劉小金,劉日群,鄭 琴,楊 明,胡鵬翼,李字棋,肖淑華

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室,南昌 330004

現(xiàn)代社會,繁重的工作和生活壓力致使人們白天犯困、易疲勞的現(xiàn)象越發(fā)嚴重,警覺度和認知功能下降是該癥狀的主要表現(xiàn),短期服用興奮劑類藥物如咖啡因、莫達非尼等可緩解疲勞困倦,提高警覺性[1]。但長期攝入咖啡因會引起抑郁、易怒、心律失常、焦慮、失眠等不良癥狀;此外,咖啡因的利尿作用也可導(dǎo)致運動間脫水,體溫調(diào)節(jié)能力下降[2]、心率加快和心臟負擔[3];而莫達非尼會引起頭痛、惡心和血壓升高等不良反應(yīng),也有潛在的成癮性與依賴性[4]。因此研究開發(fā)效果好、不良反應(yīng)少的提神醒腦產(chǎn)品顯得尤為迫切。

芳香療法作為近年來興起的一種補充替代療法,是一種回歸自然類似于整體治療的方法。芳香療法中所用的芳香物質(zhì)或精油已有研究報道具有提神醒腦效果,如迷迭香精油、蘇合香精油、薄荷精油、石菖蒲精油、冰片和檸檬精油等[5]。本文基于芳香療法理論為指導(dǎo),選擇芳香開竅的薄荷醇、丁香精油、青檸檬精油等植物精油進行組方,經(jīng)鼻吸入研究自制復(fù)方精油對小鼠自主活動及睡眠的影響,評價其提神醒腦的藥效。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)、Western blot技術(shù)檢測興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、多巴胺及其受體研究作用機制,并采用GC-MS分析復(fù)方精油化學(xué)成分,以期分析精油中可能產(chǎn)生興奮作用的成分。另一方面,精油雖然具有較好的療效,但有臨床研究報道精油可能會引起不良反應(yīng)[6],為確保臨床用藥安全,本文還研究自制復(fù)方精油經(jīng)鼻吸入對小鼠進行初步安全性研究,以期為其安全使用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明小鼠(KM,SPF),雄性,體重為20±2 g,購買于江西中醫(yī)藥大學(xué)動物科技中心,動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(贛)2022-0002,本實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準,審批號:JZLLSC20210043。動物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)動物科技中心屏障級實驗室內(nèi),晝夜12 h交替,恒溫(22±2)℃,相對濕度40%～70%,動物統(tǒng)一適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥品及試劑

復(fù)方精油,江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室提供,批號20220322,主要成分為薄荷醇、丁香精油、青檸檬精油等;咖啡因(批號PS11544,北京譜析科技有限公司);酒精消毒劑(南昌利康制藥機械有限公司);PBS緩沖液(Solarbio);多巴胺酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號H170-1-2,Andygene);谷氨酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號H168-1-2,Andygene);多巴胺受體D1R抗體(批號ab279713,Abcam)。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)方精油對小鼠提神醒腦的作用研究

1.3.1.1 實驗動物分組和給藥

40只昆明雄性小鼠,隨機分成5組,每組8只。實驗由對照組、咖啡因組和復(fù)方精油低(2×10-7mL/cm3)、中(5×10-7mL/cm3)、高劑量(8×10-7mL/cm3)組,為增加精油霧化效率,采用蒸餾水對復(fù)方精油進行適當稀釋。對照組每天霧化吸入等量蒸餾水,陽性藥組灌胃咖啡因57 mg/kg,前期預(yù)實驗結(jié)果表明,復(fù)方精油霧化吸嗅給藥15 min后能顯著提高小鼠自主活動能力,本研究選擇復(fù)方精油霧化吸入15 min,實驗時間每日8∶00～16∶00,1次/d。精油給藥劑量=霧化器復(fù)方精油加入體積(mL)/動物香薰室空間體積(cm3)。

