楊澤秀，陳英轉(zhuǎn)，吳文碟，鐘云芳，陳耀麗，3

1.海南珠峰園林科技有限公司，海南 ?？?570220；

2.熱帶特色林木遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南大學(xué)林學(xué)院，海南 ?？?570228；

3.福建江南春城市建設(shè)集團(tuán)有限公司，福建 漳州 363005

蘭科是高級進(jìn)化類群，是集藥用、觀賞和科研作用于一體的植物[1]，同時(shí)也是十分典型和極具代表性的菌根植物，其菌根的共生真菌是公認(rèn)人工栽培、引種馴化、資源再生和保護(hù)的重要決定性因子[2]。蘭花的菌根是蘭科植物根系與真菌形成的菌根共生體，菌根的營養(yǎng)來源對宿主植物的生活和營養(yǎng)造成一定的影響[3]。因此，蘭花內(nèi)生真菌和組培苗共生的研究對蘭科的保育、移栽煉苗管理及藥用藥理開發(fā)具有重要的意義。

血葉蘭（Ludisia discolor）是蘭科血葉蘭屬的多年生草本植物，植株的根莖匍匐生長，莖節(jié)形態(tài)較為明顯，像蠶一樣趴在堅(jiān)硬的石頭上，故也被稱為“石上藕”。血葉蘭干燥的植株有安神健脾、治療食欲不振等效果。除藥用外，還可食用，有益氣健身等作用[4-5]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，菌根真菌在帶葉兜蘭、鐵皮石斛和霍山石斛等蘭科植物的研究中均有相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步解釋了蘭科植物和菌根真菌之間關(guān)系的重要意義[6-7]。目前，因棲息地和生境的破壞，野生血葉蘭資源正在面臨威脅，有些地區(qū)甚至面臨枯竭，對野生血葉蘭資源保存的研究刻不容緩。組織培養(yǎng)、菌根技術(shù)及建立菌苗共生體系是實(shí)現(xiàn)血葉蘭資源保存的良好途徑。血葉蘭近年的研究主要集中在營養(yǎng)價(jià)值、開花物候、內(nèi)生真菌分離與鑒定和組織培養(yǎng)[8-11]，而對血葉蘭與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)的研究少見報(bào)道。因此，該研究在無菌血葉蘭組培苗上，將經(jīng)過分離純化的菌株接種于血葉蘭組培苗中，培養(yǎng)3～4 個(gè)月，定時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)組培苗的生長指標(biāo)，并與對照組進(jìn)行比較，篩選菌苗共生的有效培養(yǎng)基，以期建立血葉蘭菌苗共生體系，為血葉蘭保育、菌根技術(shù)的研究提供一定的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇大小和長勢一致的無根無菌血葉蘭組培苗和經(jīng)分離純化的內(nèi)生真菌菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌在PDA 培養(yǎng)基中純培養(yǎng)，內(nèi)生真菌和組培苗共生則在改良的DE 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 內(nèi)生真菌與血葉蘭組培苗的初步篩選

長勢一致的無菌苗，洗凈苗根部并接種于DE 培養(yǎng)基中，每處理4 株無菌苗，經(jīng)過1 周培養(yǎng)觀察，選擇無污染的組培苗和直徑為0.5cm×0.5cm 的供試真菌菌塊，兩者同時(shí)接種進(jìn)行菌苗共生，以不接內(nèi)生真菌的處理作為對照組，每處理重復(fù)10 次。實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)心觀察，1 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，去除導(dǎo)致苗畸形的內(nèi)生真菌，保留有益的菌株用于菌苗共生的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.4 內(nèi)生真菌與血葉蘭組培苗共生的篩選

將1.3 保留完好的菌株活化備用，選擇長勢一致的血葉蘭無菌苗，清除根部殘留培養(yǎng)基后置于精度為千分之一的電子天平上稱重，將處理過無菌苗有序接種于經(jīng)過改良的DE 培養(yǎng)基上，每瓶接種4 株血葉蘭組培苗。

