江桂通 王臘 田維毅

【摘 要】 目的：探究黃連解毒湯對(duì)膿毒癥大鼠急性心肌損傷的保護(hù)作用與自噬相關(guān)蛋白的關(guān)聯(lián)。方法：將35只SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為Sham組、CLP組、HLJDD組、H+RAP組、H+3MA組共5組（n=7）。連續(xù)給藥7 d，通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥模型。術(shù)后3 d仍存活的大鼠采血行血常規(guī)檢測；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心臟組織的病理變化；蛋白免疫印跡法檢測心臟組織中自噬相關(guān)蛋白（LC3、Beclin-1、P62）的表達(dá)；Q-PCR法檢測大鼠心臟組織中ATG9 m RNA的表達(dá)差異。結(jié)果：與Sham組比較，CLP組小鼠血常規(guī)中感染指標(biāo)（WBC、Gran、Gran%）水平明顯升高（P<0.05），心肌細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤明顯，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、ATG9 m RNA的表達(dá)明顯下調(diào)，P62蛋白累積明顯（P<0.05）；與CLP組比較，HLJDD組膿毒癥大鼠感染指標(biāo)明顯降低（P<0.05），心臟組織損傷明顯減輕，LC3-Ⅱ、Beclin-1、ATG9 m RNA的表達(dá)明顯上調(diào)，P62蛋白明顯下降（P<0.05）；H+RAP組模擬了HLJDD組的趨勢(shì)，然而H+3MA組則出現(xiàn)相反的趨勢(shì)（P<0.05）。結(jié)論：黃連解毒湯對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，可能是通過促進(jìn)自噬實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】 黃連解毒湯；膿毒癥；心肌損傷；自噬

【中圖分類號(hào)】R285.6? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A? ? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）14-0030-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202314008

Abstract：Objective To investigate the association between the protective effect of Huanglian Jiedu decoction Tang on acute myocardial injury and autophagy-related proteins in septic rats. Methods Thirty-five SPF-grade SD male rats were randomly divided into five groups （n=7），including Sham group，CLP group，HLJDD group，H+RAP group and H+3MA group. The sepsis model was established by cecum ligation perforation for 7 d of continuous administration. Blood was collected from rats still alive 3 days after surgery for routine blood tests; hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to observe the pathological changes of heart tissues; protein immunoblotting was used to detect the expression of autophagy-related proteins （LC3，Beclin-1，P62） in heart tissues; Q-PCR was used to detect the difference of ATG9 m RNA expression in rat heart tissues.Results Compared with the Sham group，the levels of infection indexes （WBC，Gran，Gran%） in the blood routine of mice in the CLP group were significantly higher（P<0.05），and the expression of autophagy-related proteins LC3-II，Beclin-1，ATG9 m RNA was significantly down-regulated，and P62 protein accumulated significantly，in the CLP group（P<0.05）; compared with the Compared with the CLP group，the HLJDD group had significantly lower infection indexes in septic rats（P<0.05），significantly reduced heart tissue damage，significantly upregulated expression of LC3-II，Beclin-1，ATG9 m RNA，and significantly decreased P62 protein（P<0.05）; the H+RAP group mimicked the trend of the HLJDD group，however，the H+3MA group showed the opposite trend（P<0.05）. Conclusion The protective effect of Huanglian Jiedu Decoction on myocardial injury in septic rats may be achieved by promoting autophagy.

