在線固相萃取/二維液相色譜法檢測嬰幼兒配方食品中視黃醇順反異構(gòu)體和α-生育酚手性異構(gòu)體

鐵曉威，謝 敏，黃百芬，施鴻波，任一平*

（1．歐陸分析技術服務（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州 215163；2．浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310057；3．浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

維生素A 是一類視黃醇類化合物，食物中的維生素A 通常以視黃醇酯的形式存在，如視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇乙酸酯［1］。視黃醇具有維持視覺功能，影響免疫反應以及胚胎發(fā)育期間的基因表達等生理功能［2］。由于其側(cè)鏈上有4個雙鍵，在天然條件下存在全反式異構(gòu)體、13-順式異構(gòu)體、11-順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體和9，13-雙順式異構(gòu)體等多種異構(gòu)體。其中全反式異構(gòu)體的生物活性最高，13-順式異構(gòu)體的活性為75%，11-順式異構(gòu)體及9-順式異構(gòu)體的活性更低［3］。天然視黃醇主要以長鏈脂肪酸視黃醇酯的形式存在于乳及乳制品中［1］，除了全反式視黃醇外，還存在部分13-順式視黃醇異構(gòu)體。圖1為全反式視黃醇相關的各種順式視黃醇的結(jié)構(gòu)圖［4］。

圖1 視黃醇與順式異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)Fig．1 Molecular structures of retinol and their cis-isomers

維生素E（各種生育酚異構(gòu)體）是嬰幼兒生長發(fā)育的必需營養(yǎng)素。嬰兒主要通過母乳或嬰幼兒配方乳粉攝取必需的維生素E［5］。在生育酚的4 種結(jié)構(gòu)異構(gòu)體（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚）中，α-生育酚的生物活性最高，根據(jù)工業(yè)合成與天然提取的原料來源不同，α-生育酚又分為dl-α-生育酚（工業(yè)合成）和d-α生育酚（天然來源）。工業(yè)合成的dl-α-生育酚是8 種立體異構(gòu)體外消旋的混合物。而d-α-生育酚來自天然植物油脂，以RRR-α-生育酚（又稱2R，4’R，8’R-α-生育酚）為主要形式［6-8］。不同來源α-生育酚的生物活性有所區(qū)別，RRR-α-生育酚的生物活性是工業(yè)合成dl-α-生育酚的1．36～2倍［9-10］。圖2為4種生育酚異構(gòu)體以及2種α-生育酚手性異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖2 4種生育酚異構(gòu)體以及2種α-生育酚手性異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)Fig．2 Molecular structures of four isomers of tocopherol and two α-tocopherol chiral isomers

現(xiàn)行國標GB5009．82-2016 采用一次皂化，應用C30反相色譜分離，紫外光測定總視黃醇（維生素A），同時檢測α-、β-、γ-和δ-生育酚4個異構(gòu)體［11］。ISO 20633-2015方法采用正相高效液相色譜法測定視黃醇酯類（如視黃醇棕櫚酸酯和乙酸酯）［12］。AOAC 2011．15方法針對嬰幼兒配方乳粉和成人營養(yǎng)品采用反相液相色譜法測定全反式與13-順式視黃醇，再根據(jù)分子量系數(shù)折算成對應酯類［13］。GB 10765 -2021《嬰兒配方食品》、GB 10766-2021《較大嬰兒配方食品》中規(guī)定維生素A的允許用量需折算成視黃醇當量（RE），維生素E 的允許用量需折算成α-生育酚當量（TE）［14-15］。目前與之配套的檢測方法標準 GB 5009．82-2016不能分離檢測視黃醇的異構(gòu)體和α-生育酚的手性異構(gòu)體［11］。

現(xiàn)有的維生素A（視黃醇）和維生素E（生育酚）的主要檢測方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）等［17-21］。上述方法的樣品預處理需經(jīng)過皂化、萃取、洗滌、濃縮、復溶等多個步驟，過程繁瑣耗時，易造成試樣中被測維生素的降解和損失，影響結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。串聯(lián)質(zhì)譜檢測法則會顯著增加檢測成本。