1.3.1.2 復(fù)方精油對小鼠自主活動的影響

連續(xù)給藥3 d,每天各給藥組霧化吸入15 min,休息15 min后進行曠場實驗。有研究表明,小鼠灌胃咖啡因后,在30～60 min 能達到最高血藥濃度,小鼠灌胃咖啡因30 min 后活動能力顯著增強[7],選擇咖啡因組灌胃30 min后進行曠場實驗。小鼠適應(yīng)環(huán)境3 min,檢測5 min內(nèi)行為學(xué)參數(shù):運動距離(cm)、平均速度(cm/s)、休息時間占比(%)。

1.3.1.3 戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導(dǎo)實驗

另取30只昆明雄性小鼠,隨機分成5組,每組6只。對照組和復(fù)方精油低、中、高劑量組小鼠均在實驗第一天末次霧化吸入15 min,休息15 min,陽性藥組灌胃咖啡因30 min后,均進行腹腔注射戊巴比妥鈉閾上值55 mg/kg[8]。觀察并記錄各組小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間,注射給藥后,小鼠的翻正反射消失1 min,為入睡指標。從注射藥物到翻正反射消失的時間為睡眠潛伏期,翻正反射消失至恢復(fù)的時間為睡眠持續(xù)時間,記錄睡眠時間的潛伏期和睡眠時間。

1.3.2 復(fù)方精油對小鼠腦和血清GLU、DA含量的影響

吸嗅3 d,曠場實驗結(jié)束后,各組小鼠摘眼球取血,后頸椎脫位處死,取出完整腦組織,PBS緩沖液清洗,濾紙吸干。血液室溫靜置1 h,3 500 r/min離心15 min,取上清液血清、腦組織暫存于-80 ℃。按照ELISA試劑盒說明書步驟操作檢測小鼠腦組織和血清中谷氨酸(glutamic acid,GLU)和多巴胺(dopamine,DA)含量。

1.3.3 復(fù)方精油對小鼠腦內(nèi)DA受體D1R的影響

另取一批昆明小鼠按“1.3.1.2”方法重復(fù)實驗,吸嗅給藥第3 d結(jié)束后,各組小鼠迅速頸椎脫位處死,取出全腦組織,用PBS緩沖液洗去血漬,在冰面上分離前額皮層、海馬、下丘腦和其他腦組織,EP管分裝存于-80 ℃用于Western blot分析。將冷凍組織(20 mg)在20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4、0.9% NaCl、0.5% Nonidet P40、1 mmol/L EDTA、129 mmol/L乙二醇四乙酸(EDTA)、1 mmol/L苯基甲基磺酰氟、1 000 KIU/mL 抑肽酶和10 μg/mL亮肽)中勻漿,并在冰上孵育15 min。在12 000 r/min和4 ℃下離心10 min后,使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑測量上清液的蛋白質(zhì)濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入一抗(D1R 1∶1 000),然后將膜與辣根過氧化物酶綴合的次級抗體(1∶2 000)孵育。轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)底物溶液孵育,并用圖像J程序(Bio-Rad,Richmond,CA,USA)可視化。通過使用Quantity One軟件(BioRad Laboratories)對相對水平進行密度量化,并根據(jù)GAPDH的條參考帶進行計算。

1.3.4 復(fù)方精油GC-MS的化學(xué)成分分析

氣相色譜條件:采用Agilent DB-624(30 m×320 μm×1.8 μm)毛細管柱,載氣為高純度He(99.999%),進樣量l μL,分流比50∶1,流速1 mL/min;程序升溫:初始溫度45 ℃(保持0 min),以3 ℃/min升溫至70 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至90 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至140 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至180 ℃,保持3 min;再以5 ℃/min升溫至180 ℃,保持3 min;再以3 ℃/ min升溫至220 ℃,保持5 min;再以5 ℃/min升溫至280 ℃,保持5 min,進樣口溫度280 ℃,接口溫度為250 ℃。

