唐慧

貴州林業(yè)勘察設(shè)計(jì)有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550000

1 前言

1.1 淡紫擬青霉簡(jiǎn)介

淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus) 在Answorth（1973）系統(tǒng)中屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科擬青霉屬[1]。菌絲體發(fā)達(dá)，呈疏松棉絮狀，分生孢子直接從菌絲或分生孢子梗上產(chǎn)生，分生孢子梗不形成孢梗束或分生孢子座。至今該屬報(bào)道有近50 個(gè)種，皆為昆蟲病原菌和線蟲病原菌，是一些植物寄生線蟲的重要天敵，能寄生于卵，也能侵染幼蟲和雌蟲，可明顯減輕多種作物根結(jié)線蟲、孢囊線蟲、莖線蟲等植物線蟲病的危害。淡紫擬青霉廣泛分布于全世界各地，具有功效高、寄主廣、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)研究背景

松材線蟲病，即松樹(shù)萎蔫病，其病原為嗜木傘真滑刃線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)[2]，其傳播蔓延速度快、防治難度大，又被稱為松樹(shù)癌癥、無(wú)煙的森林火災(zāi)[3]。松材線蟲在世界廣泛分布，是繼榆枯萎病、板栗疫病、松針皰疹銹病之后的第四大森林病害，屬于特大毀滅性災(zāi)害，被列為森林病蟲害之首[4]，對(duì)森林資源以及經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，用淡紫擬青霉PT1 菌株的發(fā)酵液處理松材線蟲，其24h、48h、72h 的校正死亡率都高達(dá)100%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺松材線蟲的能力[5]。研究淡紫擬青霉PT1菌株的培養(yǎng)特性對(duì)研究防治松材線蟲有著重要的意義。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源

該實(shí)驗(yàn)所用淡紫擬青霉PT1 菌株來(lái)源于中國(guó)林科院微生物菌株平臺(tái)，前期試驗(yàn)證明其對(duì)松材線蟲殺蟲高效菌株。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

瓊脂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、酵母膏。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)器材

表1 試驗(yàn)所用儀器設(shè)備Tab.1 Instruments and Equipment Used in the Test

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 不同溫度對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響

用改良PDA 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基成分：馬鈴薯200g、水1000mL、瓊脂20g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g）培養(yǎng)淡紫擬青霉PT1 菌株。設(shè)置5 個(gè)溫度梯度，分別為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；每個(gè)溫度做5 個(gè)重復(fù)，重復(fù)3 次。在溫箱避光培養(yǎng)7d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每24h 測(cè)量1 次，并記錄測(cè)量的結(jié)果，比較各個(gè)溫度的菌落生長(zhǎng)狀況，篩選出使淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)狀況最好的溫度。

2.2.2 不同碳源對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響

以改良PDA 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配方同上。替換碳源，供試碳源有：麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇；每個(gè)碳源做5 個(gè)重復(fù)，重復(fù)3 次。在溫箱28℃避光培養(yǎng)7d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每24h 測(cè)量1次，并記錄測(cè)量結(jié)果，比較各個(gè)碳源的菌落生長(zhǎng)狀況，篩選出使淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)狀況最好的碳源。

2.2.3 不同氮源對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)影響

以改良PDA 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方同上。供試氮源有：蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、酵母膏；每個(gè)氮源做5 個(gè)重復(fù)，重復(fù)3 次。在溫箱28℃避光培養(yǎng)7d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每24h 測(cè)量1 次，并記錄測(cè)量的結(jié)果，比較各個(gè)氮源的菌落生長(zhǎng)狀況，篩選出使淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)狀況最好的氮源。

2.2.4 不同pH 對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)影響

以改良PDA 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)淡紫擬青霉PT1菌株，培養(yǎng)基配方同上。設(shè)置6 個(gè)pH 梯度，分別為pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9；每個(gè)pH 做5 個(gè)重復(fù)，重復(fù)3 次。在溫箱28℃避光培養(yǎng)7d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每24h 測(cè)量1 次，并記錄測(cè)量結(jié)果，比較各個(gè)pH 的菌落生長(zhǎng)狀況，篩選出淡紫擬青霉PT1菌株生長(zhǎng)狀況最好的pH。

