Elafibranor對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡行為的影響及機(jī)制研究

艾俊杰,王子健,倪 維,林曉娟

(1.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢 430061;2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科,湖北武漢 430071)

前列腺癌是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其死亡率占全部惡性腫瘤的第5位[1]。前列腺癌易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,并導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼反應(yīng)(如骨痛、骨折、神經(jīng)壓迫等),損害患者的生活質(zhì)量。值得注意的是,原位前列腺癌患者的5年生存率高達(dá)100%,而轉(zhuǎn)移性前列腺癌的5年生存率僅有29.8%[2]。現(xiàn)有的化療藥物,如卡唑和醋酸阿比特龍,只能將患者的生存期延長(zhǎng)2.4～4.8個(gè)月[3]。因此,有必要開(kāi)發(fā)新型的抗腫瘤藥物。近年來(lái),腫瘤饑餓療法作為一種新穎的干預(yù)策略得到了廣泛的關(guān)注[4-5]。Elafibranor (ELA)是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-a/δ)的雙重抑制劑,由HANF等[6]于2010年首次報(bào)道。ELA已被廣泛用于治療肥胖相關(guān)性疾病,如非酒精性脂肪性肝炎、血脂異常和2型糖尿病。CARIOU等[7]報(bào)道ELA在抑制脂肪酸氧化供能方面具有顯著的作用。不難推測(cè),ELA有望阻斷前列腺癌脂代謝通路取得良好的抗腫瘤效果。目前,ELA對(duì)人前列腺癌的治療效果及機(jī)制仍有待于實(shí)驗(yàn)研究。本課題采用不同劑量的ELA處理前列腺癌DU145細(xì)胞,初步探討了ELA對(duì)DU145細(xì)胞增殖、遷移和凋亡行為的影響及機(jī)制,將為臨床轉(zhuǎn)化研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料前列腺癌DU145細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。ELA購(gòu)于上海陶術(shù)生物有限公司。細(xì)胞凋亡染色試劑盒購(gòu)于天津三箭生物技術(shù)有限公司。組織細(xì)胞RNA小提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、MTT試劑購(gòu)于美國(guó)Gibco生物有限公司。PCR引物由武漢擎科生物有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將DU145細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,并置于37 ℃,含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置過(guò)夜,使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后,采用0.25%胰酶溶液消化細(xì)胞,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)配制不同濃度ELA藥液,用于重懸DU145細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔組織培養(yǎng)板中,每孔添加量為200 μL。培養(yǎng)48 h后,向每孔中加入20 μL MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用二甲基亞砜溶解培養(yǎng)板底部的結(jié)晶?；旌先芤旱奈舛戎挡捎枚喙δ苊笜?biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

1.4.1劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔組織培養(yǎng)板中,培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度超過(guò)80%后采用200 μL槍頭在培養(yǎng)板底部畫(huà)一條寬度均勻的劃痕。采用磷酸鹽緩沖液清洗培養(yǎng)板3次,然后加入含有ELA的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用倒置熒光顯微鏡(Leica,German)拍攝劃痕的照片,劃痕的寬度采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.4.2Transwell實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞沉淀,采用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL。取200 μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室上層,取700 μL含有ELA的完全培養(yǎng)基加入到Transwell小室下層。常規(guī)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞由上層遷移至下層。采用4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液固定細(xì)胞,用棉簽拭去上室未遷移的細(xì)胞,下室細(xì)胞采用0.1%(體積分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫溶液染色。采用倒置熒光顯微鏡(Leica,German)拍攝細(xì)胞的照片,統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)采用含有ELA的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞接種于6孔組織培養(yǎng)板內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)48 h。消化細(xì)胞,將細(xì)胞收集于1.5 mL 離心管內(nèi)。采用細(xì)胞凋亡染色試劑盒處理細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞儀(Beckman,USA)進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的占比。

