超聲分子探針在腫瘤精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用進(jìn)展

武志慧，曲妮娜，曹小麗

1 濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，山東煙臺264003；2 煙臺毓璜頂醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病。根據(jù)WHO下屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2020年全球新增惡性腫瘤病例約1 930萬例，死亡病例約1 000萬例［1］。手術(shù)、化療和放療是惡性腫瘤傳統(tǒng)的治療手段，盡管這些治療手段不斷進(jìn)步，但其療效并未達(dá)到同等程度的預(yù)期，在臨床上仍存在一系列問題，如手術(shù)治療創(chuàng)傷大，放化療全身毒性作用明顯，并且大多數(shù)化療藥物缺乏靶向性和特異性、易產(chǎn)生獲得性多藥耐藥等。因此，尋找療效高、副作用小且靶向性強(qiáng)的治療方法一直是眾多研究者所關(guān)注的問題。精準(zhǔn)診療集合了現(xiàn)代科技手段與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法，科學(xué)地認(rèn)識人體機(jī)能與疾病本質(zhì)，系統(tǒng)地優(yōu)化人類疾病防治和健康促進(jìn)原理與實(shí)踐，是以高效、安全、經(jīng)濟(jì)為特點(diǎn)的新型健康醫(yī)療服務(wù)范式。精準(zhǔn)醫(yī)療能夠在疾病早期精準(zhǔn)診斷，從而有針對性地選擇相應(yīng)的治療方式或藥物，最終實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療和療效評估［2］。超聲分子探針作為一種兼具超聲成像和治療的新型診療劑，它既可提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確度和靈敏度，又能作為目的基因或藥物載體發(fā)揮超聲靶向遞送作用，在低強(qiáng)度超聲作用下產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，從而介導(dǎo)藥物遞送、基因轉(zhuǎn)染、組織屏障開放、免疫治療等，為精準(zhǔn)治療打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷、靶向治療和療效評價(jià)于一體的“一站式精準(zhǔn)診療”模式。本文結(jié)合文獻(xiàn)就超聲分子探針在腫瘤精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1.聲分子探針發(fā)展歷程及其作用機(jī)制

超聲分子探針是一類能夠顯著增強(qiáng)超聲背向散射強(qiáng)度的化學(xué)試劑，這一技術(shù)將超聲診斷帶入分子影像學(xué)研究領(lǐng)域，在腫瘤精準(zhǔn)診療中扮演重要角色。然而，超聲微泡造影劑作為最初的超聲分子探針，無法透過血管壁有效聚集在腫瘤組織內(nèi)部（“大不過”），存在一定局限性。之后發(fā)展出現(xiàn)的靶向納泡，雖然能夠使大分子顆粒輕易穿透疏松的腫瘤血管到達(dá)腫瘤組織［3］，但因其粒徑小于1 000 nm，相應(yīng)的超聲回波信號也大大降低（“小不強(qiáng)”）。近年來，兼具兩者優(yōu)點(diǎn)的相變型超聲分子探針應(yīng)運(yùn)而生，以液態(tài)氟碳納米顆粒最具代表性。液態(tài)氟碳納米顆粒由脂質(zhì)殼和液核組成，納米粒徑可使分子探針通過“高滲透長滯留”效應(yīng)滲透到靶組織，隨后在一定能量的超聲輻照下，液核汽化形成微泡，實(shí)現(xiàn)“大可過，小可強(qiáng)”，不僅可改善靶組織的成像效果，還可將負(fù)載藥物釋放到靶區(qū)，有效提高局部藥物濃度，從而殺滅腫瘤細(xì)胞［4］。超聲分子探針的載藥方式主要包括三種：①將藥物封裝在探針殼膜內(nèi)部；②藥物通過靜電作用或生物素-親和素連接裝載在殼上［5］；③通過配體-受體相互作用將藥物封裝成納米材料連接到探針外殼。此外，多功能分子探針還可聯(lián)合遞送兩種或多種藥物，從而達(dá)到抗腫瘤藥物聯(lián)合治療的目的。

