李東炎,姜智雯,劉 新

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科,吉林 長春130033)

口腔惡性腫瘤是一種侵襲性癌癥。早期可能出現(xiàn)廣泛性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,主要發(fā)生在40～60歲的嗜煙嗜酒患者中?？谇粣盒阅[瘤作為頭頸部腫瘤最常見的種類之一,其發(fā)病率占全身惡性腫瘤發(fā)病率的8.2%～9.9%。而在口腔惡性腫瘤中,口腔鱗狀細胞癌發(fā)生率占90%以上[1]。早期發(fā)現(xiàn)的口腔鱗狀細胞癌變(OSCC)患者的平均5年總生存率高達的80%,而晚期的OSCC病人的平均5年總生存率則維持在20%～40%之間[2]。因此,口腔癌嚴重的威脅著人們的生命健康,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療才是應對口腔癌的根本之策,提高患者生存率及延長患者壽命的關(guān)鍵。目前,臨床治療中口腔病損組織活檢為診斷口腔癌的“金標準”,然而病理活檢屬于有創(chuàng)性操作,部分患者依從性較差。因此,作為非侵入性、無創(chuàng)的液體活檢越來越被患者認可,其針對液體中的生物標志物進行檢測,可提示不同疾病的發(fā)生[3]。從最初的血液液體活檢到現(xiàn)在逐漸發(fā)展至對于唾液、尿液、腦脊液等的深入研究。對比其他體液,唾液具有更易獲取、檢測價格低廉及無創(chuàng)操作等優(yōu)點,使得患者依從性更好。

唾液作為人體三大體液之一,是由口腔唾液腺分泌的一種液體,分泌唾液的腺體包括頜下腺、腮腺、舌下腺以及其他小唾液腺。分泌唾液量由多至少分別為:下頜下腺60%,腮腺占25%,而小唾液腺則占5%～10%,舌下腺占5%。唾液不僅可以提供多種基因信息,還可以提供有關(guān)人體內(nèi)微生物、局部組織以及其他部位感染病毒的RNA和DNA。雖然唾液檢測具有獲取方便、非創(chuàng)傷性、受試者基本無不適反應以及安全性高等優(yōu)點,但是在對全唾液樣本進行檢測時發(fā)現(xiàn)唾液成分易受采集方式、晝夜差異等影響,從而導致唾液樣本被污染或者發(fā)生變性,以及存在其他蛋白質(zhì)被蛋白酶干擾其降解過程的情況[4]。研究發(fā)現(xiàn),唾液外泌體相對于唾液中的蛋白質(zhì)和RNA具有更好的穩(wěn)定性,能有效解決上述問題。因此,近年來有大量關(guān)于將唾液外泌體作為早期診斷口腔惡性腫瘤的生物標志物的研究,本文僅對此研究進行綜述。

1 唾液外泌體的組成和生物學特征

外泌體(exosomes)最先在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn),是由多種類型細胞主動分泌的30-150 nm囊泡狀小體,屬于細胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)系統(tǒng)。電鏡下觀察外泌體由磷脂雙分子層包裹,其內(nèi)容物多為可進行信息傳導的蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和脂類分子等[5]。外泌體轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)分子以達成細胞間通信的作用,發(fā)揮了促進血管新生、調(diào)控細胞凋亡、抗腫瘤免疫應答及抗原提呈等生理功能。根據(jù)趙澤亮等[6]的研究表明,EV與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),它可以介導腫瘤微環(huán)境與其腫瘤細胞之間發(fā)生雙向串擾,即EV可以參與修飾內(nèi)容物促進腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移。

唾液外泌體很大程度上兼具外泌體的特質(zhì)[7],雙層脂質(zhì)膜保護內(nèi)部的生物活性物質(zhì):蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等。蛋白質(zhì)是唾液外泌體最主要的組成部分,其中包括位于外泌體表面用于維持外泌體結(jié)構(gòu)的,如:微管蛋白、肌動蛋白、微絲結(jié)合蛋白等;用于膜蛋白標志物的,如:四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81等)、水通道蛋白(AQP5)等;用于膜融合及物質(zhì)轉(zhuǎn)運的,如:膜連蛋白、脂筏特征蛋白等[8]。除了蛋白質(zhì),唾液外泌體中還攜帶發(fā)揮生物效應的核酸,如:miRNA、mRNA、circRNA及piRNA等[9]。含量較少的脂質(zhì)分子在唾液外泌體中也起到重要作用,例如膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂和卵磷脂參與維持外泌體的形態(tài),還可以抑制信號通路引起細胞凋亡[10]。因此,探究唾液外泌體中各類分子濃度水平的變化與口腔惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系,可能對早期預測、診斷口腔惡性腫瘤帶來指導意義。