Keywords：Huanglian Jiedu Decoction; Sepsis; Myocardial Injury; Autophagy

迄今為止，膿毒癥仍是一個(gè)世界公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率及病死率雙高仍困擾著全球的醫(yī)務(wù)工作者［1］。膿毒癥病理過程異常復(fù)雜，目前仍尚未完全闡明，涉及炎癥的失控、機(jī)體免疫系統(tǒng)抑制及凝血功能障礙等多個(gè)方面［2］。膿毒癥誘導(dǎo)宿主多器官功能障礙綜合征與其高死亡率息息相關(guān)，其中心臟功能障礙是關(guān)鍵［3］。膿毒癥誘導(dǎo)的心肌病其特征包括心肌細(xì)胞死亡以及過度炎癥反應(yīng)等。自噬（Autophagy）作為細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制［4］，在應(yīng)激條件下，Beclin-1復(fù)合物與唯一具有跨膜結(jié)構(gòu)的自噬核心調(diào)控蛋白（ATG9）調(diào)控自噬泡的形成與自噬膜延伸的過程［5-6］，將受損的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，底物蛋白P62也隨之降解，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，促使細(xì)胞存活。自噬泡的形成到自噬體與溶酶體相結(jié)合，涉及到LC3-I/LC3-II的比率及P62蛋白的表達(dá)水平，這是評(píng)估自噬活化程度的主要方式［7］。目前公認(rèn)自噬作為細(xì)胞適應(yīng)機(jī)制能減輕細(xì)胞損傷和凋亡，膿毒癥中自噬的維持可能有助于減輕膿毒癥引起的器官損傷［8］。因此，探索自噬現(xiàn)象對(duì)炎癥性疾病的治療具有重大的意義［9］。

膿毒癥在中醫(yī)學(xué)古籍中雖沒有具體的病名記載，但根據(jù)其發(fā)病的主癥，歸納其病因、病機(jī)，可歸屬于“熱毒”“溫毒”一類［10］。熱毒貫穿于膿毒癥發(fā)病之始終為基礎(chǔ)，清熱解毒是膿毒癥治療的核心環(huán)節(jié)，并在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著決定作用［10-12］。黃連解毒湯始載于唐代王燾《外臺(tái)秘要》一書中，由黃連、梔子、黃芩及黃柏組成，具有瀉火解毒之功效，為清熱解毒的代表方之一。課題組前期研究［13］發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯含藥血清能顯著降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥細(xì)胞模型炎癥因子（TNF-α、IL-6）表達(dá)水平，誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達(dá)［14］，為本研究提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 35只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重在150～180 g之間，購買于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號(hào)SYXK（黔）2018-0001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)東垣樓。本實(shí)驗(yàn)由貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作及過程嚴(yán)格執(zhí)行倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。Affinity抗體江蘇常州艾菲爾生物科技（LC3、Beclin-1、P62），兔源，貨號(hào)分別為［AF5402，AF5128，AF5384］。3-18K型低溫離心機(jī)（德國Sigma公司） ；Bio-Rad蛋白凝膠電泳儀、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥材與制備水煎劑 按王燾《外臺(tái)秘要》黃連解毒湯原方比例配伍（黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g），購自北京同仁堂貴陽店。按課題組常規(guī)方法制備水煎劑，加熱濃縮至含生藥濃度為1 g/mL存放4 ℃保存?zhèn)溆茫?5］。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 35只SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分組。①Sham組（n=7）；②CLP組（n=7）；③HLJDD+CLP（HLJDD）組（n=7）；④HLJDD+Rap+CLP（H+RAP）組（n=7）；⑤HLJDD+3-MA+CLP（H+3MA）組（n=7）。在CLP手術(shù)前1周，給予HLJDD：灌胃給藥3.5g·kg-1·d-1藥液灌胃，1 mL/100 g體重，每天1次，持續(xù)7d［15］。Sham組及CLP組給予同等體積的生理鹽水灌胃。雷帕霉素、3-甲基腺苷溶于二甲亞砜，在CLP手術(shù)后1 h內(nèi)腹腔注射。在Sham、CLP和HLJDD組腹腔注射相同體積的生理鹽水。雷帕霉素（RAP，3 mg/kg，MedChemExpress，新澤西，美國）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，30 mg/kg， MedChemExpress，新澤西，美國）、二甲亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich，美國）。

1.4 建立膿毒癥大鼠模型 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)［16］（CLP）建立膿毒癥動(dòng)物模型。大致步驟如下：腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定，腹中線1.5 cm切口暴露盲腸，絲線結(jié)扎于回盲瓣的四分之一處，用20號(hào)針頭進(jìn)行兩次盲腸穿刺擠出糞便后擦拭，將暴露的盲腸放回腹腔，用無菌的6.0手術(shù)縫線將腹壁分層縫合。術(shù)后，用3 mL預(yù)熱的無菌鹽水皮下注射進(jìn)行液體復(fù)蘇，自由飲食、活動(dòng)。對(duì)Sham組大鼠進(jìn)行同樣的操作但盲腸無結(jié)節(jié)及穿孔。