質(zhì)譜條件:EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,MS四極桿溫度150 ℃;界面溫度250 ℃,溶劑延遲3.0 min,質(zhì)譜掃描模式全掃描,掃描范圍(m/z)30～650。標準譜庫NIST11檢索,采用峰面積歸一化法計算各組分含量的相對百分比。

1.3.5 單次吸嗅復(fù)方精油對昆明小鼠安全性研究

因受試藥物濃度、體積和霧化效率的限制,無法測定受試藥物的半數(shù)致死量,提示其安全性較高,為進一步評價其安全性,進行最大給藥量試驗。預(yù)實驗結(jié)果顯示,當復(fù)方精油濃度達到2.07×10-4mL/cm3時,老鼠毛發(fā)濕潤較嚴重,且該濃度下部分老鼠存在呼吸不適,可能是霧氣濃度過高影響老鼠正常呼吸,即以復(fù)方精油濃度2.07×10-4mL/cm3為最大給藥濃度劑量。

昆明小鼠雌雄各半,根據(jù)體重隨機分成為雄鼠對照組(control of male mice,Con-M)、雌鼠對照組(control of female mice,Con-F)、雄鼠復(fù)方精油劑量1組(compound essential oil dose 1 of male mice,Dose 1-M)、雌鼠復(fù)方精油劑量1組(compound essential oil dose 1 of female mice,Dose 1-F)、雄鼠復(fù)方精油劑量2組(compound essential oil dose 2 of male mice,Dose 2-M)、雌鼠復(fù)方精油劑量2組(compound essential oil dose 2 of female mice,Dose 1-F),每組8只。復(fù)方精油劑量1和劑量2的濃度為1.48×10-4、2.07×10-4mL/cm3,分別為復(fù)方精油有效劑量(5×10-7mL/cm3)的296倍和414倍。對照組吸嗅等量蒸餾水,實驗開始1 d,單次吸嗅15 min(30 cm×30 cm×30 cm箱體),為確保規(guī)定時間內(nèi)精油完全霧化,采用多個霧化器同時霧化。

給藥當天仔細觀察并記錄動物的中毒表現(xiàn),癥狀出現(xiàn)和消失的時間及死亡時間。給藥當日連續(xù)觀察,其后每日1次,連續(xù)觀察14 d。觀察期間記錄小鼠的體重變化、外觀征、行為活動、呼吸,飲食,排泄物等及其他中毒表現(xiàn),若有動物死亡,進行肉眼觀察和尸檢,必要時病理學(xué)檢查。觀察期結(jié)束第14 d,對各組小鼠眼眶取血并進行血常規(guī)分析和谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮含量檢測,取各組小鼠腦、肺、鼻黏膜、肝、腎進行組織病理學(xué)切片分析。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方精油吸嗅對小鼠自主活動能力的影響

如圖1所示,給藥1 d,與對照組比較,陽性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)小鼠的運動總距離均顯著增加(P<0.01,P<0.01),平均速度均顯著提高(P<0.01),休息時間顯著縮短(P<0.01),表明不同劑量復(fù)方精油可以顯著提高昆明小鼠的自主活動能力,具有振奮精神的作用。給藥2 d,實驗結(jié)果與給藥1 d基本一致。給藥3 d,與對照組比較,陽性藥組小鼠的運動總距離、平均速度和休息時間均無顯著性差異(P>0.05),復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)運動距離均顯著增加(P<0.01),平均速度顯著提高(P<0.01),休息時間顯著縮短(P<0.01)。

圖1 復(fù)方精油對昆明小鼠自主活動能力的影響Fig.1 Effect of compound essential oils on autonomic activity of Kunming mice 注:a:對照組,b:陽性藥組,c:復(fù)方精油低劑量組,d:復(fù)方精油中劑量組,e:復(fù)方精油高劑量組。與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:a:Control group,b:Positive drug group,c:Compound essential oil low dose group,d:Compound essential oil medium dose group,e:Compound essential oil high dose group.Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導(dǎo)實驗結(jié)果

