趙本進(jìn) 何錫忠 林鷙 繆德年 彭麗英

摘? 要：用水包油佐劑Merckinade SDA 25、HS1010和雙向佐劑Montanide ISA 206三種不同佐劑分別制成豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，對(duì)三種疫苗的穩(wěn)定性、黏度、免疫仔豬后的安全性及效力進(jìn)行了比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，以3 000 r/min離心15 min，三種疫苗均無(wú)水析出；三種疫苗的黏度均低于200 cP；三種疫苗按2.0 mL/頭的劑量接種21日齡健康易感豬，試驗(yàn)豬體溫、采食、飲水、精神狀況均正常，均無(wú)不良臨床反應(yīng)，剖檢后各臟器均無(wú)病理變化；加強(qiáng)免疫后21 d，各組試驗(yàn)豬采血，檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗體效價(jià)，結(jié)果表明，佐劑Montanide ISA 206相較Merckinade SDA 25可誘導(dǎo)更高水平抗體效價(jià)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明免疫組可以得到100％的保護(hù)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，確定豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗使用Montanide ISA 206。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；滅活疫苗；佐劑；免疫效果

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2023）04-0056-06

豬圓環(huán)病毒引起仔豬低效生產(chǎn)率，是近年來(lái)嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一。該傳染病主要侵害6～8周齡的仔豬，引起仔豬淋巴系統(tǒng)疾病[1]、漸進(jìn)性體重下降，造成仔豬免疫機(jī)能下降、生產(chǎn)性能降低[2]。目前，大部分豬場(chǎng)通過(guò)接種疫苗預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒，現(xiàn)將我們制備的三種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的安全性和免疫效力進(jìn)行評(píng)估。

1? 材料

1.1 病毒

PCV/SN07-12（微生物保存登記號(hào)：CCTCC No：V201304）病毒由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.2 細(xì)胞

PK-15細(xì)胞（無(wú)PCV1污染）由國(guó)外引進(jìn)，并由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳代保存。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

21日齡的健康易感豬（豬圓環(huán)病毒2型PCR方法檢測(cè)PCV2核酸為陰性，豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PCV2抗體為陰性），購(gòu)自江蘇省鎮(zhèn)江某豬場(chǎng)。

1.4 主要試劑

水包油佐劑Merckinade SDA 25和雙向佐劑Montanide ISA 206購(gòu)自賽德奧生物科技（北京）有限公司；HS1010佐劑購(gòu)自杭州洪晟生物技術(shù)有限公司；豬圓環(huán)病毒 2-dCap ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳捷生物科技有限公司。

2? 方法

2.1 半成品的制備

2.1.1 病毒液的制備

PCV2毒種接種于單層PK-15細(xì)胞，置37 ℃培養(yǎng)箱中吸附30 min，加入含2％的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞，－70 ℃反復(fù)凍融3次，低溫離心，細(xì)胞上清液凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 抗原滅活

病毒液中加入萬(wàn)分之二的二乙烯亞胺進(jìn)行滅活。

2.1.3 半成品檢測(cè)

滅活前病毒液中的病毒含量均應(yīng)大于等于107.0 TCID50/mL；滅活檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變，盲傳3代免疫熒光檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。滅活前后的無(wú)菌檢驗(yàn)應(yīng)均為無(wú)菌。

2.2 疫苗制備

2.2.1 水包油佐劑Merckinade SDA 25疫苗的制備

將半成品與Merckinade SDA 25以3∶1（質(zhì)量比）的比例準(zhǔn)備，置于磁力攪拌器的燒杯中，300 r/min攪拌，緩緩加入Merckinade SDA 25，在15～35 ℃乳化? 10 min。分裝，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 水包油油包水雙向油佐劑Montanide ISA? 206疫苗的制備