1.5 大鼠模型血常規(guī)檢測 術(shù)后3 d仍存活的大鼠，麻醉后采血經(jīng)獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測，選取指標(biāo)有白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)；中性粒細(xì)胞數(shù)目（Gran）；中性粒細(xì)胞百分比（Gran%）。

1.6 HE染色觀察心臟組織病理變化 將心臟組織用甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm厚片。切片在二甲苯中孵育5 min。然后，將樣品依次在100%，95%，80%，75%乙醇梯度孵育；蒸餾水沖洗2 min，切片用蘇木精染色5 min，再漂洗，在伊紅溶液中孵育2 min。最后，切片脫水，密封，并在顯微鏡下檢查。

1.7 蛋白印跡法檢測心臟組織中自噬蛋白LC3、Beclin-1、P62表達(dá)水平 提取大鼠心臟組織總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。用兔來源的單克隆抗體（LC3 1∶1000、Beclin-1 1∶1 000、P62 1∶1000）在4 ℃孵育過夜。搖床TBST洗膜15 min/次，共3次，然后將PVDF膜與鼠源抗兔二級(jí)單克隆抗體（1∶2000）在37 ℃孵育1h。同樣方法洗滌后，配置ECL顯影液顯影，曝光采集條帶圖象保存，以GAPDH為內(nèi)參，Image Lab軟件分析各目的蛋白條帶的灰度值。

1.8 檢測大鼠心臟組織中ATG9 mRNA的表達(dá)水平 采用Q-PCR法檢測大鼠心臟組織中ATG9 m RNA的表達(dá)差異。稱取各組大鼠心臟組織研磨，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。按照試劑盒說明進(jìn)行操，引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，以GAPDH為內(nèi)參（F5’ACAGCAACAGGGTGGTGGAC3’；R5’TTTGAGGGTGCAGCGAACTT3’）檢測各組大鼠心臟中ATG9 mRNA（F5’TTACTGTGGAGGTCGTCGGTGTGGG3’；R5’ GGATGTGAAAAGGGCATTCTCTGGG3’）。以2-ΔΔCt計(jì)算目的m RNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行行方差分析和相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P<0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察黃連解毒湯對(duì)膿毒癥大鼠心臟病理情況 HE染色結(jié)果顯示： Sham組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，排列整齊，染色均勻。CLP組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂可見炎性細(xì)胞浸潤，染色加深，部分心肌細(xì)胞腫脹明顯并有壞死。HLJDD組與CLP組相比較，心肌肌纖維排列相對(duì)規(guī)則，心肌間間隙變小，炎癥細(xì)胞浸潤減弱。H+RAP組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)邊界較HLJDD組明顯改善，而H+3MA組則心肌細(xì)胞排列紊亂、壞死程度增加。如圖1所示。

2.2 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥大鼠血常規(guī)的影響 與Sham組相比，CLP組大鼠全血中（WBC、Gran#、Gran%）均明顯上調(diào)（P<0.05）。與CLP組相比，HLJDD組大鼠的（WBC、Gran#、Gran%）均明顯下調(diào)，H+RAP組指標(biāo)進(jìn)一步下降，而H+3MA組則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（P<0.05）。見表1。

2.3 黃連解毒湯對(duì)自噬相關(guān)蛋白（LC-3、Beclin-1、P62）的影響 與Sham組比較，CLP組大鼠心臟組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)顯著降低，P62蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。與CLP組比較，HLJDD組大鼠心臟組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，P62蛋白表達(dá)明顯降低，H+RAP組的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)則顯著上調(diào)，P62蛋白表達(dá)顯著降低。而H+3MA組則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)則顯著降低，P62蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。見表2和如圖2所示。

2.4 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥大鼠自噬基因ATG9 m RNA的影響 與Sham組比較，CLP組大鼠心臟組織中自噬基因ATG9 m RNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）。與CLP組比較，HLJDD組大鼠的表達(dá)明顯上調(diào)，H+RAP組的進(jìn)一步上調(diào)。而H+3MA組則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，ATG9 m RNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）。見表3。