超聲分子探針除了自身的巨大優(yōu)勢外，與低強(qiáng)度超聲聯(lián)合還能產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)揮超聲靶向遞送作用。空化效應(yīng)是超聲靶向遞送的重要機(jī)制之一。當(dāng)超聲在介質(zhì)中傳播時(shí)，其內(nèi)的微小空化核發(fā)生振蕩、膨脹和塌陷等一系列動力學(xué)過程，由此產(chǎn)生的微射流和剪切力會破壞空化核周圍的血管壁和細(xì)胞膜［6］。超聲分子探針作為人造空化核進(jìn)入機(jī)體后可顯著增強(qiáng)這一效應(yīng)。在適當(dāng)強(qiáng)度超聲作用下，細(xì)胞膜電位發(fā)生變化，增強(qiáng)了自身內(nèi)吞作用，從而促進(jìn)藥物攝取，同時(shí)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞之間的縫隙連接打開，在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)微孔，這一現(xiàn)象被稱為聲孔效應(yīng)。在不損害組織生理屏障和防御機(jī)制的情況下，聲孔效應(yīng)引起的細(xì)胞膜滲透是可逆的，細(xì)胞膜通常在幾秒鐘內(nèi)即可恢復(fù)至其原始構(gòu)象［7］。當(dāng)超聲強(qiáng)度超過空化閾值時(shí)，空化核產(chǎn)生的沖擊波和瞬時(shí)剪切力對細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈沖擊和熱效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變和破壞，形成永久開放小孔。當(dāng)相變型納米顆粒受到超聲刺激時(shí)，液核內(nèi)部壓力降低，可迅速發(fā)生規(guī)律的蒸發(fā)、膨脹，形成比原來液滴大5～6倍的微氣泡，這一過程被稱為聲學(xué)液滴蒸發(fā)［8］。相較于傳統(tǒng)微泡載體，聲學(xué)液滴蒸發(fā)的穿透力和穩(wěn)定性更強(qiáng)，能夠通過腫瘤微環(huán)境的“高滲透長滯留”效應(yīng)將裝載藥物遞送到腫瘤組織，使藥物在靶組織內(nèi)積聚，進(jìn)而提高治療效果。

2.聲分子探針在腫瘤精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用

超聲分子探針具有非侵入性和靶向性優(yōu)點(diǎn)。低強(qiáng)度超聲能夠改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增加其通透性。兩者聯(lián)合能夠介導(dǎo)治療藥物在腫瘤靶區(qū)特異性釋放、血腦屏障開放，還能夠使超聲分子探針作為載體和免疫增強(qiáng)劑攜載目的基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，介導(dǎo)腫瘤基因治療和免疫治療，在腫瘤精準(zhǔn)治療中發(fā)揮重要作用。

2.1.導(dǎo)藥物遞送 在化療中存在腫瘤部位藥物利用率低和毒副作用大等不足。超聲分子探針在低強(qiáng)度超聲輻照下與低劑量藥物聯(lián)合應(yīng)用，能夠使藥物穿過腫瘤組織的血管壁間隙，到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，從而增加藥物的靶向利用率和細(xì)胞毒性，同時(shí)還減少了藥物全身毒副作用并提高對化療的耐受性。ZHANG等［9］通過cRGD肽和cCLT1肽分別靶向選擇整合素和纖維連接蛋白，將其修飾在包封紫杉醇的微泡上形成雙靶向PTX-RCMBs，與低強(qiáng)度超聲聯(lián)合能夠增強(qiáng)腫瘤血管的通透性，顯著增加紫杉醇在腫瘤組織的釋放，從而抑制腫瘤生長。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧會阻礙腫瘤細(xì)胞的藥物攝取并降低化療藥物的細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)性耐藥［10］。YANG等［11］研究表明，負(fù)載混合氣體的脂質(zhì)微泡（O2∶C3F8為5∶1）聯(lián)合低強(qiáng)度超聲可將乳腺腫瘤中的氧分壓提高近6倍，從而顯著改善腫瘤缺氧微環(huán)境，抑制腫瘤生長。因此，低強(qiáng)度超聲聯(lián)合脂質(zhì)微泡不僅能增強(qiáng)抗腫瘤藥物的靶向釋放，還能調(diào)節(jié)腫瘤缺氧微環(huán)境，抵抗腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

