羅氏沼蝦Doublesex 基因的原核表達(dá)與蛋白純化

王瑞睿，馬克異

（1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）為 節(jié)肢動物門（Arthropoda）十足目（Decapoda）長臂蝦科（Palaemonidae）沼蝦屬（Macrobrachium）重要的淡水養(yǎng)殖蝦類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。羅氏沼蝦雄性個(gè)體顯著大于雌性個(gè)體，展現(xiàn)出典型的性別二態(tài)性。對其性別調(diào)控機(jī)制的研究將有利于促進(jìn)甲殼動物性控機(jī)制的解析。同時(shí)，對羅氏沼蝦的性控育種發(fā)展和產(chǎn)業(yè)價(jià)值的提升也具有深遠(yuǎn)的影響?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在遺傳性別決定（Genetic sex determination）的過程中，性別決定與分化通常由多基因調(diào)控。在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了一系列參與性別決定與分化的關(guān)鍵基因［2-5］。與之類似，在無脊椎動物中，不同物種間性別決定與分化的調(diào)控關(guān)鍵基因也大不相同。例如，果蠅（Drosophila melanogaster）中關(guān)鍵的性控基因有Sxl和Dsx［6］，而線蟲中（Caenorhabditis elegans）則是Xol-1和Her-1等基因［7］。目前，在羅氏沼蝦中也發(fā)現(xiàn)了一些性別決定與分化相關(guān)基因［8-9］，表明甲殼動物羅氏沼蝦也存在類似的基因調(diào)控性別決定與分化機(jī)制。然而，甲殼動物促雄腺作為雄性個(gè)體特有的內(nèi)分泌器官，也具有影響性別分化的功能。因此，甲殼動物的性別決定與分化機(jī)制可能更復(fù)雜［10-11］。Dmrt-like［9］和Dsx（Doublesex）［6］等基因均屬于一個(gè)大基因家族，即Dmrt基因家族，該家族由果蠅Dsx同源基因和線蟲Mab-3同源基因組成。作為轉(zhuǎn)錄因子，該基因家族的主要特征是其所編碼的蛋白質(zhì)均含有保守且富含半胱氨酸的Doublesex/Mab-3 結(jié)構(gòu)域（DM 結(jié)構(gòu)域）［12-13］。Dmrt基因家族在魚類、昆蟲類以及甲殼類等動物中均有發(fā)現(xiàn)［14-16］，而其中Dsx被認(rèn)為是Dmrt基因家族中作為性別決定級聯(lián)通路中參與調(diào)控性別決定與分化的末端節(jié)點(diǎn)基因［17-18］。目前，蝦蟹類已有轉(zhuǎn)錄因子Dsx的克隆和表達(dá)分析的報(bào)道［19-23］，且中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的IAG啟動子區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子Dsx結(jié)合的順式作用元件，表明甲殼動物性別決定與分化相關(guān)基因IAG的表達(dá)可能受Dsx的調(diào)控［21］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對羅氏沼蝦性別決定與分化機(jī)制的研究，主要集中在IAG和Dmrt-like基因的功能方面，有關(guān)羅氏沼蝦Dsx（命名為MrDsx）作用機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究仍未見報(bào)道。除DM 結(jié)構(gòu)域外，不同物種的Dsx 蛋白在其他區(qū)域的序列保守性較低。因此，有必要對MrDsx進(jìn)行單獨(dú)研究，以探明其是否影響羅氏沼蝦IAG的表達(dá)從而發(fā)揮性別決定與分化的調(diào)控作用。大量研究表明，在大腸桿菌中誘導(dǎo)原核重組蛋白表達(dá)，是研究蛋白特征及功能的一種重要方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于前期獲得的羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，克隆獲得MrDsx的開放閱讀框ORF 序列。構(gòu)建羅氏沼蝦MrDsx基因的原核表達(dá)載體，為羅氏沼蝦MrDsx后續(xù)的抗體制備、蛋白質(zhì)功能研究和互作蛋白的篩選奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究MrDsx在羅氏沼蝦性別決定與分化中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021 年3—5 月在上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)使用的菌種大腸桿菌DH 5α 和BL 21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存。T4 DNA 連接酶和pGEM-T 載體購自Promega 生物技術(shù)有限公司（北京）；pET-32a（+）質(zhì)粒保存于上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；質(zhì)粒小提試劑盒購自Tiangen 生化科技有限公司（北京）；蛋白Marker 購自南京海利克斯信息技術(shù)有限公司；Hind III 和XhoI 內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司（大連）；LB 固體、液體培養(yǎng)基、IPTG 和X-gal 購自Sangon Biotech 公司（上海）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 通過本實(shí)驗(yàn)之前的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（未發(fā)表）獲得了羅氏沼蝦MrDsx的ORF 序列，利用Primer 3.0 在線設(shè)計(jì)MrDsx的特異性引物組，包括Dsx-F：CCCAAGCTTGGA TGTATGAAGAGGGAGAATACG（下劃線為Hind III 酶切位點(diǎn)，斜體為保護(hù)堿基）和Dsx-R：CCGCTCGAGAAGTTGATGTTTCATTGACTTC（下劃線為XhoI 酶切位點(diǎn)，斜體為保護(hù)堿基）。

