張延赤,王 旭,吳秀麗,袁久彤,馬英偉,王利武,李明輝,高福紅,李丹丹,張 遠,孫利偉

(長春市兒童醫(yī)院,吉林 長春130061)

言語語言障礙(speech and languge disorders,SLD)是兒童時期常見的發(fā)育障礙性疾病之一[1]。言語是指人們經口發(fā)聲表達思維活動和意愿的語言實踐;語言是人類社會共同使用的代碼,同思維有密切的聯系,是人類形成和表達思想的手段,也是人類社會最基本的信息載體。言語障礙指言語發(fā)育偏離正常順序,出現語言感受、表達或應用困難[2]。兒童中有3%～6%存在語言障礙[3]。SLD 給社會、家庭和個人造成極大的精神和經濟負擔;倍受社會和家長的關注。近年有關維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)對神經精神疾病關聯的報道較多[4-6],但是,VDR基因SNP多態(tài)性與兒童SLD 的關系罕見報道。本文對來我院就診的488例SLD兒童進行VDR FokI (rs2228570)、BsmI(rs 1544410)、 ApaI(rs 7975232)和TaqI(rs 731236)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNPs)檢測和分析;并與健康體檢兒童進行對照。

1 對象與方法

1.1 研究對象及標本采集

觀察組為2021年7月—12月在我院康復科、心理科和神經內科以SLD就診的488例兒童。康復科、心理科采集口腔頰粘膜脫落細胞;神經內科患兒留取末梢血標本。對照組為同期來院健康體檢兒童,在向患兒家長告知,取得家長同意并簽署知情同意書后留取口腔頰粘膜脫落細胞標本。

1.1.1納入標準 ①語言發(fā)育遲緩,兒童語言發(fā)育遵循正常順序,未達到與其年齡相應的水平,表現為年幼兒童的語言特征。包括智力發(fā)育遲緩、特發(fā)性語言障礙、行為障礙和環(huán)境因素。②語言障礙,語言發(fā)育偏離了正常順序,存在表達性語言、感受性語言或應用性語言方面的困難。

1.1.2排除標準 ①重度精神發(fā)育遲滯;②腦外傷、腦腫瘤等獲得性SLD。

1.2 研究方法

1.2.1基因組DNA提取 口腔脫落細胞拭子DNA 提取,應用 Tiangen Biotech 公司微量樣品基因組DNA提取試劑盒,按試劑說明書提取棉拭子樣本基因組DNA;血液樣本,應用Tiangen Biotech公司血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒,按說明書提取血清樣本基因組DNA。

1.2.2SNP 位點選擇 在PubMed中檢索VDR基因多態(tài)性位點的文獻,應用haploview軟件檢索VDR常見基因標簽,并且考慮功能位置的基因,在VDR基因外顯子和內含子區(qū)各選取2個基因標簽,分別為外顯子區(qū)Fok I(rs2228570)和Taq I(rs731236;內含子區(qū)Bsm I(rs1544410)和Apa I(rs7975232)。多態(tài)性位點信息及引物序列見表1。

表1 言語語言障礙伴隨其他臨床診斷(例數)

1.2.3聚合酶連反應(PCR) DNA 擴增試劑為南京諾唯贊生物科技有限公司產品。反應體系包括:2 × Phanta Max Master Mix 12.5 μl,上下游引物[Forward Primer、Reverse Primer(10 μM)]各1 μl,模板(Template)1 μl,加超純水(ddH2O)補足25 μl。反應條件:95℃預變性3 min;95℃變性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸15sec,共計35個循環(huán);72℃保溫5 min。擴增產物大小分別為:675 bp、608 bp、405 bp和608 bp。

1.2.4PCR擴增產物回收 PCR擴增產物,經1.5%瓊脂糖凝膠電泳;電泳目的條帶用美國Omega Bio-tek公司核酸純化試劑盒(Gel Extracttion Kit)回收正確的PCR產物。