如圖2所示,與對照組比較,陽性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)對小鼠的睡眠潛伏期無顯著性差異(P>0.05,P>0.05);陽性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)均能顯著縮短小鼠睡眠時間(P<0.05,P<0.01),說明復(fù)方精油吸嗅具有良好的促醒作用。

圖2 戊巴比妥鈉睡眠誘導(dǎo)實驗結(jié)果Fig.2 Results of sleep induction experiment with pentobarbital

2.3 復(fù)方精油對小鼠腦內(nèi)和血清GLU、DA含量的影響

如圖3所示,與對照組相比,復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)顯著增加腦內(nèi)多巴胺水平(P<0.05),咖啡因?qū)δX內(nèi)多巴胺水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05),陽性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量)均顯著提高腦內(nèi)谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05),復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)顯著增加血清多巴胺水平(P<0.05),咖啡因?qū)ρ宥喟桶匪骄哂猩仙厔?但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),陽性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(中、高劑量)均顯著提高血清谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05)。DA和GLU含量的增加可能是復(fù)方精油吸嗅促進小鼠自主活動能力、提神醒腦的重要作用機制。

圖3 復(fù)方精油對昆明小鼠血、腦組織GLU、DA的影響Fig.3 Effect of compound essential oil on GLU and DA in blood and brain of Kunming

2.4 復(fù)方精油對昆明小鼠不同腦區(qū)多巴胺受體D1R表達的影響

如圖4所示,與對照組比較,復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)顯著提高昆明小鼠不同腦區(qū)(海馬、下丘腦、前額皮層和其他腦組織)的D1R表達(P<0.05),陽性藥組(咖啡因)對海馬、下丘腦組織中的D1R表達無顯著影響,陽性藥組(咖啡因)顯著提高前額皮層和其他腦組織的D1R表達(P<0.05)。

圖4 復(fù)方精油對昆明小鼠不同腦區(qū)多巴胺受體D1R表達的影響Fig.4 Effect of compound essential oil on the expression of dopamine receptor D1R in different brain regions of Kunming

2.5 復(fù)方精油GC-MS成分分析

GC-MS分析的復(fù)方精油主要化學(xué)成分及相對百分比見表1,總離子流圖見圖5。共鑒定并核實31種化學(xué)成分,占揮發(fā)油總成分的84.41%,其中含量最高的為L-薄荷醇(24.54%),其次為丁香酚(16.25%)、L-薄荷酮(7.78%)、冰片(7.30%)、1-石竹烯(5.29%)、1,8-桉葉素(3.40%)等。

圖5 復(fù)方精油總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of compound essential oil

2.6 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠安全性研究

2.6.1 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅小鼠外觀表征

實驗觀察,在高濃度吸嗅過程中,復(fù)方精油劑量1組和復(fù)方精油劑量2組小鼠均存在跳躍行為,吸嗅5 min左右最為明顯。吸嗅15 min后,對照組、復(fù)方精油劑量1組和復(fù)方精油劑量2組小鼠除毛發(fā)較為濕潤外,無其他明顯異常表現(xiàn),呼吸和運動正常。

2.6.2 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠體重的影響

結(jié)果見表2,與對照組比較,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅,觀察期14 d內(nèi),復(fù)方精油不同劑量給藥組小鼠體重無顯著性差異。

表2 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠體重的影響

2.6.3 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠血細胞的影響

結(jié)果見表3,與對照組比較,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅,復(fù)方精油不同劑量給藥組對小鼠血細胞無顯著性差異。

表3 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠血細胞的影響

2.6.4 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠肝腎功能的影響

結(jié)果見表4,與對照組比較,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅,不同給藥小鼠組谷草轉(zhuǎn)氨酶、胱抑素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮無顯著差異(P>0.05)。

表4 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠肝腎功能的影響

2.6.5 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠腦、鼻黏膜、肺、肝、腎的影響

結(jié)果見圖6～10,與對照組正常小鼠比較,復(fù)方精油劑量1和復(fù)方精油劑量2對雄性或雌性小鼠的腦、鼻黏膜、肺、肝、腎等組織無明顯病理性損傷,各組織細胞核明顯,未見炎性浸潤、細胞破裂等細胞組織損傷。

圖6 腦組織HE染色病理切片(×200)Fig.6 HE stained pathological section of brain tissue (×200)注:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,下同。Note:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,the same below.