3 討論

膿毒癥是一種由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，其中誘發(fā)的心肌病治療耗資頗大且療效欠佳，目前其病死率仍居高不下［17］。臨床研究［18］發(fā)現(xiàn)，罹患膿毒癥患者的死亡超過70%是由器官衰竭引起的，其中超過50%表現(xiàn)出心肌功能障礙。膿毒癥期間不受控制的炎癥因子直接抑制心臟，是誘發(fā)心肌病的主要機(jī)制，伴隨著嚴(yán)重的心臟功能障礙對(duì)患者造成致命打擊［19］。巨噬細(xì)胞作為人體中最主要的免疫細(xì)胞，在膿毒癥期間被過度激活并釋放出大量炎性因子 （IL-1、IL-6、TNF-α）。在團(tuán)隊(duì)前期研究［13］發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯能顯著地提高CLP誘導(dǎo)的膿毒癥動(dòng)物模型生存率、降低炎癥因子（TNF-α、IL-6），表現(xiàn)出明顯的抗炎作用。這些研究結(jié)果與黃鑫等［20］和李翀等［21］的研究結(jié)果相符。白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞是機(jī)體抵御微生物侵襲的第一道防線，是免疫防御以及解決過度炎癥所必需的，可以評(píng)估膿毒癥病程嚴(yán)重狀態(tài)的指標(biāo)［22-23］。此次實(shí)驗(yàn)筆者采用血常規(guī)檢測大鼠全血中感染指標(biāo)，證實(shí)了黃連解毒湯減輕膿毒癥大鼠的感染的顯著作用（表1）。在細(xì)胞和分子水平上，炎癥和細(xì)胞的凋亡被認(rèn)為是膿毒癥心功能障礙的關(guān)鍵病理生理學(xué)現(xiàn)象［24］。筆者在光鏡下觀察膿毒癥大鼠心臟HE病理切片。結(jié)果顯示：黃連解毒湯能減輕膿毒癥大鼠心臟組織局部炎癥，減輕心肌細(xì)胞的損傷情況。細(xì)胞自噬可以降解受損蛋白質(zhì)以維持正常功能的途徑［25］。但在心血管疾病中，特別是膿毒癥誘導(dǎo)的急性心肌損傷中，自噬的作用機(jī)制尚不明確。有研究［26］發(fā)現(xiàn)，小干擾RNA（siRNA）沉默自噬基因ATG5和3-甲基腺嘌呤抑制自噬，增加了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而，糾正自噬受損，改善舒張期充盈增加心臟收縮力，減少心肌細(xì)胞凋亡［27-28］。本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯促進(jìn)了膿毒癥大鼠心臟自噬通量的增加，從血常規(guī)結(jié)果及觀察心臟病理切片，自噬的增加進(jìn)一步減輕了膿毒癥大鼠的心肌損傷程度，而自噬受阻則加重其損傷程度（圖2、表2、表3），這些結(jié)果與WU等［29］的研究相符。

膿毒癥臨床證候復(fù)雜多變，主次真?zhèn)巫兓喽?。治病必求本，辨證必求因?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗分赋觥氨胤渌?，而先其所因”。熱毒貫穿于膿毒癥之始終，并在疾病的發(fā)生發(fā)展起主導(dǎo)作用。清·汪讱庵曰：“毒者，即火邪之盛也。”黃連解毒湯是清熱解毒治法代表方劑之一，方中黃連為君清中焦之火；黃芩為臣輔以清上焦之火；黃柏佐助清下焦；梔子通瀉三焦，引熱下行，從小腸膀胱而出；四藥合力，三焦兼顧。

綜述所述，本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯有減輕膿毒癥大鼠炎癥水平及心臟組織的損傷作用，可能是通過增加自噬的途徑。然而，黃連解毒湯對(duì)于自噬具體的調(diào)控機(jī)制尚且不清楚，有待于后續(xù)的研究。

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（收稿日期：2022-11-01 編輯：陶希睿）