2 唾液外泌體的分離提取

為了探究唾液外泌體與早期診斷口腔惡性腫瘤的相關(guān)性,需要以提取高純度唾液外泌體為前提。目前,研究人員常用的分離提取方法包括:超速離心法、親和法和超濾法等。由于不同方法的技術(shù)特性和不同的應用場景,可能導致分離出的唾液外泌體純度差異。根據(jù)TANG等[11]的研究發(fā)現(xiàn),針對同一類標本采取不同的分離提取方式得到有共同交集的miRNA588個,還有200個miRNA僅在各自提取方式中存在,證實了不同分離提取方案所得到的外泌體純度有差異。

傳統(tǒng)的超速離心法經(jīng)過不斷改進,現(xiàn)已成為超80%研究人員首選的分離方式[12]。超速離心法因無需考慮分離試劑的污染,獲取所需樣本量多,方法相對成熟,常受到研究人員青睞。然而超速離心法易造成唾液外泌體結(jié)塊,甚至有可能導致唾液外泌體損傷破壞。ZERINGER等[13]研究發(fā)現(xiàn),離心時間與所獲得的外泌體量呈正相關(guān),但當離心時間超過4小時,會明顯增加可溶性蛋白質(zhì)雜質(zhì)。親和法利用外泌體表面特有的抗原,研究人員通常選擇外膜表面含量高的蛋白以固相抗體吸附外泌體表面抗原,從而提取出外泌體。這種方式理論上講最具有特異性,可以通過不同種類的抗體對不同來源的外泌體表面抗原進行篩選。相比于超速離心法,親和法需要的樣本量為超速離心法樣本量1/6,而實驗時間僅為其1/16[14]。然而,分離出的外泌體生理學功能是否會被固相抗體影響,至今仍未有定論。相比上述兩種方法,超濾法具有更加簡單快速的優(yōu)勢。超濾法使用不同膜孔大小的超細納米膜來分離外泌體,漏過小直徑微小囊泡,截留大直徑粒子。這種方式在處理大量樣本時優(yōu)勢更加明顯,可以設(shè)計不同口徑的納米膜來分選不同來源的外泌體。但是,外泌體通過膜孔時的切割壓迫損傷不可避免,為此研究人員設(shè)計切向流過濾法改善外泌體損傷[15]。相比于其他研究項目,對于外泌體研究的首要之處是提取穩(wěn)定、高純度的外泌體,但目前尚無一種方式可以兼具高純度分離提純并且適用于多種應用場合,外泌體的分離提取流程仍然需要進一步完善[16]。

3 唾液外泌體早期診斷OSCC

3.1 唾液外泌體中的mRNA

外泌體是一種重要的生物學特征,它們可以存在于唾液中,并且通過其雙層結(jié)構(gòu),可以有效地保護外分泌體的內(nèi)部物質(zhì),從而降低唾液的復雜性,為臨床醫(yī)生提供更加精準、穩(wěn)定的診斷信息,從而有助于早期發(fā)現(xiàn)癌癥。隨著時間的推移,越來越多的科學家們開始重視唾液外分泌體的研究,并將它們視為一種理想的生物標志物[17]。研究唾液外泌體可以為口腔癌的早期診斷提供新的見解,并且具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。mRNA包含了宿主和口腔微生物的基因表達信息,可以用來診斷疾病。盡管僅僅占細胞總RNA的2%～5%一小部分,但它們的種類繁多,代謝活性強,可以反映機體的生理和病理狀態(tài)[18]。多項研究證明,mRNA可作為穩(wěn)定分子存在于唾液中[19],用超速離心法提取分離全唾液的外泌體,微陣列分 析顯示,509 個 mRNA 核心轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對穩(wěn)定地存在于外泌體中。外泌體不僅可以保護 RNA 在體外不被酶降解,還能夠作為載體將 RNA 運送到靶細胞中,發(fā)揮特定的作用。在實驗室環(huán)境中,熒光標記的唾液外泌體能夠與口腔角質(zhì)細胞進行交流,從而將其中的遺傳特征和功能轉(zhuǎn)錄至角質(zhì)細胞,從而影響其基因表達水平[20]。mRNA 在唾液外泌體中的表達可以用于診斷疾病,這是一個重要的發(fā)現(xiàn)。