圖7 鼻黏膜HE染色病理切片(×200)Fig.7 HE staining pathological section of nasal mucosa (×200)

圖8 肺HE染色病理切片(×200)Fig.8 HE staining pathological section of lung (×200)

圖9 肝HE染色病理切片(×200)Fig.9 HE stained pathological section of liver (×200)

圖10 腎HE染色病理切片(×200)Fig.10 HE stained pathological section of kidney (×200)

3 討論與結(jié)論

自主活動是評價動物情緒興奮性的重要方法,自主活動的增加表明興奮性增強[9]。實驗動物自主活動的減少、睡眠時長的增加、睡眠潛伏期的縮短被用于評價藥物的鎮(zhèn)靜安神抗失眠作用,而與該表征相反的結(jié)果則被認為具有提神醒腦、促醒的功效[5]。咖啡因是目前運用最廣且普遍認可的精神興奮劑,具有中樞興奮和提神醒腦的作用,同時咖啡因也是多種提神功能性飲料的主要藥效成分,給藥方式的不同,藥效及起效時間存在差異,相比于吸嗅給藥,口服給藥起效較慢,本文預(yù)實驗結(jié)果表明咖啡因灌胃給藥后30 min較為興奮,自主活動能力顯著增強,戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導(dǎo)實驗也表明給藥30 min后睡眠總時長顯著縮短,因此本文中陽性藥組咖啡因選擇灌胃給藥后30 min進行相關(guān)指標檢測。吸嗅發(fā)揮藥效的速度較快,預(yù)實驗結(jié)果表明復(fù)方精油吸嗅15 min后自主活動能力顯著增強,因此選擇吸嗅15 min后進行相關(guān)指標檢測。有文獻選擇薄荷油吸嗅為陽性對照組,但是因復(fù)方精油中含有薄荷油,因此本文沒有選擇薄荷油作為陽性藥,而選擇公認具有提神醒腦功效的咖啡因作為陽性藥。曠場實驗結(jié)果表明,復(fù)方精油單次或多天給藥均能顯著提高小鼠自主活動能力,具體表現(xiàn)為提高正常小鼠運動距離和平均速度,縮短休息時間,同時,與陽性藥咖啡因比較,復(fù)方精油提高小鼠自主活動能力藥效更顯著、更持久。戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠誘導(dǎo)實驗結(jié)果表明,復(fù)方精油不同劑量組均能夠顯著減少昆明小鼠的睡眠時間,具有促醒的作用。分析以上結(jié)果可知,復(fù)方精油吸嗅能有效促進正常小鼠自主活動、縮短戊巴比妥鈉睡眠誘導(dǎo)時長,發(fā)揮持續(xù)提神醒腦的功效。