近年來開發(fā)的在線固相萃?。⊿PE）/二維液相色譜方法有所創(chuàng)新，主要用于嬰幼兒配方食品中脂溶性維生素D2和D3的分離檢測，減輕了檢測過程的勞動強度和分析時間，并已在部分實驗室應用［22-25］。而對視黃醇異構(gòu)體和生育酚手性異構(gòu)體的分離一般需要2 個色譜系統(tǒng)或2 次重復進樣分離。在線SPE/二維色譜對視黃醇異構(gòu)體以及α-生育酚手性異構(gòu)體進行同時分離的研究尚未見報道。已有報道中，對強堿皂化樣品在線SPE 所使用的固定相材料均為聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物（PS/DVB），并使用3個以上的清洗溶劑，這對儀器硬件系統(tǒng)提出了較高要求［24-26］。

本研究采用在線固相萃取以及二維液相色譜技術，大幅降低了前處理的復雜程度，增加了可靠性；并實現(xiàn)了4 種生育酚異構(gòu)體、4 種視黃醇異構(gòu)體以及d-α-生育酚和l-α-生育酚的完全分離，經(jīng)紫外和熒光檢測器串聯(lián)檢測進行準確定量，為嬰幼兒配方食品相關檢測提供了更準確、高效和方便的定量方法。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（液相色譜純，德國默克醫(yī)藥生物科技公司）；無水乙醇（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；氫氧化鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；抗壞血酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；超純水由美國PALL公司Cascada系列智能實驗室超純水系統(tǒng)制備。

標準物質(zhì)：全反式視黃醇（純度98．8%，北京曼哈格生物科技有限公司）；13-順式視黃醇、11-順式視黃醇、9-順式視黃醇（純度90%，默克公司）；dl-α-生育酚（純度97．2%）、d-β-生育酚（純度98%）、dγ-生育酚（純度96．2%）、d-δ-生育酚（純度99．6%）購于北京曼哈格生物科技有限公司。以上標準品按GB5009．82-2016規(guī)定經(jīng)濃度校準后使用。

實驗樣品：各種嬰幼兒配方乳粉由市場采購；國際嬰幼兒配方乳粉標準質(zhì)控品1849a 由雅培公司提供。

1.2 在線SPE二維液相色譜系統(tǒng)

在線SPE 色譜系統(tǒng)：使用Waters ACQUITY Arc 四溶劑低壓混合溶劑泵、可更換柱芯夾套式小柱、單體式可控自動六通閥搭建而成。

二維液相色譜系統(tǒng)：包括2 臺Waters ACQUITY Arc 四溶劑低壓混合溶劑泵、1 臺自動進樣器（進樣量5～500 μL）、2 個可控六通閥、雙柱可控柱溫箱、1 臺二極管陣列紫外檢測器和1 臺熒光檢測器搭建而成。

各部件連接方式及閥切換時狀態(tài)如圖3所示。

圖3 在線二維色譜流路圖Fig．3 Online 2D chromatographic flow path diagram

1.3 色譜條件

在線SPE 柱為Waters Oasis HLB（3．9 mm×20 mm，5 μm）；一維色譜柱：NanoChrom ChromCore 五氟苯基（PFP）填料柱（4．6 mm×100 mm，3 μm）；捕集柱：NanoChrom ChromCore（2．1 mm×30 mm，10 μm）；二維色譜柱：NanoChrom UniChiral CND（4．6 mm×150 mm，5 μm）。流動相及梯度如表1所示。

表1 在線SPE、一維與二維色譜條件Table 1 Online SPE，1D and 2D detection reference conditions

樣品進樣量為500 μL，進樣溫度為10 ℃，SPE柱切割時間為8．0～8．8 min，一維PFP柱的總視黃醇切割時間為13．0～14．0 min，生育酚的一維切割時間為28．0～30．0 min；PDA 檢測波長：325、295 nm；熒光檢測波長：EX：294 nm，EM：328 nm。PDA通過二維切換閥后與熒光檢測器串聯(lián)。