3.2 唾液外泌體中的miRNA

miRNA是一種無編碼蛋白質(zhì),它通過降解或抑制特定基因的信使mRNA,來調(diào)控基因表達,從而實現(xiàn)基因表達的調(diào)控。它是一種短鏈RNA,由內(nèi)源性基因編碼,具有重要的生物學功能[21]。最新研究顯示,癌細胞有能力通過特異性地將特定的 miRNA 封裝到外泌體,從而實現(xiàn)對腫瘤的有效抑制和促進其生長的作用[22]。外泌體中的 miRNA 表達模式與腫瘤組織中的表達模式更為接近,因此,將其作為生物標志物具有更高的可靠性,可以更有效地指示腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[23]。GAI等[24]通過荷沉淀技術(shù)分離唾液細胞外囊泡,通過芯片技術(shù)和qRT-PCR檢測miRNA的差異表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,miR-512-3P和miR-412-3p 在OSCC患者唾液EV中上調(diào),ROC曲線表明二者對OSCC診斷具有較好的鑒別能力,可能作為潛在的生物標志物。張學武等[25]驗證外泌體miR-512-3p通過下調(diào)Gas2促進TSCC細胞增殖。COON等[26]研究證實 miR-365在細胞外泌體或細胞外囊泡的存在,且 miR-365 很可能成為口腔鱗狀細胞癌外泌體中的潛在生物標志物。唾液外泌體miR-24-3p是一種潛在的新型OSCC診斷生物標志物,HE等[27]報道m(xù)iR-24-3p可通過靶向PER1維持OSCC細胞增殖,ROC曲線分析AUC 為0.738(95%CI:0.589～0.886,P=0.02)、敏感性和特異性分別為64.4%和80.0%,對OSCC也有較好的鑒別能力。

3.3 唾液外泌體中的DNA

與外泌體中大量的 RNA相比,一些研究人員開始關(guān)注基因組 DNA 和線粒體 DNA(mtDNA),這些研究的優(yōu)勢在于,它們與腫瘤細胞的DNA 具有高度一致性,這表明外泌體DNA可以作為一種有效的生物標志物,用于檢測致癌性突變。

唾液外泌體存在的DNA是循環(huán)腫瘤DNA(cir-culating tumor DNA,ctDNA),ctDNA 是一種由腫瘤細胞產(chǎn)生的游離 DNA,它來源于凋亡的腫瘤細胞、壞死的腫瘤細胞以及它們的外排物,這些DNA 攜帶著腫瘤特有的突變,并且可以被循環(huán)系統(tǒng)有效地利用[28]。ctDNA不僅存在血液中,也存在于其他體液中如唾液中,唾液基因組分析,ctDNA70%來自宿主,30%來自口腔微生物群[29],可用于液體活檢。通過唾液腺超濾、被動擴散或主動轉(zhuǎn)運,ctDNA可以從局部部位進入血液,攜帶原發(fā)腫瘤的信息[30-31],由于稀釋和污染較小,唾液ctDNA的分析比血液中結(jié)果更具敏感性[32]。WANG等[33]在一項研究中提出在早期口腔癌唾液中檢測ctDNA的敏感性為100%。

3.4 唾液外泌體中的蛋白質(zhì)

研究發(fā)現(xiàn),患口腔惡性腫瘤者的唾液外泌體不管從尺寸或是數(shù)量上來說,都要遠遠高出正常人的唾液外泌體,患者的唾液外泌體可通過簡化細胞間信息傳導過程來促進腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[34]。Zlotogorski等[35]人研究發(fā)現(xiàn)口腔惡性腫瘤患者的唾液外泌體中CD63含量增高,而CD9和CD81的含量顯著降低。在細胞粘附和調(diào)節(jié)細胞運動功能中,CD9和CD81起到了重要作用,其含量降低可促進腫瘤細胞的遷移,與EV促進腫瘤細胞增殖、遷移學說相符合。

在2015年,Winck等[36]研究人員首次對口腔惡性腫瘤患者和正常人的唾液外泌體進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。在納入檢測的381種蛋白質(zhì)種,發(fā)現(xiàn)8種蛋白質(zhì)在對照組和病例組中有明顯差異,證實唾液外泌體中的蛋白質(zhì)可以作為口腔惡性腫瘤的生物標志物。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,唾液外泌體可以作為早期診斷口腔惡性腫瘤的生物標志物之一,也對口腔惡性腫瘤的治療有一定指導意義。相比于其他液體活檢,唾液收集有著諸多優(yōu)勢,例如:收集簡單、患者幾乎無痛苦、保存簡便、安全可靠,而且還帶有豐富的生物學信息。通過近年的相關(guān)研究,人們在唾液外泌體中發(fā)現(xiàn)了很多與口腔惡性腫瘤有關(guān)的生物學標志物,例如:mRNA、miRNA、DNA和蛋白質(zhì)等,這對于早期診斷口腔惡性腫瘤有著重大意義。目前仍需解決的問題是,如何分離提取高純度、穩(wěn)定性高的唾液外泌體,用以深入研究方便推廣臨床應用。相信隨著唾液外泌體的生物學標志物功能越來越被重視,唾液外泌體研究逐漸完善與發(fā)展,與其相關(guān)的疾病也會得到更為系統(tǒng)化的診治,為廣大患者帶來福音。