1.2.2MrDsx原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以保存的羅氏沼蝦性腺cDNA 為模板，利用MrDsx基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；回收PCR 產(chǎn)物，連接 pGEM-T 載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α；將擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性克隆提取質(zhì)粒后，送至上海Sangon Biotech 公司測序鑒定。使用Hind III和XhoI 內(nèi)切酶對鑒定的陽性重組pGEM-T 質(zhì)粒和pET-32a（+）空質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)電泳檢測。膠回收上述目的基因及線性化載體pET-32a（+），4 ℃連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH 5α。經(jīng)測序鑒定后命名為重組質(zhì)粒pET-32a-MrDsx。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET-32a-MrDsx的原核表達(dá) 將提取的重組質(zhì)粒pET-32a-MrDsx轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21（DE3）后，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落于含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)；之后，按1：200 轉(zhuǎn)接到LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期（OD ≈ 0.7），分別加入不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，37 ℃誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)結(jié)束后將菌體進(jìn)行超聲破碎，分別收集裂解后的菌體上清液和菌體沉淀。同時(shí)，將部分菌體沉淀用8 mol/L 尿素進(jìn)行溶解，之后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，以確定蛋白表達(dá)量及純度。

1.2.4 重組蛋白pET-32a-MrDsx的純化及Western blot免疫印跡分析 使用蛋白純化試劑盒（MagneHis?Protein Purification System，Promega），具體純化步驟如下：洗滌緩沖液和洗脫緩沖液分別加入8 mol/L 尿素，混勻備用；向上述未純化的粗蛋白溶液中加入500 mmol/L NaCl，隨后加入適量Ni 混勻并靜置30 min；放入磁力吸附架使結(jié)合了重組蛋白的Ni 被吸附在管壁，移除上清；加入洗滌緩沖液充分洗滌Ni，放入磁力吸附架，移除上清液，重復(fù)3 次；加入洗脫緩沖液，使洗脫緩沖液與Ni混勻，靜置10 min后放入磁力吸附架，收集上清液，即純化后的重組蛋白溶液，吸取部分純化后的蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE，檢測pET-32a-MrDsx 蛋白的純化結(jié)果；將重組蛋白加入到透析袋中進(jìn)行透析，透析結(jié)束后分裝到2 mL 的收集管中，超低溫保存?zhèn)溆?。Western blot 免疫印跡方法參照之前的研究［24］，用以鑒定重組蛋白pET-32a-MrDsx的表達(dá)特征。

1.2.5 重組蛋白pET-32a-MrDsx 的質(zhì)譜分析 將純化后的重組蛋白pET-32a-MrDsx 送至上海中科新生命生物科技有限公司，使用QE 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。利用胰蛋白酶對重組蛋白進(jìn)行消化，然后使用LCMSMS 和MASCOT 等質(zhì)譜相關(guān)軟件對蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MrDsx 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

PCR 產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果顯示，在660 bp 附近出現(xiàn)單一DNA 的特異性條帶（圖1）。該DNA條帶大小與預(yù)期目的基因大小相符。PCR 產(chǎn)物連接pGEM-T 載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α、測序結(jié)果（圖2）經(jīng)比對后與目的序列一致，表明以羅氏沼蝦性腺cDNA 為模板，已成功獲得了羅氏沼蝦MrDsx基因的ORF 序列（GenBank 登錄號：OQ993218）。