1.6 基因表達(dá)檢測(cè)將細(xì)胞與ELA共培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,采用組織細(xì)胞總RNA小提取試劑盒分離細(xì)胞的RNA,然后采用微量分光光度計(jì)(Nanodrop,USA)檢測(cè)RNA的濃度和純度。采用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA,然后采用熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。本研究采用的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

2 結(jié) 果

2.1 ELA抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖將DU145細(xì)胞與ELA共培養(yǎng)48 h,然后采用 MTT 法檢測(cè)受試細(xì)胞的增殖活性。如圖1所示,隨著ELA給藥濃度由0 μmol/L增加至30 μmol/L,受試細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢(shì)。將0 μmol/L組的相對(duì)細(xì)胞增殖率設(shè)定為100%,則5、10、15、20、25、30 μmol/L組的相對(duì)細(xì)胞增殖率分別為(86.9±7.8)%、(75.9±10.1)%、(58.5±9.4)%、(48.7±6.9)%、(37.6±4.9)%、(26.1±2.8)%。綜上所述,ELA的作用效果具有明顯的劑量依賴性。為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)分組,我們擬選取ELA的濃度為0 μmol/L作為空白組、5 μmol/L作為低劑量組、15 μmol/L作為高劑量組開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ELA抑制前列腺癌DU145細(xì)胞遷移本研究采用兩種實(shí)驗(yàn)方法評(píng)估ELA對(duì)DU145細(xì)胞遷移能力的影響。圖2A、B是劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果:空白組(0 μmol/L)、低劑量組(5 μmol/L)和高劑量組(15 μmol/L)的劃痕愈合率分別為(74.7±3.2)%,(61.8±2.9)%,(53.2±3.3)%,三組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。圖2C、D是Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果:將空白組(0 μmol/L)的相對(duì)遷移細(xì)胞數(shù)設(shè)置為100%,低劑量組(5 μmol/L)和高劑量組(15 μmol/L)的相對(duì)遷移細(xì)胞數(shù)分別為(32.4±11.2)%,(15.4±3.2)%,三組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。綜上所述,ELA可以顯著抑制前列腺癌DU145細(xì)胞遷移。

A、B:不同劑量(0、5、15 μmol/L)的ELA對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞劃痕遷移能力的抑制效果;C、D:不同劑量(0、5、15 μmol/L)的ELA對(duì)DU145細(xì)胞Transwell遷移能力的抑制效果。與空白組(0 μmol/L)相比,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 ELA促進(jìn)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡不足是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常組織細(xì)胞的重要特征。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物的經(jīng)典作用途徑之一。本研究評(píng)估了ELA對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡行為的影響。如圖3A、B所示,空白組(0 μmol/L)、低劑量組(5 μmol/L)和高劑量組(15 μmol/L)的細(xì)胞凋亡率分別為(9.3±1.4)%、(11.3±0.3)%和(15.2±4.5)%。高劑量組(15 μmol/L)與空白組(0 μmol/L)的細(xì)胞凋亡率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此,ELA可以顯著促進(jìn)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步證實(shí)了其作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用潛力。

A、B:不同劑量(0、5、15 μmol/L)的ELA對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡率的影響。與空白組(0 μmol/L)相比,*P<0.05。

2.4 ELA干擾前列腺癌DU145細(xì)胞的能量代謝ELA是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-a/δ)的雙重抑制劑。PPAR-a/δ的主要功能是參與細(xì)胞糖代謝和脂代謝調(diào)節(jié)過(guò)程,為細(xì)胞生物學(xué)行為提供能量[8]。為探究ELA的作用機(jī)制,本研究還檢測(cè)了PPAR-a/δ通路中一系列關(guān)鍵基因的表達(dá)變化。如圖4A～F所示,經(jīng)ELA處理48 h后,高濃度組中固醇載體蛋白X(sterol carrier protein X,SCPX)、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(phospholipid transfer protein,PLTP)、丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase-1,PDK1)、整合素連接激酶(intergin linked kinase,ILK)、脂酰輔酶A氧化酶2(acyl-CoA oxidase 2,ACOX2)基因的表達(dá)量較空白組顯著降低,脂肪分化相關(guān)蛋白(perilipin-2,PLIN2)基因的表達(dá)量較空白組顯著提高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ELA可以有效地抑制脂肪酸的攝取(SCPX、PLTP),啟動(dòng)脂肪酸儲(chǔ)存(PLIN2)、抑制脂肪酸氧化分解(PDK1、ACOX2),通過(guò)多種途徑減少脂肪酸氧化供能,并對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也有一定的調(diào)控作用(ILK)。

