馬荊鄂，曾成瑤，周 敏，譚玉文，朱學(xué)農(nóng)，饒友生，許繼國(guó)

（南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究院/江西省地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330032）

【研究意義】寧都黃雞是江西省特優(yōu)質(zhì)型黃羽肉雞，具有“三黃”（喙、脛、羽）、“五紅”（冠、髯、臉、眼圈、耳葉）［1］、性早熟、體小、矮腳等特征，以及肉質(zhì)鮮美、口感豐富等優(yōu)點(diǎn)。其肌肉中的蛋白質(zhì)及必需氨基酸含量、單位面積肌纖維數(shù)量等指標(biāo)均優(yōu)于國(guó)內(nèi)多個(gè)肉雞品種［2-4］，因此深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，但寧都黃雞繁殖性能低，影響其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。雞冠性狀不僅是消費(fèi)者選購(gòu)禽肉產(chǎn)品的重要參考因素，同時(shí)冠長(zhǎng)、冠高與產(chǎn)蛋量、平均蛋重等繁殖性狀有顯著相關(guān)性［5-7］。因此，對(duì)雞冠性狀進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，是優(yōu)質(zhì)肉雞選育的重要任務(wù)之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雞冠是雞頭部的皮膚衍生物，缺乏羽毛，公雞雞冠十分發(fā)達(dá)，是其第二性征，是衡量雞性成熟的重要指標(biāo)［8-9］。雞冠始于上喙的一個(gè)區(qū)域，位于前鼻突的后方，由表皮、真皮和中央層組成。表皮具有角質(zhì)層和生發(fā)層，角質(zhì)層位于表皮最外層，對(duì)雞冠皮下組織起保護(hù)作用，防止皮下組織受到感染［10］。雞冠是一類(lèi)變異豐富且易于觀察的外觀性狀，其相關(guān)研究多從基因的角度進(jìn)行遺傳分析，目前已發(fā)現(xiàn)一些常見(jiàn)冠型的改變均源自基因序列變異和異位表達(dá)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，AR、BMP2、CHADL、DRD1、EDN1、GARNL1、HSPA5、HSPA8、STK32A、PIK3R1、VIP1、VIP2和WNT9A基因具有調(diào)節(jié)雞冠生長(zhǎng)發(fā)育的作用，是雞冠性狀選育的重要候選基因［12-16］。【本研究切入點(diǎn)】生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）基因能夠調(diào)節(jié)糖類(lèi)、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，促進(jìn)機(jī)體各個(gè)組織的生長(zhǎng)發(fā)育［17］。GH基因序列中存在多個(gè)SNP［18-19］，部分多態(tài)性位點(diǎn)與開(kāi)產(chǎn)體質(zhì)量、開(kāi)產(chǎn)日齡以及生長(zhǎng)性狀有顯著關(guān)聯(lián)性［20］。目前關(guān)于GH基因SNP 與寧都黃雞公雞雞冠性狀的關(guān)聯(lián)分析少見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究GH基因上游調(diào)控區(qū)域（5'-側(cè)翼區(qū)）和內(nèi)含子1 區(qū)域序列單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)對(duì)寧都黃雞公雞雞冠性狀的影響，尋找地方雞種雞冠性狀選育的分子標(biāo)記。選取前期篩選的GH基因SNP，采用SAS 軟件分析雞冠性狀關(guān)聯(lián)的SNP，解析優(yōu)勢(shì)基因型，為寧都黃雞雞冠性狀的分子輔助選育積累理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為改良寧都黃雞的繁殖性狀奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的499 只4～16 周齡寧都黃雞公雞的雞冠表型數(shù)據(jù)來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室前期記錄［3］，包括7 個(gè)周齡（分別為4、6、8、10、14、16 周齡）的冠高、冠長(zhǎng)、冠厚、肉垂長(zhǎng)、肉垂厚和冠齒數(shù) 6 個(gè)雞冠性狀指標(biāo)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因頻率和基因型頻率 假設(shè)基因座兩個(gè)等位基因分別為A、a，基因型為AA、Aa、aa，則基因頻率（p、q）、基因型頻率（PAA、PAa、Paa）計(jì)算公式如下：

式中，n表示該基因型個(gè)體數(shù)。

1.2.2 Hardy-weinberg 平衡狀態(tài)檢驗(yàn) 對(duì)處于Hardy-weinberg 平衡狀態(tài)下的群體，可以通過(guò)χ2適合性檢驗(yàn)判定。

式中，Ei為理論期望值，Oi為實(shí)際觀察值，n為等位基因數(shù)。

1.2.3 遺傳多樣性分析 采用群體雜合度（Heterozygosity,He）、群體純合度（Homozygosity,Ho）和多態(tài)信息含量（Polymorphism information content,PIC）等衡量種群內(nèi)的遺傳多樣性。