2.2.導(dǎo)血腦屏障開放 血腦屏障是大腦中的一種天然屏障，可防止病毒、炎癥因子和免疫細(xì)胞等進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。通常血腦屏障僅允許小于400 Da的營養(yǎng)素和脂溶性分子通過，而大分子和水溶性分子無法通過，這會阻礙藥物進(jìn)入顱內(nèi)，限制頗內(nèi)腫瘤的藥物治療效果。低強(qiáng)度超聲是一種可控的實(shí)現(xiàn)血腦屏障開放的有效方法，在超聲分子探針定位下具有提高顱內(nèi)局部藥物濃度的能力。超聲靶向給藥技術(shù)通過聲孔效應(yīng)擴(kuò)大血腦屏障中內(nèi)皮細(xì)胞之間的縫隙，以促進(jìn)藥物高效靶向運(yùn)輸至顱內(nèi)病灶區(qū)域，實(shí)現(xiàn)局部無損傷、可逆性的血腦屏障開放，而且不會引起嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷［12］。ZHANG等［13］研究表明，與單獨(dú)用藥相比，裝載紫杉醇的微泡經(jīng)過超聲介導(dǎo)，滲透至大腦中的藥物劑量可提高3～5倍。YAN等［14］將姜黃素包封在脂質(zhì)PLGA-NBs核內(nèi)，聯(lián)合低強(qiáng)度超聲可打開血腦屏障，增加姜黃素滲透至病變腦組織，從而顯著提高療效。

2.3.導(dǎo)腫瘤基因治療 基因治療是一種通過改變個(gè)體的基因表達(dá)來治療疾病的方法，可為腫瘤提供全新的治療策略。腫瘤基因治療可將治療性基因轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞，也可使用病毒或非病毒載體傳遞基因選擇性沉默癌基因。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但其安全性是臨床試驗(yàn)的主要障礙。非病毒載體的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不存在免疫原性問題，但其靶向性差和穩(wěn)定性欠佳［15］。超聲分子探針能夠精確且無創(chuàng)地將治療性遺傳物質(zhì)（如寡核苷酸和質(zhì)粒DNA）遞送至靶位點(diǎn)，從而提高轉(zhuǎn)染效率并限制非靶向轉(zhuǎn)染。

2.3.1.因轉(zhuǎn)染 超聲分子探針介導(dǎo)的基因治療具有低免疫原性、非侵襲性、靶器官高度特異性等特點(diǎn)。低強(qiáng)度超聲通過聲孔效應(yīng)使局部毛細(xì)血管和鄰近組織細(xì)胞膜產(chǎn)生一過性小孔，細(xì)胞膜的通透性增加，介導(dǎo)攜帶特定基因的超聲分子探針內(nèi)吞，從而改善基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，提高基因治療的靶向性。因此，超聲分子探針介導(dǎo)的靶向遞送是一種安全高效的新型基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。LIU等［16］研究表明，與單獨(dú)使用專制的納米液滴相比，使用超聲與納米液滴聯(lián)合轉(zhuǎn)染DKK-2基因可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，從而抑制前列腺癌生長。WANG等［17］提出將miR-122封裝到納米顆粒中，經(jīng)超聲輻照組腫瘤組織miR-122表達(dá)比未經(jīng)超聲輻照組高7.9倍，轉(zhuǎn)染效率顯著提高。ZHAO等［18］設(shè)計(jì)了多功能FOXA1卟啉微泡，通過低強(qiáng)度超聲輻照后顯著增加了MCF-7細(xì)胞中siRNA的轉(zhuǎn)染效率和卟啉的攝取率，有效抑制雌激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖。

2.3.2.NA干擾 RNA干擾是通過阻礙特定基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來抑制基因的表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、生存素（Survivin）均與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是RNA干擾的首選靶點(diǎn)。向腫瘤中遞送siRNA能夠靶向抑制mRNA并下調(diào)其蛋白表達(dá)，但裸siRNA的細(xì)胞攝取較差，容易被血清中的核糖核酸酶降解。超聲分子探針包裹裸siRNA聯(lián)合低強(qiáng)度超聲通過空化效應(yīng)能夠顯著提高其轉(zhuǎn)染效率，高效靶向抑制促癌基因的表達(dá)，是一種高效的基因沉默方法。SU等［19］制備了攜載PDLIM5 siRNA的新型陽離子脂質(zhì)納泡，與低強(qiáng)度超聲聯(lián)合轉(zhuǎn)染PDLIM5 siRNA，可顯著增加腫瘤組織siRNA攝取，達(dá)到更佳的基因沉默效果，從而顯著抑制腫瘤生長。ZHANG等［20］構(gòu)建LHRHa靶向微泡和Survivin基因的shRNA重組質(zhì)粒，聯(lián)合低強(qiáng)度超聲介導(dǎo)shRNA轉(zhuǎn)染以抑制Survivin基因表達(dá)，可有效提高細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞增殖抑制率。