1.4 樣品前處理方法

樣品皂化參照GB 5009．82-2016的方法操作［11］。稱取1 g樣品于50 mL離心管中，加入0．5 g抗壞血酸和8 mL溫水溶解，加入11 mL BHT-乙醇溶液（0．2 g/mL），渦旋混勻30 s，再加入6 mL氫氧化鉀甲醇溶液（1∶1），渦旋混勻后于（80±2） ℃條件下水浴振蕩30 min，立即冷卻，用水定質(zhì)量至30 g，離心5 min后，取上清液過0．22 μm尼龍濾膜至棕色進樣瓶中，按“1．3”色譜條件進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 在線SPE柱的選擇與條件優(yōu)化

在線SPE 的主要目的是去除樣品皂化液中的大部分強堿與雜質(zhì)，并富集目標物。實驗對比了Waters Oasis HLB（3．9 mm×20 mm，5 μm）柱和Agilent PLRP-S PS/DVB（12．5 mm×4．6 mm，15～20 μm）柱的效果。結(jié)果顯示，兩柱均可富集和凈化皂化液中的視黃醇和生育酚；一維色譜上HLB 柱的干擾成分主要出現(xiàn)在視黃醇前，而PS/DVB 柱主要出現(xiàn)在視黃醇后。相比而言，HLB 柱和雜峰的分離度更優(yōu)，便于切割至二維柱，因此選擇HLB柱為在線SPE柱。

針對HLB進一步優(yōu)化了甲醇-水比例、SPE凈化時間以及切割至一維色譜的時間，結(jié)果顯示，在甲醇-水體積比為30∶70，凈化8 min，8．0～8．8 min切割的條件下，待測物的回收率最高，SPE洗脫液的pH值為中性對一維柱不產(chǎn)生損害，且一維色譜峰形對稱。

2.2 一維色譜條件的優(yōu)化

在一維色譜分析中，需實現(xiàn)對總視黃醇以及4 種生育酚異構(gòu)體之間的分離，特別是β-生育酚與γ-生育酚之間的完全分離。由于實際樣品中β-生育酚的含量較低，使用熒光檢測器在EX 為294 nm，EM為328 nm 下檢測可獲得較高的靈敏度。對比了NanoChrom ChromCore PFP（4．6 mm×150 mm，3 μm）、Agilent Poroshell PFP（4．6 mm×150 mm，2．7 μm）、Alphasil S-PFP（4．6 mm×150 mm，3．5 μm）和ThermoFisher PFP（4．6 mm×150 mm，2．6 μm）4 種一維色譜柱的分離效果（圖4）。結(jié)果顯示，上述色譜柱均實現(xiàn)了滿意的分離效果?？紤]到實驗成本，采用NanoChrom ChromCore PFP 色譜柱。

圖4 一維色譜柱對樣品分離效果的影響Fig．4 Effects of 1D columns on samples seperation A：NanoChrom ChromCore PFP column，B：Agilent Poroshell PFP column，C：Alphasil S-PFP column，D：ThermoFisher PFP column；1：δ-tocopherol，2：β-tocopherol，3：γ-tocopherol，4：α-tocopherol，5：total retinol

2.3 二維色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 視黃醇異構(gòu)體的分離優(yōu)化視黃醇異構(gòu)體通常使用硅膠填料的正相色譜或C30的反相色譜進行分離［17-18］，由于流動相和一維兼容的原因，在二維色譜中使用反相色譜系統(tǒng)是優(yōu)選方案。NanoChrom UniChiral CND 是纖維素型手性色譜柱，由3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯涂敷在硅膠填料上獲得，該柱可使用水與甲醇混合作為流動相。本實驗比較了反相C30柱與CND 手性柱的洗脫效果，結(jié)果顯示，4種視黃醇在CND 柱上可實現(xiàn)較好分離，視黃醇的主要異構(gòu)體全反式視黃醇與13-順式視黃醇完全達到基線分離；C30柱的分離度較差，9-與11-順式視黃醇不能實現(xiàn)分離。因此選擇NanoChrom UniChiral CND柱為二維色譜柱。