選取內(nèi)生真菌接種于4 株組培苗的中間部位，每個(gè)處理重復(fù)10 次，以無菌PDA 塊作為對照組。培養(yǎng)3 個(gè)月后記錄各處理的無菌苗生長發(fā)育的效果，實(shí)驗(yàn)期間去掉致死或發(fā)生畸形的菌株。再培養(yǎng)1 個(gè)月后進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄，每個(gè)處理以隨機(jī)選擇10 袋組培苗作為一組，測定血葉蘭的生根數(shù)量、根系長度、植株高度等植物生長發(fā)育指標(biāo)，測定不同內(nèi)生真菌實(shí)驗(yàn)組和對照組的生長發(fā)育指標(biāo)可作為判斷內(nèi)生真菌對血葉蘭組培苗效果的重要理論支撐。

1.5 煉苗培養(yǎng)基篩選

挑選經(jīng)過菌苗共生，長勢一致的健壯組培苗進(jìn)行煉苗實(shí)驗(yàn)，溫室瓶內(nèi)組培苗置放約2d 后擰松瓶蓋再放2d，為更好適應(yīng)外部環(huán)境，再將瓶蓋完全打開2d。經(jīng)過消毒的無菌鑷子小心取出血葉蘭無菌苗，洗凈組培苗再用濃度為50%的多菌靈溶液浸泡10min后微晾干種植在已配好的基質(zhì)中?；|(zhì)搭配的比例如表2，設(shè)置4 種不同基質(zhì)處理，種植前攪拌均勻，并用水拌透，每個(gè)處理3 盤，每盤40 株。經(jīng)過1 個(gè)月的移栽煉苗后，詳細(xì)記錄血葉蘭組培苗的存活率以及生長指標(biāo)的狀態(tài)。

1.6 培養(yǎng)條件

恒溫25℃條件下培養(yǎng)，光照時(shí)間為12h（黑暗時(shí)間為12h），光照強(qiáng)度控制在1800lx～2300lx 之間。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用Excel 2010 和SPSS 26.0 數(shù)據(jù)分析軟件對該實(shí)驗(yàn)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總以及差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌對血葉蘭無菌苗生長指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)在野生血葉蘭植株中篩選出的66 株內(nèi)生真菌中，發(fā)現(xiàn)大部分的內(nèi)生真菌能夠?qū)е卵~蘭組培苗死亡或致病，與血葉蘭不能共生培養(yǎng)（圖1）。對剩余的6 株菌株進(jìn)一步篩選，培養(yǎng)3 個(gè)月后發(fā)現(xiàn)6株菌株在與血葉蘭組培苗共生培養(yǎng)中對組培苗的生長發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。共生培養(yǎng)G6 號菌株1 個(gè)月后，其內(nèi)生真菌的菌絲在培養(yǎng)基上匍匐生長，基本無菌絲的纏繞（圖2），結(jié)果如表1。在組培苗鮮重方面，血葉蘭與G9（55.01%）和Y6 菌株（55.13%）共生培養(yǎng)的鮮重增長率與對照組（48.24%）相比有顯著差異，即（P＜0.05），血葉蘭在G6 號菌株中共生培養(yǎng)和血葉蘭在對照組中培養(yǎng)的鮮重增長率無顯著差異；在血葉蘭與G11 號、Y20 號2 個(gè)菌株共生培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)其鮮重增長率均顯著低于實(shí)驗(yàn)對照組。在血葉蘭株高的測量中發(fā)現(xiàn)，血葉蘭經(jīng)過與G6、G9 和G11 菌株進(jìn)行共生培養(yǎng)的株高顯著高于實(shí)驗(yàn)對照組；血葉蘭與G11 菌株共生培養(yǎng)的莖粗（3.59cm）顯著低于對照組（4.62cm），血葉蘭與其余的內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)的莖粗測量結(jié)果均與實(shí)驗(yàn)對照組無顯著的差異。在血葉蘭根數(shù)方面，血葉蘭與G6 菌株共生培養(yǎng)促使血葉蘭生根效果較為明顯，其生根數(shù)（4.40 條）與實(shí)驗(yàn)對照組（2.20 條）的效果最為突出，血葉蘭與Y21 號菌株共生培養(yǎng)的生根數(shù)低于對照組。在血葉蘭根長方面，血葉蘭與G11 （3.94cm） 和Y21 號菌株（3.39cm） 共生培養(yǎng)的根長均顯著高于對照組（2.84cm）。通過血葉蘭組培苗生長發(fā)育指標(biāo)的考量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過G9 號內(nèi)生真菌處理的血葉蘭組培苗的生長發(fā)育效果優(yōu)于其他處理組；其中G6 號內(nèi)生真菌屬于鏈格孢屬，G9、Y21 內(nèi)生真菌屬于炭疽病屬，G11、Y20 內(nèi)生真菌屬于輪層炭菌屬，Y6 號內(nèi)生真菌屬于木霉屬，說明同屬不同種類的內(nèi)生真菌對血葉蘭組培苗的生長發(fā)育效果也有所差異。