式中，Pi為任意位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因頻率。

1.2.4 基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析 以實(shí)驗(yàn)室前期篩查到的GH基因5'-側(cè)翼區(qū)域和內(nèi)含子1 中的45 個(gè)SNP 為雞冠性狀候選標(biāo)記位點(diǎn)［21］，采用SAS8.1 軟件GLM 模塊，對(duì)所篩選SNP 與雞冠性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，采用的混合模型如下：

式中，Y為表型變異，μ為群體均值，G為基因型效應(yīng)，D為母體效應(yīng)，H為批次效應(yīng)，e為殘差效應(yīng)。

等位基因的加性效應(yīng)是用2 個(gè)純合子離差的均值計(jì)算，加性效應(yīng)=(AA-BB)/2；等位基因顯性效應(yīng)是用雜合子與2 種純合子均值的離差來(lái)計(jì)算，顯性效應(yīng)=AB-(AA+BB)/2。其中，AA、BB 和AB分別為基因型AA、BB和AB的表型最小二乘均值。顯著水平檢驗(yàn)水平為雙側(cè)0.05，對(duì)于多重比較采用Bonferroni 法進(jìn)行校正，在遺傳多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析中，校正次數(shù)為同一基因中檢驗(yàn)的不同SNP個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GH 基因45 個(gè)SNP 基因頻率和基因型頻率分析

分別計(jì)算GH基因5'-側(cè)翼區(qū)域和內(nèi)含子1 中45 個(gè)SNP 的基因頻率、基因型頻率，以及He、Ho、PIC，結(jié)果顯示（表1），有14 個(gè)位點(diǎn)的PIC＞ 0.25；經(jīng)χ2適應(yīng)性檢驗(yàn)顯示，25 個(gè)位點(diǎn)的χ2值沒(méi)有達(dá)到顯著水平，處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)。

2.2 GH 基因SNP 與雞冠性狀的相關(guān)性

采用SAS 軟件將45 個(gè)SNP 與不同雞冠性狀指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，選取P＜0.05 的位點(diǎn)。結(jié)果（表2）表明，13 個(gè)SNP 與7 個(gè)冠高性狀指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，包括G1271800A、C1272225T、G1272384A、G1272611A、T1271213G、C1271211T、G1271198A、C1271195A、C1270902T、T1270805C、A1270769G、T1270451C 和G1270155A。其中，A1270769G 與7 個(gè)周齡冠高指標(biāo)均顯著關(guān)聯(lián)，G1272611A 與5 個(gè)周齡冠高指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，T1271213G、C1270902T 分別與4個(gè)周齡冠高指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)。5 個(gè)位點(diǎn)與16 周齡冠高顯著關(guān)聯(lián)，分別為C1272225T、G1272384A、G1272611A、A1270769G、T1270451C。經(jīng)過(guò)Bonferroni 法校正后，A1270769G 與4 周齡冠高、C1272225T 與16 周齡冠高相關(guān)性達(dá)到顯著水平。

表2 與寧都黃雞冠高顯著相關(guān)的13 個(gè)SNP 位點(diǎn)P 值Table 2 P value of 13 SNPs significantly related to comb height of Ningdu yellow chickens

10 個(gè)SNP 與7 個(gè)冠長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)（表3），分別為C1272225T、G1272611A、C1271211T、C1270902T、A1270769G、G1270640C、T1270578C、G1270503C、T1270451C、C1270032T。其中，C1271211T 與6 個(gè)周齡冠長(zhǎng)指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，C1270032T 與5 個(gè)周齡冠長(zhǎng)指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，G1272611A 與5 個(gè)周齡冠長(zhǎng)指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)；與16 周齡冠長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)為C1272225T、G1272611A、C1271211T、T1270451C。經(jīng) 過(guò)Bonferroni 法校正后，G1272611A 與16 周齡冠長(zhǎng)的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。

表3 與寧都黃雞冠長(zhǎng)顯著相關(guān)的10 個(gè)SNP 位點(diǎn)P 值Table 3 P value of 10 SNPs significantly related to comb length of Ningdu yellow chickens

表4 與寧都黃雞其他雞冠性狀顯著相關(guān)的4 個(gè)SNP 位點(diǎn)P 值Table 4 P value of 4 SNPs significantly related to other comb traits of Ningdu yellow chickens

位點(diǎn) C1271836T 分別與8 周齡冠厚、10 周齡肉垂長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)，T1271646G 與16 周齡肉垂厚顯著關(guān)聯(lián)，C1272225T 與4 周齡冠厚顯著關(guān)聯(lián)，A1272784G與16 周齡肉垂厚顯著關(guān)聯(lián)（表 4）。經(jīng)過(guò) Bonferroni法校正后，均未達(dá)到顯著水平。此外，供試的 45個(gè) SNP 與冠齒數(shù)性狀均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。