DA和GLU是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),多巴胺被認為是一種促進覺醒和興奮的物質(zhì)[10],多巴胺的增加有利于維持清醒和增強興奮性,多巴胺激動劑和多巴胺再攝取抑制劑是治療發(fā)作性睡病的重要藥物類型,DA還參與運動、動機和獎勵機制的調(diào)節(jié)[11]。谷氨酸神經(jīng)元是喚醒和睡眠回路中主要神經(jīng)元的重要組成部分,GLU含量的增加有助于喚醒和興奮,GLU水平的高低在一定程度上反映小鼠的神經(jīng)活動興奮性的強弱[11]。本研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方精油吸嗅能顯著提高小鼠血、腦內(nèi)DA、GLU含量,與相關(guān)報道結(jié)果一致。據(jù)報道,大麻二酚和莫達非尼精神興奮劑可通過增加腦組織DA等神經(jīng)遞質(zhì)水平,促進燈開啟期間誘導(dǎo)大鼠覺醒[12],咖啡因、大麻及它們的組合在治療后增加大腦組織中的GLU水平,GLU水平的增加可能會激活小鼠骨髓細胞核中的組胺神經(jīng)細胞,并增加其活力[13]。因此,DA、GLU含量的增加可能是復(fù)方精油促進小鼠興奮的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)咖啡因?qū)A無顯著影響,咖啡因與復(fù)方精油對GLU和DA的差異可能為機制上的差異。據(jù)報道,咖啡因的興奮作用主要通過腺苷受體拮抗、蘭尼堿受體結(jié)合激活蘭尼堿敏感型鈣通道、抑制γ-氨基丁酸(GABA)與受體結(jié)合和抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的活性等4種途徑實現(xiàn)。D1R是DA的重要受體之一,參與運動、獎賞和學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)[14]。DA對運動神經(jīng)元興奮性的大部分影響歸因于D1R的激活[15],因此復(fù)方精油提高小鼠自主活動可能與上調(diào)D1R蛋白水平有關(guān)。另外,DA在喚醒中起著重要作用,因此復(fù)方精油導(dǎo)致小鼠睡眠時間縮短的原因可能是D1R介導(dǎo)的喚醒機制的激活[16]。

GC-MS成分分析結(jié)果表明,L-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉葉素等成分是復(fù)方精油的主要成分。薄荷醇是薄荷精油的主要有效成分,約占薄荷精油33%～60%,薄荷醇可以有效改善認知和緩解精神疲勞,Zhang等[17]的研究表明,單獨使用薄荷醇不會影響大鼠伏隔核中DA的水平,而尼古丁和薄荷醇聯(lián)合使用與單獨使用尼古丁相比,顯著提高了DA的水平,因此復(fù)方精油中的薄荷醇與精油中的其他成分聯(lián)合應(yīng)用提高小鼠腦內(nèi)DA水平發(fā)揮興奮作用。丁香酚為丁香精油的主要成分,丁香酚具有強抗氧化活性,能有效緩解機體的氧化應(yīng)激損傷,能有效提高機體抗氧化酶活性,丁香酚還具有學(xué)習(xí)記憶功能改善作用。L-薄荷酮在抗抑郁和抗炎方面具有相關(guān)報道[18],冰片作為開竅醒腦的常用藥,具有引藥上行和神經(jīng)保護作用,1-石竹烯具有抗炎和神經(jīng)保護作用,Han等[19]研制的復(fù)方精油具有緩解大鼠中樞疲勞的作用,其中精油中含有33.8%的1,8-桉葉素。因此復(fù)方精油吸嗅提神醒腦改善疲勞可能是多種成分共同作用的結(jié)果。

單次給藥急性毒理學(xué)實驗是考察藥物安全性的重要手段之一[20]。為評價精油吸嗅的安全性,我們在有效劑量的基礎(chǔ)上進一步提高給藥劑量,進行單次吸嗅給藥急性毒理學(xué)實驗。實驗結(jié)果表明,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對小鼠體重、血細胞、谷草轉(zhuǎn)氨酶、胱抑素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮無顯著性影響,同時對小鼠的腦、鼻黏膜、肺、肝和腎等重要組織器官無病理損傷,說明復(fù)方精油吸嗅安全性良好。

綜上所述,復(fù)方精油通過提高小鼠血、腦組織DA、GLU含量,上調(diào)小鼠海馬、下丘腦、前額皮層和其他腦組織D1R的蛋白水平表達,發(fā)揮提高小鼠自主活動能力以及促醒的作用。復(fù)方精油的主要有效成分可能為L-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉葉素。單次給藥急性毒性實驗結(jié)果表明,復(fù)方精油吸入對昆明小鼠體重、血細胞相關(guān)指標、肝腎功能均無顯著性影響,對腦、鼻、肺、肝、腎等組織無病理性損傷,說明復(fù)方精油吸入安全性良好,可以作為提神醒腦的安全性產(chǎn)品使用。