表1 血葉蘭組培苗生長發(fā)育指標(biāo)測定Tab.1 Determination of Growth and Development Index of Tissue Culture Seedlings of Ludisia discolor

圖1 A：共生致死的組培苗，B:正常共生的組培苗Fig.1 A：Ludisia discolor Seedlings by Lethal Symbiotic Culture，B：Normal Symbiotic Tissue Culture Seedlings

圖2 血葉蘭組培苗生長指標(biāo)的測定Fig.2 Determination of Growth Index of Tissue Culture Seedling of Ludisia discolor

2.2 基質(zhì)類型對菌苗共生種植煉苗的影響

植物組織培養(yǎng)煉苗移栽成功的關(guān)鍵在于成活率的占比。該實(shí)驗(yàn)將血葉蘭移栽種植在4 種不同基質(zhì)中一個(gè)半月后，發(fā)現(xiàn)血葉蘭組培苗移栽種植在不同基質(zhì)類型中的成活率均在85%之上（見表2）。其中純水苔為基質(zhì)的組培苗成活率為100%，血葉蘭無菌苗根系較為粗壯，植株長勢良好（圖3）；血葉蘭在松樹皮+泥炭土基質(zhì)（95.5%）中種植，苗生長整齊，生長發(fā)育良好。綜上，血葉蘭以水苔作為種植基質(zhì)的移栽效果最好。

表2 不同基質(zhì)對血葉蘭煉苗成活率的影響Tab.2 Effects of Different Substrates on the Survival Rate of Ludisia discolor Seedling

圖3 血葉蘭的煉苗移栽（以水苔基質(zhì)為例）Fig.3 Transplantation of Ludisia discolor Seedlings (Sphagnum Substrate as an Example)

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

該研究從野生的血葉蘭實(shí)生苗中分離獲得66種內(nèi)生真菌，有60 株內(nèi)生真菌與植物存在著極為不利的關(guān)系，有6 株的內(nèi)生真菌均對血葉蘭存在有利的關(guān)系，對苗具有促進(jìn)效果。有益菌株分別為G6（鏈格孢屬）、G9 和Y21（炭疽病屬）、G11 和Y20（輪層炭菌屬）、Y6（木霉屬）等6 個(gè)菌株。血葉蘭與G9 號內(nèi)生真菌進(jìn)行共生培養(yǎng)時(shí)，其鮮重顯著增加（55.01%）；經(jīng)過G6 和G9 菌株共生培養(yǎng)的血葉蘭無菌苗的株高、莖粗和生根數(shù)等生長發(fā)育指標(biāo)均有顯著促進(jìn)效果；經(jīng)過G11 號菌株共生培養(yǎng)的血葉蘭無菌苗的根長有促進(jìn)效果。綜上所述，血葉蘭與G9 號內(nèi)生真菌進(jìn)行共生培養(yǎng)的生長發(fā)育指標(biāo)最好。血葉蘭以純水苔作為種植基質(zhì)為宜，成活率達(dá)100%，植株茁壯成長。

3.2 討論

3.2.1 不同栽植基質(zhì)對內(nèi)生真菌與血葉蘭組培苗共生培養(yǎng)的影響

血葉蘭無菌苗移栽的成活與否跟種植的基質(zhì)緊密相關(guān)。植物需要在組培室內(nèi)異養(yǎng)條件或者半自養(yǎng)條件轉(zhuǎn)化為全自養(yǎng)條件，其濕度、光照強(qiáng)度和溫度對組培苗的成活起關(guān)鍵作用，基質(zhì)類型也不例外[12]。血葉蘭在基質(zhì)為V火山石:V泥炭土=3:1 中的成活率高達(dá)91.7%，在V泥炭土:V松樹皮:V珍珠巖=3:1:1 的種植基質(zhì)中，血葉蘭組培苗的成活率達(dá)87.0%[13-14]。該實(shí)驗(yàn)將水苔作為血葉蘭移栽煉苗的種植基質(zhì)，經(jīng)過有益菌株共生培養(yǎng)的血葉蘭的成活率高達(dá)100%，幾乎全部成活，植株健壯且生長發(fā)育狀態(tài)良好。原因可能是煉苗基地有遮陰網(wǎng)，空氣流暢，再加上水苔自身的保濕效果，使血葉蘭茁壯成長。該實(shí)驗(yàn)以保水保肥能力強(qiáng)的純水苔作為種植基質(zhì)，植株成活率高，這一研究結(jié)果與蘭科植物中的鐵皮石斛和潑墨石斛的移栽煉苗研究結(jié)果基本一致[15-16]。因此，血葉蘭的后期煉苗，采用水苔作為基質(zhì)為宜。

