倪興維 汪忠榮 張霞 徐婷婷 李照偉 毛以智 劉霞

摘? 要：禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)是評價(jià)禽流感疫苗免疫效果最常用的方法，具有操作簡單、結(jié)果判定快速且不需要特殊的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但該試驗(yàn)在實(shí)際操作中受多種因素的影響，筆者結(jié)合臨床工作經(jīng)驗(yàn)，初步探討影響禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的因素。

關(guān)鍵詞：禽流感；血凝；血凝抑制；因素

中圖分類號：S831.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）04-0031-03

高致病性禽流感是嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的禽病之一，世界動物衛(wèi)生組織將其列為必須通報(bào)的動物疫病，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類的動物疫病。2004年開始，我國對H5亞型禽流感實(shí)施強(qiáng)制免疫[1]，2017年秋季開始對H7N9禽流感實(shí)施強(qiáng)制免疫[2]，并要求開展免疫效果評價(jià)，為制定相應(yīng)的禽流感防控措施提供依據(jù)。

禽流感免疫效果評價(jià)最常用的方法是血凝和血凝抑制試驗(yàn)，該方法具有操作簡單、結(jié)果判定快速且不需要特殊的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，因此被基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室、養(yǎng)殖場等廣泛使用。該試驗(yàn)操作過程需參照統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)，即《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2020）（以下簡稱《診斷技術(shù)》）?！对\斷技術(shù)》中明確規(guī)定了禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)的操作步驟、結(jié)果判定、注意事項(xiàng)等相關(guān)內(nèi)容，但該試驗(yàn)在實(shí)際操作中受多種因素的影響，存在同一樣本不同檢測人員出現(xiàn)檢測結(jié)果不同的現(xiàn)象。為此，筆者結(jié)合臨床工作經(jīng)驗(yàn)，初步探討血凝和血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的影響因素。

1? 被檢樣本對試驗(yàn)結(jié)果的影響

被檢樣本出現(xiàn)溶血、腐敗、含有非特異性物質(zhì)等現(xiàn)象，均嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，采樣后將樣本傾斜放置，自然析出血清，避免搖晃，防止溶血；若血清樣本不能及時進(jìn)行檢測應(yīng)冷凍保存，冷凍后的血清應(yīng)避免反復(fù)凍融，以免腐敗變質(zhì)。

2? 紅細(xì)胞懸液制備對試驗(yàn)結(jié)果的影響

紅細(xì)胞懸液濃度、純度及配制時間均會影響試驗(yàn)結(jié)果。按照《診斷技術(shù)》要求，該試驗(yàn)使用1％紅細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞應(yīng)來源于3羽無特定病原體（specific pathogen free，SPF）公雞，但在實(shí)際過程中，很難找到能夠符合SPF公雞標(biāo)準(zhǔn)的公雞，為此可增加紅細(xì)胞洗滌次數(shù)，通過眼睛觀察洗滌并離心的紅細(xì)胞懸液，上清液以清澈為準(zhǔn)；采集血液時加入抗凝劑的量應(yīng)適中，過多會抑制凝集現(xiàn)象的產(chǎn)生，影響紅細(xì)胞結(jié)果，過少易產(chǎn)生血凝塊，影響試驗(yàn)觀察；血液采集后沿管壁緩慢打入離心管中，避免用力過猛而破壞紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)；洗滌離心時轉(zhuǎn)速不易過高，一般為2 000ｒ/min，離心5～10 min，最后一次離心10 min；配制1％紅細(xì)胞懸液時，吸取壓積紅細(xì)胞應(yīng)從離心管底部吸取，但不能將移液器槍頭尖貼緊底部，且吸取速度應(yīng)緩慢，轉(zhuǎn)入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中時應(yīng)懸空緩慢加入，且避免吹打清洗槍頭。1％紅細(xì)胞懸液應(yīng)盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，確需延長使用時間時，應(yīng)冷藏保存，且時間一般不超過3 d。