2.3.2 α-生育酚手性異構(gòu)體的分離優(yōu)化選取合成α-生育酚（全消旋）的醋酸酯原料和天然α-生育酚（從植物油脂中提取）分別進行皂化處理、SPE 凈化、一維分離，將一維α-生育酚切割至二維CND 柱優(yōu)化分離條件。α-生育酚（全消旋）完全被分離成2 個峰，且其峰高與面積均一致；而來源于植物油脂的α-生育酚（d-α-生育酚）標準品進樣時，在相同色譜條件下僅出現(xiàn)1個峰。

為進一步證實本方法，選取1849a 國際質(zhì)控樣（只添加天然RRR-α-生育酚）進行檢測，二維譜圖顯示單峰（d-α-生育酚）。由于無法獲得l-α-生育酚標準樣品，推測合成生育酚中的8 種異構(gòu)體［2］在二維CND手性柱上分離成2個組分，前者為d型，后者為l型。本文嘗試用C30反相柱對α-生育酚進行手性分離，未能實現(xiàn)完全分離。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系、檢出限與定量下限分別準確吸取全反式視黃醇、13-順式視黃醇、d-α-生育酚和lα-生育酚單標儲備液，置于不同的棕色容量瓶中，用90%甲醇水溶液定容配制成不同質(zhì)量濃度的混合標準系列溶液。取各化合物的標準溶液逐級稀釋，分別以信噪比S/N≥3和S/N≥10確定儀器檢出限和定量下限，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得到線性方程。由表2 可知，全反式視黃醇、13-順式視黃醇的線性范圍為0．1 ～ 5．0 mg/L，d-α-生育酚、l-α-生育酚的線性范圍為1．0 ～ 30．0 mg/L，相關系數(shù)均大于0．999，檢出限分別為17 μg/100 g、17 μg/100 g、89 μg/100 g、96 μg/100 g，定量下限分別為53 μg/100 g、56 μg/100 g、290 μg/100 g和340 μg/100 g。

表2 目標物的線性關系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，detection limits and quantitation limits of analytes

2.4.2 回收率與相對標準偏差依據(jù)全反式視黃醇和dl-α-生育酚的定量下限確定低、中、高3 個加標濃度，稱取不同含量的樣品進行3水平加標回收實驗，同時做6批次平行測定，考察本方法的重現(xiàn)性（見表3）。結(jié)果表明，目標物的平均回收率為90．9% ～ 106%，相對標準偏差（RSD）不大于2．8%。

表3 目標物的回收率及標準標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of analytes（n=6）

2.5 實際樣品測定

隨機選取市售的10 批次不同品牌的嬰幼兒配方乳粉（編號1～10），乳粉質(zhì)控樣品1849a（編號為11），采用“1．4”方法處理樣品。在最優(yōu)儀器條件下，按“1．3”色譜條件，同時分析乳粉質(zhì)控樣品1849a和實際樣品，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，10款市售嬰幼兒配方乳粉的視黃醇含量和α-生育酚含量均高于標識值，且乳粉質(zhì)控樣品1849a測試結(jié)果均在控制范圍內(nèi)。

表4 實際樣品測定結(jié)果Table 4 Determination results of actual samples

3 結(jié) 論

本研究建立了在線固相萃取/二維液相色譜分離檢測嬰幼兒配方食品中全反式視黃醇、13-順式視黃醇和α-生育酚手性異構(gòu)體的方法，并對實際樣品和國際質(zhì)控樣進行了檢測。該方法自動化程度高，實現(xiàn)了主要異構(gòu)體的分離和定量，為準確評價嬰幼兒食品中維生素A 和E 的生物活性提供了新的解決方案。