2.2.5 淡紫擬青霉PT1 菌株菌落觀察

用改良PDA 培養(yǎng)基（配方同上）培養(yǎng)淡紫擬青霉PT1 菌株，溫箱28℃避光培養(yǎng)，每天觀察菌落的顏色、大小、質(zhì)地、形狀、紋路等，并記錄觀察結(jié)果，拍照。觀察7d，設(shè)置5 個(gè)重復(fù)。

2.2.6 淡紫擬青霉PT1 菌株產(chǎn)孢時(shí)間的觀察

用改良PDA 培養(yǎng)基（配方同上）培養(yǎng)淡紫擬青霉PT1 菌株；每天用接種針挑取少許菌絲置于滴有水滴的載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察是否有孢子的產(chǎn)生，并拍照，記錄產(chǎn)孢時(shí)間以及孢子的形態(tài)。

3 結(jié)果與分析

3.1 溫度對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)影響較大，溫箱避光培養(yǎng)7d 后，結(jié)果顯示：當(dāng)溫度為30℃時(shí)，淡紫擬青霉PT1 的菌落直徑較其他幾個(gè)溫度是最大的，其生長(zhǎng)到第7 天的菌落直徑為4.25cm，其次是20℃、25℃，其淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑分別為3.61cm、3.45cm，但溫度在35℃時(shí)，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑為1.82cm，是生長(zhǎng)狀況最差的。從圖1 的曲線圖可以看出，代表30℃的曲線最陡，表明淡紫擬青霉PT1 菌株在30℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)速度最快；代表35℃的曲線則特別平緩，菌株的生長(zhǎng)速度特別緩慢，幾乎沒(méi)怎么生長(zhǎng)。綜上所述，淡紫擬青霉PT1 菌株在30℃時(shí)，生長(zhǎng)狀況最好，在35℃時(shí)，生長(zhǎng)速度特別緩慢，在前6d，25℃的比20℃的生長(zhǎng)狀況要好，在第7 天時(shí)，20℃下培養(yǎng)的淡紫擬青霉PT1 菌株比25℃下培養(yǎng)的淡紫擬青霉PT1 菌株快，原因可能是由于25℃的溫箱在中途沒(méi)有關(guān)好門，導(dǎo)致溫箱內(nèi)實(shí)際溫度降低，不到25℃，導(dǎo)致生長(zhǎng)速度減緩，可能是20℃時(shí)，淡紫擬青霉PT1 菌株才開(kāi)始快速生長(zhǎng)，具體原因有待繼續(xù)研究。

圖1 不同溫度菌株生長(zhǎng)直徑隨時(shí)間變化Fig.1 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains at Different Temperatures with Time

3.2 碳源對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響

在葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、淀粉這6 種碳源中，菌株均可生長(zhǎng)（圖2）。由于淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)緩慢，所以當(dāng)菌株生長(zhǎng)到第7 天時(shí)仍未長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。28℃溫箱培養(yǎng)7d 后，不同碳源的培養(yǎng)基上的淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)情況不同。由圖2 可以看出，當(dāng)?shù)蠑M青霉PT1 菌株生長(zhǎng)到第7天時(shí)，由蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑為最大，菌落的最大直徑為4.78cm；由葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑是相對(duì)最小的，培養(yǎng)到第7 天的菌落直徑為3.35cm。由圖2 的曲線圖可以看出，代表蔗糖的曲線較陡，則說(shuō)明在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)速度較其他碳源快；而代表葡萄糖的曲線比較平緩，則說(shuō)明在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)較其他碳源緩慢。綜上所述，在供試的6 種碳源中，最適合淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的碳源是蔗糖，不適合淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖。

圖2 不同碳源菌株生長(zhǎng)直徑隨時(shí)間變化Fig.2 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains with Different Carbon Sources with Time