3? 四單位抗原配制對試驗(yàn)結(jié)果的影響

四單位抗原配制時間和濃度均會影響試驗(yàn)結(jié)果，因此使用前應(yīng)按照《診斷技術(shù)》介紹的方法進(jìn)行四單位驗(yàn)證。使用現(xiàn)配四單位抗原和提前配制四單位抗原，試驗(yàn)結(jié)果會出現(xiàn)極顯著差異，其主要原因是抗原在空氣中暴露時間長，導(dǎo)致活性降低，且抗原液的溶劑隨著時間延長而蒸發(fā)，使抗原液濃度增大，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果偏大。因此在實(shí)際操作過程中，應(yīng)合理安排四單位抗原配制時間，盡可能做到現(xiàn)配現(xiàn)用，降低誤差。此外，四單位抗原配制時，吸取轉(zhuǎn)移濃縮抗原應(yīng)先在濃縮抗原瓶中吹打槍頭2～3次，吸取速度應(yīng)緩慢，轉(zhuǎn)移到PBS緩沖液中時應(yīng)懸空加入，且避免吹打清洗槍頭。

4? 移液器的使用對試驗(yàn)結(jié)果的影響

整個試驗(yàn)過程經(jīng)常使用移液器，因此移液器是否正確使用將直接影響試驗(yàn)結(jié)果。在試驗(yàn)過程中，移液器要垂直使用，但在實(shí)際操作過程中尤其是大量檢測時，幾乎不能按要求正確使用，因此在使用移液器時可以有一定的傾斜，但應(yīng)保證每次傾斜角度大致相同；在吸取轉(zhuǎn)移試劑或樣本時，應(yīng)先在試劑或樣本中吹打2～3次以潤濕槍頭（配制1％紅細(xì)胞懸液除外）再吸??；在倍比稀釋抗原和樣本時，每孔的稀釋方式（一檔吸一檔打還是一檔吸二擋打）、稀釋次數(shù)、稀釋力度、稀釋時間、槍頭在反應(yīng)孔內(nèi)的深度等均盡可能相同；加入1％紅細(xì)胞懸液時槍頭在紅細(xì)胞瓶內(nèi)吸取的位置盡可能一致，且紅細(xì)胞瓶應(yīng)不斷搖勻，確保每孔紅細(xì)胞懸液濃度一致；在反應(yīng)孔中加入1％紅細(xì)胞懸液、四單位抗原等試劑時，移液器使用力度不易過大但要干脆利落，避免試劑與孔壁或孔內(nèi)液體相沖，導(dǎo)致加入液體反彈回孔外，且按照從低倍到高倍的順序加入，避免交叉污染。

5? 其他影響因素

試驗(yàn)中使用振蕩器時，振蕩力度不易過大，否則易破壞紅細(xì)胞或抗原、抗體原有結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差；在判定血凝和血凝抑制結(jié)果時，避免反復(fù)顛倒反應(yīng)板，且嚴(yán)格遵守完全凝集和完全抑制凝集這一標(biāo)準(zhǔn)。

影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的細(xì)節(jié)環(huán)節(jié)很多，涉及樣本的采集保存、試劑配制、移液器使用、結(jié)果判定等多方面。因此，在實(shí)際檢測過程中，除嚴(yán)格按照《診斷技術(shù)》中的要求進(jìn)行操作外，還應(yīng)注意操作中的細(xì)節(jié)，從而提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，真正做好禽流感抗體檢測和疫苗免疫效果評價(jià)，為禽流感防控工作提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] 關(guān)于印發(fā)2004年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃的通知[Z]．北京：農(nóng)業(yè)部．2004.

[2] 農(nóng)業(yè)部關(guān)于切實(shí)做好全國高致病性禽流感秋季免疫工作的通知[Z]．北京：農(nóng)業(yè)部．2017.