取半成品和Montanide ISA 206分別加熱至（30±2）℃，將Montanide ISA 206倒入燒杯中，30 ℃，200 r/min攪拌并逐漸將半成品與Montanide ISA 206以1∶1（質(zhì)量比）的比例緩慢加入。待滅活抗原全部加入后，攪拌速度提高至2 000 r/min，30 ℃持續(xù)攪拌10 min。將容器逐漸降溫，降溫過(guò)程中持續(xù)攪拌，降溫至15 ℃，停止攪拌，將乳液在15 ℃以下靜置24 h。分裝，2～8 ℃保存 備用。

2.2.3 水包油佐劑HS1010佐劑疫苗的制備

將半成品與HS1010佐劑以5∶1（質(zhì)量比）的比例混合后在25～30 ℃充分搖勻，即制成豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。分裝，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

取制備的三種疫苗各10 mL于離心管中，以3 000 r/min離心15 min。

2.4 黏度檢驗(yàn)

將三種疫苗均按2020版《中國(guó)獸藥典》[3]附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.5 無(wú)菌檢驗(yàn)

將三種疫苗均按2020版《中國(guó)獸藥典》[3]附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.6 安全性試驗(yàn)

2.6.1 分組

將20頭21日齡PCV2陰性（核酸和抗體檢測(cè)均陰性）健康仔豬，隨機(jī)分入SDA 25佐劑疫苗組、ISA 206佐劑疫苗組、HS1010佐劑疫苗組和空白對(duì)照組，每組5頭。試驗(yàn)豬分別接種用佐劑Merckinade SDA 25 、Montanide ISA 206或HS1010制成的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗或安慰劑，均按組單獨(dú)隔離飼養(yǎng)。

2.6.2 接種

三種疫苗分別頸部肌內(nèi)注射接種一組試驗(yàn)豬，2.0 mL/頭，對(duì)照組以相同劑量和方法注射生理鹽水。

2.6.3 體溫測(cè)定

免疫前3日和免疫后14日內(nèi)，每天測(cè)定各組豬的體溫。

2.6.4 臨床觀察

觀察14日內(nèi)各組豬的采食、飲水、精神是否正常，有無(wú)不良臨床反應(yīng)，疫苗的吸收情況及注射部位是否有異常反應(yīng)。

2.6.5 剖檢

免疫后14日，剖殺所有試驗(yàn)豬，觀察各臟器是否有病理變化。

2.7 效力試驗(yàn)

2.7.1 分組

將25頭21日齡（PCV2核酸和抗體檢測(cè)均陰性）健康易感豬，隨機(jī)分為5組，每組5頭，第1～3組為免疫組，試驗(yàn)豬分別接種3種豬圓環(huán)病毒2型滅活苗中的1種；第4組為攻毒對(duì)照組，試驗(yàn)豬接種安慰劑；第5組為空白對(duì)照組，試驗(yàn)豬不接種豬圓環(huán)病毒2型滅活苗，也不用豬圓環(huán)病毒2型攻毒。各組分離隔離飼養(yǎng)。

2.7.2 免疫組

5頭豬各頸部肌內(nèi)注射疫苗1.0 mL/頭，一免后14 d用相同劑量加強(qiáng)免疫一次。二免后18 d分別在每頭豬的兩側(cè)腋下和兩側(cè)臀部注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白（KLH/ICFA、0.5 mg/mL），每個(gè)部位分別注射1.0 mL，每頭合計(jì)4.0 mL，同時(shí)腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，10 mL/頭。

2.7.3? 抗體測(cè)定

參照何錫忠等[4]推薦的方法進(jìn)行抗體測(cè)定。

2.7.4 免疫攻毒

參照何錫忠等[4]推薦的方法進(jìn)行免疫攻毒。

3? 結(jié)果

3.1 半成品檢測(cè)

滅活前測(cè)定病毒液中的病毒含量為? ?107.5 TCID50/mL；抗原滅活檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞病變，盲傳3代免疫熒光檢測(cè)未出現(xiàn)熒光，為PCV2陰性。