3.3 氮源對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響

菌株在供試氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)（圖3）。不同氮源對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響較大，28℃下培養(yǎng)7d 后，不同氮源培養(yǎng)基上的淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)差異較明顯。由圖3 可以看出，在氮源為牛肉膏的培養(yǎng)基上淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)最好，菌落直徑為4.47cm；其次為以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上淡紫擬青霉PT1 菌株，菌落直徑為3.98cm；以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上淡紫擬青霉PT1 菌株，菌落直徑為3.80cm；直徑最小的是以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的淡紫擬青霉PT1 菌株，其菌落直徑為2.95cm。由圖3 可以看出，牛肉膏的曲線較陡，說(shuō)明淡紫擬青霉PT1 菌株在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度較其他氮源快；代表硫酸銨的曲線明顯比較平緩，則說(shuō)明淡紫擬青霉PT1 菌株在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較緩慢。綜上所述，在供試4 種氮源中，淡紫擬青霉PT1 菌株在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況是最好，而在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)狀況是4 種氮源中最差的。

圖3 不同氮源菌株生長(zhǎng)隨時(shí)間變化直徑Fig.3 Diameter Diagram of Growth of Strains with Different Nitrogen Sources with Time

3.4 pH 對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響

菌株在試驗(yàn)所設(shè)置的pH 范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)（圖4）。不同的pH 對(duì)淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的影響各不相同。由圖4 的柱狀圖可以看出，當(dāng)pH 為8 時(shí)，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑是最大，菌落直徑為4.25cm；其次是pH 為7 時(shí)，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落直徑，其菌落直徑為4.23cm，兩者相差不大。但pH 為4 時(shí)，淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落生長(zhǎng)情況最不理想，其菌落直徑在第7 天時(shí)為2.48cm。由圖4可以看出，代表pH4 的曲線較平緩，說(shuō)明淡紫擬青霉在pH 為4 的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況不好；代表pH8 的曲線比較直且陡，說(shuō)明在pH 為8 的培養(yǎng)基上淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)速度較均勻且較快；pH 為7 的培養(yǎng)基的在第3 天到第6 天時(shí)，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)狀況比pH 為8 時(shí)的要好，但pH7 的生長(zhǎng)速度不均勻，第6 天到第7 天時(shí)生長(zhǎng)速度有所下降；代表pH9 曲線比較直，說(shuō)明在pH 為9 的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)速度比較均勻。綜上所述，淡紫擬青霉PT1 菌株適合在偏堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度較快，不適合在偏酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)的最適pH 范圍為7～8。

圖4 不同pH 菌株生長(zhǎng)隨時(shí)間變化直徑Fig.4 Diameter Diagram of Growth of Strains with Different pH Values Changing with Time

圖5 淡紫擬青霉PT1 培養(yǎng)形態(tài)Fig.5 Culture Morphology of Paecilomyces lilacinus PT1

3.5 淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落形態(tài)觀察

用改良PDA 培養(yǎng)淡紫擬青霉PT1 菌株，28℃避光培養(yǎng)，每天用肉眼觀察淡紫擬青霉PT1 菌株的菌落形態(tài)，觀察發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉PT1 菌株起初菌落顏色為白色，菌絲呈放射狀向四周均勻擴(kuò)散，因此其菌落形狀為均勻的圓形，菌落質(zhì)地呈疏松棉絮狀，淡紫擬青霉PT1 菌株的生長(zhǎng)速度較緩慢，所以培養(yǎng)10d后仍然沒(méi)有長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。在淡紫擬青霉PT1 菌株長(zhǎng)到20d 左右時(shí)，菌落顏色開(kāi)始變化從白色變?yōu)榈仙?，逐漸長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

3.6 淡紫擬青霉PT1 菌株產(chǎn)孢時(shí)間的觀察

用改良PDA 培養(yǎng)淡紫擬青霉PT1 菌株，28℃避光培養(yǎng)。每天在超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種針挑取少許菌絲在滴了水的載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)顯微鏡下用40 倍鏡觀察孢子。在培養(yǎng)到4d 時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察到有孢子的產(chǎn)生，有的分生孢子直接著生于菌絲上，有的分生孢子著生于分生孢子梗上，在顯微鏡下觀察到菌絲接近透明，分生孢子透明，近圓形，分生孢子梗較粗壯。產(chǎn)生分生孢子時(shí)的菌落形態(tài)如圖6，分生孢子如圖7。