3.2.2 血葉蘭共生真菌的篩選

內(nèi)生真菌資源在蘭科植物中具有多樣性，植物中分離出來的菌株也有異同。不同的內(nèi)生真菌在植物生長的各階段發(fā)揮的作用也不同，這與植物所處的環(huán)境和必需的營養(yǎng)物質(zhì)等因素有關(guān)聯(lián)[1]?？v使蘭科內(nèi)生真菌資源豐富，并非全部的內(nèi)生真菌都能夠促進(jìn)蘭科植物的生長，少量的內(nèi)生真菌對蘭科植物組培苗具有致病性，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與接種內(nèi)生真菌時(shí)的數(shù)量、菌苗共生的培養(yǎng)基和植物生長發(fā)育各階段均有關(guān)系[17-18]，植物所需營養(yǎng)超值和內(nèi)生真菌菌絲的生長過于旺盛都會(huì)促使內(nèi)生真菌和組培苗共生的關(guān)系難以達(dá)到和諧[19]。五唇蘭、海南鉆喙蘭、大花蕙蘭和鐵皮石斛等蘭科植物的菌苗共生培養(yǎng)都是選擇DE 的培養(yǎng)基作為內(nèi)生真菌和組培苗共生的培養(yǎng)基[20-22]。

以改良的DE 培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，將從野生血葉蘭中分離出來的66 株內(nèi)生真菌與血葉蘭無菌苗進(jìn)行菌苗共生培養(yǎng)3 個(gè)月。結(jié)果顯示，在所有內(nèi)生真菌中僅有6 株內(nèi)生真菌在菌苗共生培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮一定的促進(jìn)作用，占總資源比率的11.00%；有大量的內(nèi)生真菌資源都會(huì)限制血葉蘭無菌苗的生長發(fā)育，使其生長狀態(tài)不佳，植株致死率高達(dá)89.00%。該實(shí)驗(yàn)初篩的有益內(nèi)生真菌6 株，其對血葉蘭組培苗的促生作用均有所不同。血葉蘭無菌苗的生根效果在G11 號內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)中較為明顯，組培苗根系最長；血葉蘭組培苗的鮮重在G9 號內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)中有所增加（55.01%），其株高（9.14cm）、莖粗（4.7mm）、根數(shù)（3.60 條）等生長發(fā)育指標(biāo)效果均顯著優(yōu)于其他菌株，原因可能是內(nèi)生真菌種類的多樣對血葉蘭無菌苗的促生機(jī)制也多樣。內(nèi)生真菌和金線蓮組培苗共生實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有5 株內(nèi)生真菌對金線蓮組培苗的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用，其中3 株內(nèi)生真菌分別為鐮刀菌屬、彎勁霉屬和曲霉屬[23]；而鐮刀菌屬、刺盤孢屬和鏈格孢屬等多是致病的內(nèi)生真菌。研究發(fā)現(xiàn)從野生蘭科植物中獲得的鐮刀菌對同科植物鐵皮石斛的種子萌發(fā)具有促進(jìn)效果[24]，說明并不是所有的鐮刀菌都會(huì)促使植物發(fā)病。鐮刀菌有致病鐮刀菌和非致病鐮刀菌之分[25]，而鐮刀菌屬具有一定刺激蘭科植物種子萌發(fā)的作用，也能控制作物的枯萎病[26-27]。綜上，說明蘭科植物的生長與鐮刀菌之間有著密切的關(guān)系。內(nèi)生真菌的有利條件與植物宿主之間存在著協(xié)同的作用。植物內(nèi)生真菌的豐富資源、維持機(jī)制和真菌與生態(tài)功能之間的關(guān)系需進(jìn)一步探索。