1.2.5測序 委托吉林省庫美公司完成。應用PCR擴增的上游引物,在ABI 3730XL測序儀進行測序分析。

1.3 統計分析

應用SPSS25.0軟件進行統計分析。計數資料進行卡方檢驗,計量資料進行t檢驗。應用卡方檢驗分析VDR SNP位點基因型、等位基因頻率,P<0.05為差異有統計學意義。應用卡方檢驗分析判斷哈迪溫伯格(Hardy-Weinberg,H-W)平衡;P>0.05為H-W平衡。

2 結果

2.1 一般狀況

本文觀察組納入488例SLD患兒,其中男性346例,女性142例,男女之比為2.44∶1。健康對照116,男性56例,女性60例,男女之比為1∶1.07。觀察組男性明顯多于女性,存在明顯差異,經卡方檢驗有統計學意義(χ2=23.387,P=0.000)。觀察組平均年齡為(63.14±37.57)月齡,對照組年齡為(61.09±30.69)月齡,兩組比較年齡無明顯差異(t=0.539,P=0.590)。觀察組和對照組VDR基因多態(tài)性基因型、等位基因頻率均符合Hardy-Weinbeig平衡,卡方檢驗P>0.05。

2.2 臨床診斷

488例患兒均表現為SLD。臨床診斷語言發(fā)育遲緩84例(17.21%),特發(fā)性SLD 228例(46.72%);240例(49.18%)患兒SLD伴有其他疾病,具體臨床診斷見表1。

2.3 VDR 基因多態(tài)性SNP分布

2.3.1VDR基因BsmI、ApaI 、TaqI和FokI區(qū),rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位點SNP多態(tài)性,PCR產物測序,核酸序列峰圖,見圖1。

圖1 VDR SNP測序峰圖

2.3.2VDR基因及等位基因頻率 488例SLD患兒BsmI、ApaI 、TaqI和FokI區(qū),rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位點SNP多態(tài)性分布,基因型分布,見表2;等位基因分布,見表3。觀察組和對照組比較ApaI和FokI區(qū)rs 7975232和rs2228570位點基因型和等位基因分布存在明顯差異;BsmI和TaqI區(qū)rs 1544410和rs 731236位點基因型和等位基因分布無差異。

表2 VDR基因rs7975232、rs2228570、rs1544410和rs731236位點基因型分布(例數)

表3 VDR基因rs 7975232、rs 2228570、rs 1544410和rs731236位點等位基因分布(例數)

2.3.3不同SLD VDR基因rs 7975232和rs2228570位點SNP分布 將488例觀察組按疾病種類分4組,觀察組1為單純語言發(fā)育落后,患兒20例;觀察組2為特發(fā)性SLD組,患兒228例;觀察組3為心理障礙伴SLD,患兒114例;觀察組4為神經系統疾病伴SLD,患兒126例。4組患兒ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)基因型及等位基因頻率見表4、表5。ApaI(rs 7975232)基因型,與對照組比較,觀察組1無差異;其他3組存在明顯差異;FokI(rs2228570)基因型,與對照組比較,4個觀察組均存在明顯差異。ApaI(rs 7975232)等位基因分布,與對照組比較,觀察組3存在明顯差異;FokI(rs2228570)等位基因分布,與對照組比較,觀察組1-4均存在差異,經卡方檢驗有統計學意義。

表4 VDR基因ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)位點基因型分布(例數)

表5 VDR基因ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)位點等位基因分布(例數)

2.4 VDR基因多態(tài)性與SLD的相關性

2.4.1ApaI(rs 7975232)多態(tài)性與SLD的相關性 在ApaI區(qū)rs 7975232位點基因型GA較GG/AA發(fā)生SLD的風險高,OR=2.246,95% CI(1.440～3.502)。G等位基因發(fā)生SLD的風險高,OR=1.461,95% CI(1.027～2.078)。