2.3 A1270769G、G1272611A 位點(diǎn)不同基因型與寧都黃雞冠高性狀的相關(guān)性

分析寧都黃雞公雞GH基因A1270769G、G1272611A 兩個(gè)位點(diǎn)不同基因型與7 個(gè)周齡冠高性狀的相關(guān)性，并計(jì)算其加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)值（表5）。多重比較分析發(fā)現(xiàn)，A1270769G 位點(diǎn)的不同基因型中，AA 型個(gè)體的4、6、8、10、14、16 周齡冠高顯著低于AG 和GG 型個(gè)體，12周齡冠高的AA 型個(gè)體顯著低于AG 型個(gè)體；從位點(diǎn)對(duì)冠高性狀的作用方式看，該位點(diǎn)主要以加性方式起作用，GG 型更加有利。多重比較分析發(fā)現(xiàn)，G1272611A 位點(diǎn)的不同基因型中，GG 型個(gè)體的5 個(gè)周齡冠高均顯著高于GA 型個(gè)體。

表5 GH 基因 A1270769G、G1272611A 位點(diǎn)與寧都黃雞冠高（mm）性狀的相關(guān)性Table 5 Correlation between A1270769G,G1272611A in GH gene and comb height (mm) of Ningdu yellow chickens

2.4 C1271211T、G1272611A 位點(diǎn)不同基因型與寧都黃雞冠長(zhǎng)性狀的相關(guān)性

分析寧都黃雞公雞GH基因C1271211T、G1272611A 兩個(gè)位點(diǎn)與7 個(gè)周齡冠長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，并計(jì)算其加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)值（表6）。多重比較分析發(fā)現(xiàn)，C1271211T 位點(diǎn)的不同基因型中，CC 型個(gè)體的4、6、8、10、12、16 周齡冠長(zhǎng)均顯著高于CT 和TT 型個(gè)體，14 周齡冠長(zhǎng)的CC 型個(gè)體只顯著高于CT 型個(gè)體；從該位點(diǎn)對(duì)于4、6、8、10、12、14、16 周齡冠長(zhǎng)的作用方式看，該位點(diǎn)加性方式起作用，CC 型更加有利。G1272611A 位點(diǎn)的不同基因型中，GG型個(gè)體的8、10、12、14、16 周齡冠長(zhǎng)顯著高于GA 型個(gè)體。

表6 GH 基因C1271211T、G1272611A 位點(diǎn)與寧都黃雞冠長(zhǎng)（mm）性狀的相關(guān)性Table 6 Correlation between C1271211T and G1272611A in GH gene and comb length (mm) of Ningdu yellow chickens

3 討論

本研究采用前期記錄的寧都黃雞公雞生長(zhǎng)早期（4～16 周齡）的冠高、冠長(zhǎng)、冠厚、肉垂長(zhǎng)、肉垂厚和冠齒數(shù)性狀數(shù)據(jù)，與GH基因5'-側(cè)翼區(qū)域和內(nèi)含子1 區(qū)域的SNP 進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，首先分析了與不同周齡雞冠性狀分別關(guān)聯(lián)的SNP，發(fā)現(xiàn)較少位點(diǎn)與雞冠厚、肉垂長(zhǎng)和肉垂厚存在關(guān)聯(lián)性，而與冠長(zhǎng)和冠高關(guān)聯(lián)位點(diǎn)較多，推測(cè)GH基因主要調(diào)控雞冠的長(zhǎng)度和高度發(fā)育；進(jìn)一步選取與5 個(gè)連續(xù)周齡冠長(zhǎng)或冠高性狀指標(biāo)均關(guān)聯(lián)且與16 周齡顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)進(jìn)行不同基因型多重比較分析，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)基因型分別為A1270769G 位點(diǎn)GG 基因型、C1271211T 位點(diǎn)CC 基因型、G1272611A 位點(diǎn)GG 基因型。經(jīng)過(guò)Bonferroni 法校正后，A1270769G 與4 周齡冠高、G1272611A 與16 周齡冠長(zhǎng)相關(guān)性達(dá)到顯著水平。Hardy-weinberg 檢驗(yàn)結(jié)果表明，A1270769G、C1271211T 均處于平衡狀態(tài)，而G1272611A 未達(dá)到平衡狀態(tài)。綜上，A1270769G 可為雞冠性狀的潛在關(guān)鍵候選分子標(biāo)記。