A:SCPX;B:PLTP;C:PLIN2;D:PDK1;E:ILK;F:ACOX2。與空白組(0 μmol/L)相比,**P<0.01,***P<0.001。

3 討 論

前列腺癌是一種好發(fā)于中老年男性的惡性腫瘤,其中約54%的患者在初診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。前列腺癌的首選治療方式為去勢(shì)治療,可以迅速降低體內(nèi)雄激素含量,延緩腫瘤臨床和影像進(jìn)展[10]。藥物化療,如多西他賽、阿比特龍、阿帕魯胺、恩雜魯胺等作為重要的輔助治療方式之一,得到了歐洲泌尿外科學(xué)會(huì)(European Association of Urology,EAU)臨床指南的強(qiáng)烈推薦[11]。近年來(lái),轉(zhuǎn)移性前列腺癌的耐藥性呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì),給臨床治療帶來(lái)了一定的挑戰(zhàn)。而研發(fā)新型化療藥物是克服腫瘤耐藥性的有效途徑之一。

前列腺癌的能量供應(yīng)一部分來(lái)源于有氧糖酵解,而另一部分來(lái)源于脂肪酸氧化[12]。相比于正常細(xì)胞,前列腺癌細(xì)胞需攝取更多的脂肪酸用于維持細(xì)胞代謝活性。MATT等[13]敲除了前列腺癌細(xì)胞內(nèi)CD36基因以抑制脂肪酸攝取,發(fā)現(xiàn)對(duì)前列腺癌有良好的治療效果。VERMA等[14]發(fā)現(xiàn)抑制前列腺癌細(xì)胞攝取脂肪酸可以引發(fā)細(xì)胞能量代謝重編程,提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的藥物敏感性。近年來(lái),脂代謝途徑已證實(shí)是前列腺癌潛在的治療靶點(diǎn)之一,極具發(fā)展前景。

本研究?jī)?yōu)選Elafibranor(ELA)作為一種新型的化療藥物,系統(tǒng)性評(píng)估了ELA對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制。與空白組(0 μmol/L)相比,高劑量組(15 μmol/L)中細(xì)胞增殖和遷移能力被顯著地抑制,細(xì)胞凋亡率得到顯著的增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELA是PPAR-a/δ的雙重抑制劑。為此,我們檢測(cè)了PPAR-a/δ通路中一系列下游基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:ELA可以有效地抑制脂肪酸的攝取(SCPX、PLTP),啟動(dòng)脂肪酸儲(chǔ)存(PLIN2),并抑制脂肪酸氧化分解(PDK1、ACOX2)。ELA從多方面干預(yù)脂代謝途徑,抗腫瘤機(jī)制較為清晰。

綜上所述,ELA具有相對(duì)良好的體外抗腫瘤活性,且作用機(jī)制較為清晰。不足的是,ELA的臨床有效性和生物安全性有待于進(jìn)一步研究。目前,ELA已被美國(guó)食品藥品監(jiān)管局批準(zhǔn)作為孤兒藥用于治療原發(fā)性膽汁性膽管炎。不難預(yù)測(cè),ELA也將在前列腺癌化療領(lǐng)域取得重要的臨床轉(zhuǎn)化成果。