2.4.2FokI(rs2228570)多態(tài)性與SLD的相關性 在FokI區(qū),rs2228570位點,基因型GA較GG/AA發(fā)生SLD的風險高,OR=3.068,95% CI為(1.968～4.785)。G等位基因發(fā)生SLD的風險高,OR=1.649,95% CI為(1.234～2.204)。

3 討論

語言是人類高級神經系統活動的一種形式,兒童自出生起便開始學習語言,語言發(fā)展的歷程是非常復雜的過程。語言發(fā)育影響因素包括:遺傳學因素、語言學因素、生理學因素、社會學因素。語言在人們認知社會和發(fā)揮社會功能中具有重要作用。SLD是遺傳與環(huán)境交互作用的結果,具有復雜遺傳模式的多因素起源[7]。

近年,大量的研究證實VDR基因多態(tài)性與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[8-10]。VDR為親核蛋白,在神經元細胞和神經膠質細胞中有較多表達,屬于超家族成員。VDR 經配體 1α,25(OH)2D3 激活后發(fā)揮核受體作用[11]。維生素D的許多生物學功能都是通過VDR介導調節(jié)靶基因轉錄來實現。研究發(fā)現:維生素D在大腦發(fā)育、神經傳遞、神經保護和免疫調節(jié)中起著關鍵作用;VDR存在于發(fā)育中和成年的大腦中,介導維生素D對大腦發(fā)育和功能的影響[12]。動物實驗發(fā)現VDR在胚胎第12天就在大腦中出現,第15天到第23天,VDR蛋白和mRNA的表達普遍增加,并且在大腦各個區(qū)域廣泛分布[13]。提示VDR在腦發(fā)育和語言發(fā)育中起重要作用。本文首次對SLD患兒VDR基因SNP多態(tài)性進行檢測及分析,探討發(fā)生SLD的遺傳因素,為有效預防SLD提供科學依據。

VDR的變異可能在每個人群所發(fā)揮的作用不同,VDR這些多態(tài)性可能影響其活性和功能。本研究對488例SLD患兒檢測并分析VDR基因BsmI、ApaI 、TaqI和FokI區(qū),rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位點SNP多態(tài)性。發(fā)現ApaI(rs 7975232,G→A)和FokI(rs2228570,A→G)與SLD發(fā)生相關;rs 7975232 G/A基因型,rs2228570 A/G 基因型發(fā)生SLD風險高;rs 7975232 G和rs2228570 G等位基因是發(fā)生SLD的危險因素;BsmI區(qū)rs 1544410位點和TaqI區(qū)rs 7975232位點與SLD無關。Can MS等研究發(fā)現Fok I 多態(tài)性與抑郁癥發(fā)生無相關性[14]。Taq I 位點的 T 等位基因以及 Apa I 位點的 a 等位基因與自閉癥發(fā)生率降低相關[15]。

國內外研究均顯示SLD的發(fā)病率存在性別差異。本研究男性明顯多于女性,男女之比為2.44∶1。瑞典Schachinger-Lorentzon U的相關研究,男女之比為2∶1[7],周浩相關研究男女之比為4.42∶1[1]。提示人們對于男性嬰幼兒,應加強言語交流,注重語言發(fā)育情況,及時發(fā)現問題及時進行相應的檢查和治療。

兒童SLD種類多,發(fā)生原因復雜。早期明確病因,及時有效干預,對于早期治愈和改善預后有積極意義。本文語言發(fā)育遲緩17.21%(84/488),特發(fā)性SLD 46.72%(228/488);接近陳煒報道特發(fā)性SLD比率46.90%[16],低于周浩報道的54.37%[1]。智力發(fā)育落后或障礙4.92%(24/488);本研究心理疾病伴SLD 占比為23.36%(114/488),神經系統疾病伴SLD患兒占比為25.82%(126/488)。對于以SLD就診的兒童首先要明確病因,根據病因進行相應的治療,可避免貽誤病情,取得最佳療效和改善預后。