含量有顯著提升，表明對鹵蟲脂肪酸組成優(yōu)化有一定的效果。

3 結論

投喂不同微藻對鹵蟲長性能的影響顯著，其中小球藻強化效果最優(yōu)，第14 天鹵蟲體長為3.10 cm，日平均生長速率和特定生長率分別為1.67 mm/d 和10.95%，投喂不同餌料對鹵蟲生物量的影響顯著，其中小球藻強化效果最優(yōu)，第14 天生物量0.98 g，可見小球藻對鹵蟲生長有一定的促進作用。在營養(yǎng)成分方面，不同微藻強化下鹵蟲的粗蛋白含量為39.63%～56.45%，粗脂肪含量為7.04%～10.26%，其中小球藻組粗蛋白和粗脂肪含量最高。不同微藻強化下的鹵蟲氨基酸含量豐富，含有8 種必需氨基酸，其中小球藻組氨基酸含量最為豐富，為44.10 g/100 g 干基，谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸含量最高，依次為5.88、3.84 g/100 g干基和3.51 g/100 g 干基，必需氨基酸占總氨基酸總量的40.27%。不同微藻強化對鹵蟲脂肪酸組成的影響顯著，其中威氏海鏈藻組EPA 含量最高，為17.65%，亞心形扁藻組PUFA 含量最高，為38.77%，小球藻組MUFA含量最高，為41.24%。

綜上所述，經(jīng)小球藻營養(yǎng)強化的鹵蟲生長性能和營養(yǎng)價值有顯著提升，蛋白質(zhì)和脂肪酸含量豐富，氨基酸組成合理，必需氨基酸占總氨基酸總量的40%以上，不飽和脂肪酸比例在65%以上，營養(yǎng)價值較高，在食品領域有較大開發(fā)潛力。同時，采用小球藻替代傳統(tǒng)雞糞培養(yǎng)鹵蟲，可降低因雞糞引起的水質(zhì)和底質(zhì)惡化、病原微生物增加的風險，提高了鹵蟲的生物安全性，符合潔凈生產(chǎn)的要求。