3.2 物理性狀檢測(cè)

3.2.1穩(wěn)定性檢驗(yàn)

三種疫苗經(jīng)離心后均無(wú)水相析出。

3.2.2 黏度檢驗(yàn)

三種疫苗黏度均小于200 cP，詳見(jiàn)表1。

3.3 無(wú)菌試驗(yàn)

三種疫苗滅活前后均無(wú)菌。

3.4 安全性試驗(yàn)

3.4.1 體溫測(cè)定

將三種疫苗分別以2.0 mL/頭的劑量免疫接種試驗(yàn)豬，免疫后14 d內(nèi)每天測(cè)定各組試驗(yàn)豬的體溫。結(jié)果表明，三種疫苗免疫組豬及對(duì)照組豬的體溫均正常，詳見(jiàn)表2。

3.4.2 臨床觀察

三種疫苗免疫豬后14 d，免疫組豬的采食、飲水、精神狀況均正常，均無(wú)不良臨床反應(yīng)，且疫苗吸收良好，注射部位均無(wú)紅腫、硬塊等局部異常反應(yīng)，與空白對(duì)照組豬的無(wú)明顯差異，詳見(jiàn)表3。

3.4.3 剖檢

將三種疫苗分別以2.0 mL/頭的劑量免疫豬。豬接種疫苗后14 d撲殺，觀察各臟器的病理變化。結(jié)果表明，3個(gè)佐劑疫苗組及對(duì)照組豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和淋巴器官均無(wú)病理變化，詳見(jiàn)表4。

3.5 效力檢驗(yàn)

加強(qiáng)免疫后21 d測(cè)定各組試驗(yàn)豬PCV2抗體效價(jià)。結(jié)果表明，ISA 206和HS1010佐劑疫苗組抗體效價(jià)均不低于1∶3 200；SDA 25佐劑疫苗組抗體效價(jià)較低，介于 1∶800～1∶3 200；對(duì)照組抗體效價(jià)不高于1∶400，詳見(jiàn)表5。

4? 結(jié)論

豬圓環(huán)病毒病的三種疫苗接種仔豬后，仔豬的采食、飲水、體溫均正常，無(wú)精神沉郁等，疫苗注射部位均無(wú)局部異常。三種疫苗對(duì)仔豬兩次免疫后攻毒，免疫豬都得到保護(hù)，說(shuō)明本項(xiàng)目組配制的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗具有良好的免疫效果。該結(jié)果與潘杰等[5]的研究結(jié)果相一致。對(duì)仔豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，三種疫苗對(duì)豬進(jìn)行兩次免疫后，免疫豬的抗體水平均高于空白對(duì)照組豬的，其中Merckinade SDA 25佐劑疫苗產(chǎn)生的抗體水平低于Montanide ISA 206和HS1010佐劑疫苗產(chǎn)生的?？紤]到佐劑產(chǎn)品的成熟度最終選用Montanide ISA 206佐劑。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱子健，唐志芬，楊金雨，等．豬瘟兔化弱毒疫苗與豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗同時(shí)接種的免疫效果評(píng)價(jià)[J]．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2017，39（2）：148-151.

[2] 竇鵬勛，葛建強(qiáng)，張勇，等．3種疫苗單獨(dú)和聯(lián)合免疫對(duì)豬抗體水平的影響[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（31）：15259-15261.

[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典（2020版）[S]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2021．

[4] 何錫忠，趙本進(jìn)，林鷙，等．豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗安全性及免疫效力的評(píng)價(jià)[J]．國(guó)外畜牧學(xué)（豬與禽），2022，42（2）：30-34.

[5] 潘杰，范娟，劉俊斌，等．豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（YZ株）的制備及對(duì)仔豬免疫效力的評(píng)價(jià)[J]．畜牧與獸醫(yī)，2017，49（7）：94-98．