圖1 MrDsx 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of MrDsx gene

圖2 MrDsx 基因的ORF 序列Fig.2 ORF sequences of MrDsx gene

2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-MrDsx 的雙酶切鑒定結(jié)果

使用Hind III 和XhoI 內(nèi)切酶雙酶切pET-32a-MrDsx陽性重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳后，可觀察到與2.1 中PCR 鑒定結(jié)果一致的DNA 條帶以及約5 900 bp 的載體條帶。插入的片段測序比對后證實(shí)為羅氏沼蝦MrDsx基因的ORF 序列，表明重組質(zhì)粒pET-32a-MrDsx構(gòu)建正確（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒pET-32a-MrDsx 的雙酶切鑒定Fig.3 Double-enzyme digestion identification of pET-32a-MrDsx recombinant plasmid

2.3 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)效果

分別取超聲裂解后的菌體上清和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果（圖4）顯示，重組蛋白主要存在于超聲裂解后的菌體沉淀中，即重組蛋白是以包涵體的形式存在于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。而且，只有轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pET-32a-MrDsx的大腸桿菌菌株在約55 kD的位置出現(xiàn)蛋白條帶，而轉(zhuǎn)化了空載體pET-32a 的對照組菌株無此蛋白條帶（圖4）。本試驗(yàn)所用的帶His 標(biāo)簽的pET-32a 空載體表達(dá)的蛋白大小約為30 kD，預(yù)測的羅氏沼蝦MrDsx基因編碼的蛋白分子量約為25 kD，因此重組后的蛋白分子量大小約為55 kD，與SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，證明pET-32a-MrDsx 融合蛋白表達(dá)成功。

圖4 pET-32a-MrDsx 的原核表達(dá)Fig.4 Prokaryotic expression of pET-32a-MrDsx

2.4 IPTG 誘導(dǎo)濃度的確定

IPTG 誘導(dǎo)6 h 后，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，在IPT G 濃度為0.1～0.5 mmol/L 時(shí)，重組蛋白pET-32a-MrDsx 的表達(dá)量可達(dá)到峰值（圖5），此范圍內(nèi)的IPTG 濃度變化并未顯著改變重組蛋白pET-32a-MrDsx 的表達(dá)量。因此，對于重組蛋白pET-32a-MrDsx 而言，IPTG 誘導(dǎo)濃度范圍可設(shè)定為0.1～0.5 mmol/L，最佳誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L。

圖5 IPTG 濃度對pET-32a-Dsx 表達(dá)的影響Fig.5 Effects of IPTG concentration on pET-32a-Dsx expression

2.5 重組蛋白pET-32a-MrDsx 的純化及復(fù)性效果

對純化及復(fù)性后重組蛋白pET-32a-MrDsx 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果（圖6A）顯示，在蛋白相對分子量約55 kD 處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果相符。相比蛋白純化前，純化后的SDS-PAGE 蛋白條帶單一，無其他雜質(zhì)條帶，表明重組蛋白pET-32a-MrDsx 純化成功。Western blot 結(jié)果（圖6B）顯示，重組蛋白pET-32a-MrDsx 可與鼠抗His-tag 單克隆抗體特異性結(jié)合，在蛋白相對分子量約55 kD 的位置出現(xiàn)單一且清晰的特異性條帶，說明純化復(fù)性后獲得了可溶性的羅氏沼蝦pET-32a-MrDsx 重組蛋白。

圖6 重組蛋白pET-32a-MrDsx 純化后的Western blot 鑒定Fig.6 Identification of purified recombinant protein pET-32a-MrDsx by Western blot

2.6 重組蛋白pET-32a-MrDsx 的質(zhì)譜分析結(jié)果

質(zhì)譜分析過程將重組蛋白pET-32a-MrDsx 打成肽段，通過質(zhì)譜分析獲得重組蛋白pET-32a-MrDsx 的部分肽段的質(zhì)荷比（圖7）。質(zhì)譜分析顯示共有14 個(gè)肽段與理論的氨基酸序列相符合，匹配度達(dá)到100%，并且這些肽段共覆蓋理論序列的61.36%，再次證明羅氏沼蝦pET-32a-MrDsx重組蛋白原核表達(dá)成功。

圖7 質(zhì)譜分析重組蛋白pET-32a-MrDsx 的部分肽段質(zhì)荷比Fig.7 Mass-to-charge ratio of some peptides of recombinant protein pET-32a-MrDsx analyzed by mass spectrometry