本課題組前期研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，G1272611A 位點(diǎn)與16 周齡肉雞的睪丸性狀存在顯著關(guān)聯(lián)［3］，表明位點(diǎn)G1272611A 既與雞冠性狀又與睪丸性狀顯著關(guān)聯(lián)，推測(cè)該位點(diǎn)為調(diào)控雞冠性狀和睪丸性狀的功能位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)不同基因型對(duì)應(yīng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GG 基因型對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子主要有p53、myogenin，AA 基因型對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子主要為En-1、C/EBPalpha［21］，雞冠性狀的優(yōu)勢(shì)基因型為GG，推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子p53、myogenin 更有利于雞冠發(fā)育通路的激活，這些位點(diǎn)的調(diào)控功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。綜合分析，G1272611A 可作為地方雞繁殖性狀選育的重要候選標(biāo)記，可進(jìn)一步開(kāi)展大群體驗(yàn)證。本研究還發(fā)現(xiàn)，C1272225T 與12、14、16 周齡的冠高和冠長(zhǎng)均顯著相關(guān)，且該位點(diǎn)與16 周齡冠高的相關(guān)性經(jīng)過(guò)Bonferroni 法校正后達(dá)到顯著水平；C1271211T與6 個(gè)周齡的冠長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)，而這2 個(gè)位點(diǎn)也與16 周齡睪丸性狀顯著關(guān)聯(lián)，說(shuō)明這些位點(diǎn)變異可能影響GH基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控雞冠和睪丸發(fā)育。

在家禽生產(chǎn)中，雞冠性狀是遺傳育種選育中重要的表型性狀，與重要的經(jīng)濟(jì)性狀如開(kāi)產(chǎn)性狀、睪丸重等有密切聯(lián)系［13，20］。雞冠是家禽的第二性征，生長(zhǎng)發(fā)育受遺傳因素、激素及光照環(huán)境等影響。睪酮的分泌影響雞冠和肉垂的發(fā)育［22］，其與雞冠表皮層和真皮層的受體結(jié)合影響雞冠發(fā)育。雞冠的的生長(zhǎng)狀況在一定程度上反映雞的性功能是否優(yōu)良［13，23-24］。韋金兌［25］發(fā)現(xiàn)清遠(yuǎn)麻雞和廣西麻雞各冠型各日齡公雞的冠高、冠長(zhǎng)和肉垂長(zhǎng)之間均呈較高程度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.498～0.763 之間。肖?。?6］對(duì)清遠(yuǎn)麻公雞性早熟進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雞冠和睪丸的生長(zhǎng)發(fā)育有很大的關(guān)聯(lián)性。周敏等［3］、王琨等［9］和姬杰菲等［27］的研究驗(yàn)證了性成熟前雞冠與公雞睪丸性狀、母雞開(kāi)產(chǎn)性狀具有較強(qiáng)的相關(guān)性。通過(guò)這些結(jié)果推測(cè)，以冠高或冠長(zhǎng)為參數(shù)進(jìn)行分子選育時(shí)可達(dá)到改良雞繁殖性能性狀的效果。而本研究發(fā)現(xiàn)的G1272611A 位點(diǎn)與冠高、冠長(zhǎng)性狀、睪丸性狀均顯著關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步體現(xiàn)了雞冠、睪丸性狀的相關(guān)性，可能是因?yàn)殡u冠、睪丸的發(fā)育過(guò)程受到同一基因的調(diào)控。雞冠是一種復(fù)雜性狀，由多基因共同調(diào)控，目前已知雞冠性狀候選基因有AR、BMP2、CHADL、DRD1、EDN1、GARNL1、HSPA5、HSPA8、STK32A、PIK3R1、VIP1、VIP2和WNT9A等［12-17］，GH基因序列變異關(guān)聯(lián)雞冠性狀的挖掘?qū)榻馕鲭u冠性狀的多基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的參考。

4 結(jié)論

GH基因可作為調(diào)控雞冠長(zhǎng)度和高度發(fā)育的重要候選基因，位于該基因5'-側(cè)翼的G1272611A 位點(diǎn)及位于內(nèi)含子1 區(qū)域的C1271211T、A1270769G位點(diǎn)與寧都黃雞冠長(zhǎng)或冠高性狀顯著關(guān)聯(lián)。A1270769G、G1272611A 均 對(duì)8、10、12、14、16周齡冠高性狀指標(biāo)的影響達(dá)到顯著水平（P＜ 0.05），這兩個(gè)位點(diǎn)可作為冠高性狀的分子輔助選育候選分子標(biāo)記；G1272611A、C1271211T 均對(duì)8、10、12、14、16 周齡冠長(zhǎng)性狀的影響達(dá)到顯著水平（P＜ 0.05），這兩個(gè)位點(diǎn)可作為冠長(zhǎng)性狀的分子輔助選育候選分子標(biāo)記。G1272611A 位點(diǎn)與5 個(gè)連續(xù)周齡冠長(zhǎng)或冠高性狀指標(biāo)均關(guān)聯(lián)，可作為調(diào)控雞冠性狀的候選分子標(biāo)記。