2.4.導(dǎo)腫瘤免疫治療 在腫瘤微環(huán)境中，細(xì)胞通過不同方式逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視并抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。腫瘤免疫治療是通過腫瘤疫苗、單克隆抗體、細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞等主動或被動方法，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)選擇性地攻擊和對抗腫瘤細(xì)胞，從而抑制或消除腫瘤細(xì)胞。免疫療法包括主動免疫療法和被動免疫療法。主動免疫療法主要刺激自身免疫系統(tǒng)消除腫瘤細(xì)胞，而被動免疫療法則是向機(jī)體輸注外源性免疫效應(yīng)物質(zhì)，由這些外源性免疫效應(yīng)物質(zhì)發(fā)揮抗腫瘤作用。傳統(tǒng)免疫治療通常采取靜脈注射，存在靶向性差且治療有效率低等問題，而超聲與分子探針聯(lián)合應(yīng)用可顯著提升免疫治療效果。

2.4.1.瘤疫苗免疫治療 腫瘤疫苗免疫治療是向機(jī)體輸入抗原性腫瘤疫苗，通過觸發(fā)機(jī)體自身免疫系統(tǒng)，刺激產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫，從而達(dá)到控制和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗和DNA疫苗是最常見的腫瘤疫苗。DC能夠高效地?cái)z取、加工和呈遞抗原，促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。DEWITTE等［21］設(shè)計(jì)了一種載有腫瘤抗原和免疫抑制劑TriMix mRNA的微泡，并與低強(qiáng)度超聲聯(lián)合觸發(fā)DC轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生，能夠引起抗原表達(dá)細(xì)胞死亡。DNA疫苗利用外源性腫瘤相關(guān)基因編碼腫瘤抗原，從而激活免疫反應(yīng)，具有良好的穩(wěn)定性和安全性。YOSHIDA等［22］使用甘露糖修飾基因載體和載阿霉素的聚乙二醇修飾脂質(zhì)體微泡聯(lián)合低強(qiáng)度超聲觀察DNA疫苗的抗腫瘤效果，發(fā)現(xiàn)該方法能夠顯著提高抗原提呈細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，特異性激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，從而提高治療效果。

2.4.2.克隆抗體免疫治療 單克隆抗體是僅針對某一特定抗原表位的抗體，通過阻斷特定分子靶點(diǎn)治療腫瘤。例如，曲妥珠單抗是一種重組人源化單克隆抗體，能夠降低HER2陽性乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，顯著延長患者生存時(shí)間，但其全身毒副作用明顯。KOBUS等［23］將來自乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的HER2陽性細(xì)胞接種至裸鼠腦內(nèi)，應(yīng)用超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)血腦屏障開放，可增加曲妥珠單抗和培妥單抗在腦腫瘤中的積累，顯著抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤生長。

2.4.3.繼免疫治療 過繼免疫治療是取自體淋巴細(xì)胞經(jīng)體外激活、增殖后再輸回體內(nèi)，以殺傷或清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞是目前常用的過繼細(xì)胞之一，可對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)，但傳統(tǒng)方法將大量過繼細(xì)胞回輸時(shí)會引起發(fā)熱、過敏反應(yīng)等副作用。ALKINS等［24］研究表明，超聲微泡介導(dǎo)的NK細(xì)胞能夠靶向至腫瘤部位，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，從而延緩腫瘤生長，提高荷瘤大鼠生存期。

2.4.4.胞因子免疫治療 細(xì)胞因子免疫治療是將細(xì)胞因子高濃度輸送至目標(biāo)靶區(qū)，以誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子主要調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。IL-12在觸發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)和建立抗宿主腫瘤復(fù)發(fā)的長期免疫記憶方面效果顯著，但其劑量受全身免疫毒性的限制。CHEN等［25］研究報(bào)道，超聲靶向微泡可誘導(dǎo)血腦屏障開放，促使IL-12向大腦遞送，激活局部免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)其抗腫瘤作用。

綜上所述，超聲分子探針能夠向腫瘤細(xì)胞高效靶向遞送治療性物質(zhì)，通過低強(qiáng)度超聲的空化效應(yīng)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的通透性，提高抗腫瘤物質(zhì)的轉(zhuǎn)染效率，介導(dǎo)腫瘤靶向治療和免疫治療，促進(jìn)腫瘤精準(zhǔn)診療水平飛速提升。但在臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如可控性、可重復(fù)性，并且靶向性和穩(wěn)定性也有待于進(jìn)一步提高。相信隨著分子影像學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展和超聲分子探針性能的不斷改善，超聲分子探針在腫瘤精準(zhǔn)治療中將發(fā)揮更大作用，有望成為新型的臨床治療手段。