3 討論

D oublesex（Dsx）是果蠅性別決定級聯(lián)通路的關(guān)鍵終末轉(zhuǎn)錄因子，通過性別特異性選擇性剪接調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控性別分化方向［6］。在大型水蚤（Daphnia magna）中，Dsx基因在雄性特異性組織中表達(dá)，從而調(diào)控雄性性狀發(fā)育［25］。紅鰲螯蝦（Cherax quadricarinatus）中分離鑒定出的Dsx基因在卵巢發(fā)育的早期階段表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄水平，該基因被沉默后可引起紅鰲螯蝦IAG基因表達(dá)上調(diào)，表明紅鰲螯蝦Dsx基因可能參與了其性腺分化過程［22］。類似地，在中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）和中華絨螯蟹中也分離出了Dsx基因，敲降該基因后，兩者的IAG基因的表達(dá)量均顯著下降，也表明了Dsx基因可能參與蝦蟹類的性別分化過程［20-21］。

本研究將羅氏沼蝦MrDsx基因的開放閱讀框（ORF）進(jìn)行了完整克隆，成功構(gòu)建pET-32a-MrDsx 原核表達(dá)載體，并表達(dá)純化了該重組蛋白。作為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，原核生物大腸桿菌是目前用于異源表達(dá)重組蛋白的重要手段［26-30］。借助胞質(zhì)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可將外源蛋白以可溶性或非可溶性的形式表達(dá)［31］。因此，本研究使用了原核表達(dá)中普遍應(yīng)用的、可被高效誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌BL21 菌株。大量研究表明，原核表達(dá)蛋白內(nèi)部信號肽結(jié)構(gòu)有利于提高蛋白可溶性，一定程度降低原核表達(dá)重組蛋白的主要形式——包涵體。羅氏沼蝦MrDsx基因所編碼的蛋白并不具有信號肽結(jié)果。因此，不具有信號肽結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致羅氏沼蝦MrDsx 重組蛋白形成包涵體的因素之一。本研究使用高濃度尿素對包涵體進(jìn)行溶解。該過程降低了蛋白結(jié)構(gòu)柔韌性，增強(qiáng)了蛋白的溶解能力；接著采用Ni 柱純化，去除了雜質(zhì)菌體蛋白；最后利用透析法去除變性劑，促進(jìn)蛋白折疊，使重組蛋白復(fù)性。研究表明，原核表達(dá)的蛋白表達(dá)量與IPTG 的誘導(dǎo)濃度息息相關(guān)。本研究中，在IPTG 濃度為0.1～0.5 mmol/L 時(shí)，重組蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值；誘導(dǎo)濃度大于0.5 mmol/L 時(shí)，蛋白表達(dá)量下降，說明IPTG 濃度過高對大腸桿菌的生長存在抑制作用，不利于重組蛋白pET-32a-MrDsx 的高效表達(dá)。因此，從節(jié)約試劑和降低對大腸桿菌生長的影響等方面考慮，誘導(dǎo)重組蛋白pET-32a-MrDsx 的最佳IPTG 濃度為0.1 mmol/L。因重組蛋白pET-32a-MrDsx 可與帶His 標(biāo)簽的單克隆抗體特異結(jié)合，經(jīng)Western blot 檢測后，在預(yù)測的蛋白分子量大小的位置出現(xiàn)了特征性的單一蛋白條帶，進(jìn)一步的質(zhì)譜分析也顯示該重組蛋白的氨基酸序列與預(yù)期相符合，證明該蛋白是羅氏沼蝦MrDsx基因的開放閱讀框與pET-32a 原核表達(dá)載體的重組蛋白。His 標(biāo)簽在蛋白互作研究中有著廣泛的應(yīng)用。本研究選擇His 標(biāo)簽，不僅方便了His 標(biāo)簽的單抗特異結(jié)合，也為未來利用Pull down 技術(shù)篩選與MrDsx 相互作用的重要蛋白提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆了羅氏沼蝦MrDsx基團(tuán)的ORF 序列，與載體pET-32a（+）連接后，構(gòu)建了羅氏沼蝦MrDsx基因的原核表達(dá)載體。結(jié)果表明，利用IPTG 對陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，首次獲得了相對分子量約為55 kD 的羅氏沼蝦MrDsx基因的重組蛋白，且在IPTG 濃度為0.1～0.5 mmol/L 時(shí)重組蛋白pET-32a-MrDsx 的表達(dá)量達(dá)到峰值?？扇苄苑治鲲@示該重組蛋白pET-32a-MrDsx 以包涵體為主要表達(dá)形式，經(jīng)高濃度尿素溶解、Ni 柱純化和透析復(fù)性后可實(shí)現(xiàn)活性pET-32a-MrDsx 重組蛋白的大量回收，為該基因后續(xù)的蛋白功能研究、互作蛋白的篩選，以及進(jìn)一步研究MrDsx 在羅氏沼蝦性別決定與分化中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。