圖6 產(chǎn)生分生孢子時(shí)的菌落形態(tài)（第4 天）Fig.6 Colonial Morphology of ConidiaGermination(4th days)

圖7 分生孢子形態(tài)Fig.7 Conidia Morphology

4 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)研究了淡紫擬青霉PT1 菌株培養(yǎng)特性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，能使淡紫擬青霉PT1 菌株生長(zhǎng)的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH 為7～8，淡紫擬青霉PT1 菌株初期沒(méi)有長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)的菌落顏色為白色，培養(yǎng)20d左右，菌落也逐漸長(zhǎng)滿了培養(yǎng)皿，菌落顏色也從白色變?yōu)榈仙?，菌絲呈放射狀向四周擴(kuò)散，菌落現(xiàn)狀為圓形，菌落質(zhì)地為疏松棉絮狀，其分生孢子無(wú)色近圓形，直接著生在菌絲上，或者著生在分生孢子梗上，淡紫擬青霉PT1 菌株在35℃時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度及其緩慢，在偏堿性的環(huán)境下生長(zhǎng)較好。李芳等人[6]也對(duì)淡紫擬青霉的培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示淡紫擬青霉NH-PL-03 菌株在發(fā)酵過(guò)程中，pH 是相對(duì)穩(wěn)定的，在快速生長(zhǎng)時(shí)pH 下降，在培養(yǎng)到第7天至第9 天時(shí)，pH 回升，并且維持在6～7，碳源的消耗量隨著菌絲生長(zhǎng)液在逐漸增加。彭鑫等人[7]對(duì)玫煙色擬青霉QH-4 的形態(tài)特征，分生孢子的萌發(fā)環(huán)境條件進(jìn)行了研究，研究結(jié)果顯示其分生孢子在可萌發(fā)的pH 范圍較大，在pH5～pH11 條件下都可萌發(fā)，但偏酸或者偏堿都會(huì)導(dǎo)致其萌發(fā)率降低，其分生孢子萌發(fā)的最適溫度范圍為25℃～27℃，生長(zhǎng)條件較寬松與淡紫擬青霉PT1 菌株相比，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的酸堿度和溫度的要求不高。夏振遠(yuǎn)等人[8]采用正交試驗(yàn)研究了淡紫擬青霉IPC 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)適當(dāng)增加通氣量，pH 控制在5～6，溫度控制在29℃更適合淡紫擬青霉IPC 菌株液體的深層發(fā)酵，該研究還發(fā)現(xiàn)了適合淡紫擬青霉IPC 菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基的配方，蔗糖+ 黃豆粉+0.005g/L FeSO4·7H2O+0.008g/L MnSO4+0.002g/L H3BO3+0.005g/L ZnSO4+0.004g/L CuSO4+ 0.004g/L Na2MoO4+0.002g/L CoCl2+0.04g/L 肌醇為最佳培養(yǎng)基配方，其最佳生長(zhǎng)碳源和淡紫擬青霉PT1 菌株一樣，也為蔗糖。周靖等人[9]則以查實(shí)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用正交試驗(yàn)研究淡紫擬青霉的培養(yǎng)條件，其研究結(jié)果顯示，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸銨，最佳pH 范圍為5～6，最佳溫度為30℃，與淡紫擬青霉PT1 菌株的最佳碳源和最佳溫度是相同的。大量的研究顯示，淡紫擬青霉對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果好，而淡紫擬青霉防治松材線蟲的研究少之又少，而有研究發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉對(duì)松材線蟲也有較高的防治作用[5]，所以研究淡紫擬青霉PT1 菌株的培養(yǎng)特性對(duì)防治松材線蟲有促進(jìn)作用，也是該實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)的不足之處在于研究的不夠深入，碳氮源的種類較少，可采用正交實(shí)驗(yàn)研究適合淡紫擬青霉PT1 生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基。